Kitosaaninanohiukkasten kehittäminen stabiiliksi Lääkeannostelujärjestelmäksi proteiinille / sirnalle

Abstrakti

Kitosaaninanohiukkasilla (CS NPS) on hyvät fysikaalis-kemialliset ominaisuudet lääkeaineiden annostelujärjestelminä. Tämän tutkimuksen tavoitteena on määrittää CS NPs: n fysikaalisia ominaisuuksia ja kolloidista stabiilisuutta koskevien preparatiivisten parametrien modulaatio. CS NPs: t valmistettiin ionisella interaktiolla dekstraanisulfaatin (DS) kanssa ennen niiden varastointistabiilisuuden määrittämistä. Pienimmät nm : n CS NPS : t, joiden pintavaraus on MV, saatiin aikaan, kun cs ja DS sekoitettiin pH 4: ssä ja DS: CS-massasuhteella 0,5: 1. 98%: n ansatehokkuus saavutettiin, kun BSA/siRNA lastattiin nanohiukkasiin. Tulokset osoittivat myös, että CS NPS: n partikkelikoko ja pintavaraus muuttuivat hieman 2 viikkoon asti, kun niitä säilytettiin 4°C: ssa.suurempi partikkelikoko ja pintavaraus saatiin DS: n pitoisuutta lisäämällä. Yhteenvetona voidaan todeta, että NPs oli riittävän stabiili, kun sitä pidettiin 4°C: ssa, ja se kykeni kuljettamaan ja suojaamaan proteiinia.

1. Johdanto

endogeeniset peptidit, proteiini ja oligonukleotidit ovat tärkeimpiä lääkkeitä, jotka herättävät paljon huomiota, koska niillä on suuret mahdollisuudet kroonisten sairauksien hoidossa . Ihmiskehon äärimmäinen in vivo-ympäristö on kuitenkin aina rajoittanut näiden aineiden terapeuttista käyttöä . Polymeeriset nanohiukkaset ovat herättäneet paljon huomiota jakelujärjestelminä, koska ne kykenevät voittamaan fysiologiset esteet ja suojaamaan ja kohdistamaan kuormitettuja aineita tiettyihin soluihin . Luonnossa esiintyvien polymeerien kuten kitosaanin (CS) on tutkittu muodostavan nanohiukkasia . CS on biohajoava polysakkaridi, ja se on peräisin kitiinin deasetylaatiosta . Bioyhteensopivuuden lisäksi alhainen myrkyllisyys, hemostaattiset ja bakteriostaattiset ominaisuudet vaikuttavat myös sen erilaisiin sovelluksiin farmaseuttisella alalla . Useiden anionien on tutkittu yhdistävän CS: ää, kuten natriumsulfaattia ja dekstraanisulfaattia (DS) . DS pystyy muokkaamaan proteiinin ja siRNA entrapment efficiency (ee) – tehoa ilman kovetusaineita ja säätelemään lääkeaineen vapautumisnopeutta korkean varaustiheytensä vuoksi . Sen lisäksi , että DS on halpa materiaali, se tuottaa mekaanisesti vakaampia nanohiukkasia pentanatriumtripolyfosfaattiin (TPP) verrattuna .

useissa tutkimuksissa oli raportoitu KITOSAANINANOHIUKKASTEN (CS NPS) ainutlaatuisista ominaisuuksista DS: ää käyttäen. Preparatiivisten parametrien mukauttamista niiden fyysisiin ominaisuuksiin ei kuitenkaan ole vielä täysin tutkittu, esimerkiksi DS: n steerisen esteen vaikutusta CS: n ja BSA: n väliseen sähköstaattiseen vetovoimaan . Lisäksi onnistuneen lääkejakelujärjestelmän määräävä tekijä riippuu sen fyysisistä ominaisuuksista ja stabiiliudesta. Siksi tämän tutkimuksen tavoitteena oli moduloida preparatiivisia parametreja, jotta saadaan NANOSISOITUNEITA CS NPs-hiukkasia ja määritetään niiden kolloidinen stabiilisuus eri varastointilämpötiloissa ja erilaisissa suspendointiväliaineissa.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Materiaalit

pienimolekyylinen kitosaani (70 kDa, deasetylaatioaste 75-85%), väkevä etikkahappo, fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), naudan seerumin albumiini (BSA, 46 kDa) ja Bradfordin reagenssi ostettiin Sigma-Aldrich Inc.: ltä., YHDYSVALLAT. Kaksijuosteinen siRNA (sense: 5′-GAUAUGUCCGGUUAUGUAU-3′, antisense: 3′-UACAUACCGGACAUAUCUU-5′) ostettiin Thermoscientific DHARMACONISTA Yhdysvalloista. Dekstraanisulfaatti (DS) ostettiin Fisher Scientificiltä Britanniasta. Protein ladder (High range), Laemmli-näytepuskuri, 10x tris/glysiini/natriumdodekyylisulfaattipuskuri, ammoniumpersulfaatti, tetrametyleenidiamiini (TEMED), 2% bis-liuos ja 40% akryyliamidiliuos ostettiin Bio-Radista Yhdysvalloista. Tris-HCl-puskuri saatiin Invitrogenista, Yhdysvalloista. Kaikki muut käytetyt kemikaalit olivat analyyttistä laatua.

2.2. CS NPS

CS-nollan ja DS-liuoksen valmistus liuotettiin 1-prosenttiseen v/v-etikkahappoon ja tislattuun veteen. CS-liuoksen pH säädettiin pH 4: ään lisäämällä 1 M NaOH: ta tai 1 M HCl: ää. DS-ratkaisu (0,05%, 0,1%, 0.15%, 0,2% ja 0,25% w/v) lisättiin CS-liuokseen (0,1% w/V) magneettisekoittimella (Wisestir Digital Multipoint Magnetic Stirrer MS-MP8, Daihan Scientific, Korea) 250 rpm: ssä 15 minuutin ajan nanohiukkasten muodostamiseksi. Kaikki näytteet tehtiin kolmena kappaleena. Tuloksena olleet nanohiukkaset pestiin ja kerättiin ultracentrifugaatiolla (Optima L-100 XP Ultracentrifugi, jossa on roottori NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) kahdesti nopeudella 12 500 rpm 15 minuutin ajan 10°C: ssa.BSA: n liittämiseksi CS NPs: ään BSA liuotettiin CS-liuokseen (0,1% w/v, pH 4), jolloin lopullinen pitoisuus oli 1 mg/mL. BSA-lastatut CS NPs: t valmistettiin tämän jälkeen edellä mainitulla menetelmällä. Sirnan liittämiseksi CS NPs: ään DS-liuokseen lisättiin 3 µL sirnaa (15 µg/µL) deionisoidussa vedessä (0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, ja 0, 25% w/v) ennen tämän lisäämistä pisaroittain CS-liuokseen (0, 1% w/v).

2.3. Elektroforeettinen Liikkuvuustutkimus

CS NPs: n elektroforeettinen liikkuvuustutkimus () tehtiin Zetasizer Nano ZS: llä (Malvern Instruments, UK) ja se mitattiin odotusaikaa vasten. Jokainen näyte analysoitiin kolmena kappaleena.

2.4. Nanohiukkasten Luonnehdinta

partikkelikoko, pintavaraus ja polydispersitiivisuusindeksi (PDI) juuri valmistetuissa CS NPS: issä mitattiin Zetasizer Nano ZS: llä (Malvern Instruments, UK), joka perustui FOTONIKORRELAATIOSPEKTROSKOPIATEKNIIKOIHIN (PCS). Analyysin aikana ei tehty laimennoksia. Jokainen näyte analysoitiin kolmena kappaleena. Mittaukset tehtiin 25°C.

2,5. Morfologinen analyysi

kuormittamattoman CS NPs : n, BSA/siRNA : n lastatun CS NPS: n morfologinen kuvaus (DS: CS: n painosuhde 0,5: 1, 1 : 1) toteutettiin transmission electron microscopy (TEM), Tecnai Spirit, FEI, Eindhoven (Alankomaat).

2.6. BSA / siRNA-Kiinnitysteho

BSA/siRNA-kuormattu CS NPS erotettiin liuoksesta ultracentrifugaatiolla (Optima L-100 XP Ultracentrifugi roottori NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) nopeudella 14000 rpm 30 minuutin ajan. Sentrifugoinnista talteen otetut supernatantit dekantoitiin. Supernatantin BSA-pitoisuus analysoitiin UV-Vis-spektrofotometrillä 595 nm: ssä (U. V-1601; Shimadzu, Japani) käyttäen Bradford protein assay-määritystä valmistajan ohjeiden mukaisesti. supernatantin siRNA-pitoisuus analysoitiin UV-Vis-spektrofotometrillä 260 nm: ssä. Näytteet valmistettiin ja mitattiin kolmena kappaleena. BSA / siRNA entrapment efficiency (ee) laskettiin seuraavan yhtälön avulla:

2,7. CS NPs: n stabiilisuus

vastavalmistettu CS NPs (valmistettu 0,05-ja 0,1-prosenttisesta W/v: stä DS: stä ja CS-liuoksesta, resp.) sentrifugoitiin nopeudella 12 500 rpm 15 minuutin ajan ennen varastointia. Ultracentrifugoinnin jälkeen saadut pelletit suspendoitiin uudelleen joko tislattuun veteen (mitattu pH 6,6) tai PBS pH 7,4. Partikkelikoko ja pintavaraus mitattiin ennalta määrättyinä varastointiaikoina (0, 1, 2, 3, 5, 8, 14 vuorokautta) ja joko huoneenlämmössä tai 4°C: ssa.

2, 8. In Vitro-lääketutkimus

BSA : n/sirnan vapautuminen määritettiin CS NPs : stä, jolla oli korkein EE (DS: CS-suhde 1: 1 , EE = 98% ± 0, 2 ja resp.). BSA / siRNA-kuormattu CS NPS suspendoitiin Tris-HCl-puskuriliuokseen (pH 7,4, 4 mL) ja asetettiin magneettisekoittimeen, jonka sekoitusnopeus oli 100 rpm 37°C: ssa (MS MP8 Wise Stir Wertheim, Saksa) 48 tunnin ajan 37°C: ssa.5, 1, 2, 4, 6, 12, 20, 24, ja 48 h), näytteitä sentrifugoitiin nopeudella 14 000 rpm 30 minuutin ajan 10°C: n lämpötilassa.tämän jälkeen supernatantti dekantoitiin ja korvattiin vastaavalla tilavuudella tuoretta puskuriliuosta. Supernatantissa vapautuneen BSA / sirnan määrä analysoitiin UV-Vis-spektrofotometrillä (U. V-1601; Shimadzu, Japani) aallonpituudella 280 nm ja 260 nm.

2.9. BSA: n eheys

CS NPs: stä vapautuneen BSA: n eheys määritettiin SDS-PAGE-menetelmällä (12% ratkaisevaa ja 10% pinoavaa geeliä) käyttäen Mini-Protein System-järjestelmää (Bio-Rad, USA). BSA-näytteet sekoitettiin Laemmli-näytepuskuriin suhteessa 1: 1 ja kuumennettiin 95°C: ssa 5 minuutin ajan. Näytteet (15 µL) lastattiin kuoppiin ja geeli ajettiin Miniproteiinijärjestelmän Tetrakennolla vakiojännitteellä 150 V 90 minuutin ajan juoksevalla puskurilla, joka sisälsi 25 mM Tris: ää, 192 mM glysiiniä ja 0,1% SDS: ää pH: ssa 8,3. Näytenauhat värjättiin 40 minuutin ajan 0, 1% Coomassie blue-liuoksella, joka sisälsi 40% etikkahappoa ja 10% metanolia, minkä jälkeen ne värjättiin yön yli liuoksella, jossa oli 40% etikkahappoa ja 10% metanolia.

2.10. Tilastoanalyysi

kaikki tiedot esitettiin keskiarvona ± keskihajonta (SD). Tilastollinen analyysi (ANOVA-testi ja Tukeyn posthoc-analyysi) tehtiin käyttämällä Social (SPSS) – ohjelman versiota 15. Arvo < 0, 05 osoitti merkittävää eroa testattujen ryhmien keskiarvojen välillä.

3. Tulokset

3, 1. Hiukkaskoko ja Pintavaraus

Kuva 1(a) osoittaa sähköisen liikkuvuuden () tulokset odotusaikaa vastaan. Kuvaajasta voitiin havaita, että tasanne ja vakio 30 minuutin jälkeen. Tämä osoittaa, että vakaan sähköisen kaksoiskerroksen (e.d.l.) muodostuminen ei ollut hetkellistä, vaan se vaati joitakin hetkiä. CS-pitoisuuden ja DS-pitoisuuden väliset vaikutukset CS-pitoisuuden kokoon on esitetty kuvassa 1 (b). Havaittiin, että suurin osa CS NPs: stä, jonka koko oli alle 500 nm, saatiin alhaisella CS-pitoisuudella (0,1% w/v). DS-konsentraatio vaikutti myös nanohiukkasten kokoon (). Hiukkaskoossa voitiin havaita kasvava suuntaus DS-pitoisuuden kasvaessa 0,05 prosentista 0,25 prosenttiin w/v. yleensä DS-pitoisuus on 0.05% w / v (alhainen pitoisuus) tuotti nanohiukkasia, joiden hiukkaskoko oli alle 500 nm. Toisin kuin suuria nanohiukkasia (>1000 nm) saatiin, kun molempien polymeerien pitoisuus nostettiin 0,25 prosenttiin tai sen yli. Tulosten perusteella DS-pitoisuudet 0,05-0,20% w/v valittiin seuraaviin tutkimuksiin. Lisäksi DS: CS-painosuhteen kasvu (järjestelmässä olevien negatiivisten varausten suurempi tiheys DS: stä) johti hiukkaskoon kasvuun mutta hiukkasten pintavarauksen pienenemiseen (Taulukko 1 edellä). Koska CS-paino ylitti DS: n massan, saatiin positiivinen arvo +56,2 ± 1,5 mV. Hiukkasten pintavaraus kuitenkin laski arvoon-mV, kun siihen lisättiin negatiivisemmin varautunut DS. Se laski jatkuvasti, kun DS : CS-painosuhde oli noussut arvoon 2,5: 1. Tämän oletettiin johtuvan nanohiukkasten pinnalle kertyneestä ylimääräisestä DS-molekyylistä.

(a)

(b)

(a)
(b)

Kuva 1

elektroforeettinen liikkuvuus ajan funktiona (a) ja CS: n ja DS: n lopullisten pitoisuuksien vaikutus nanohiukkasten hiukkaskokoon (b),

alla olevasta taulukosta 1 käy ilmi, että DS 0,2% w/v: llä oli suurin hiukkaskoko sen jälkeen, kun se oli ladattu BSA: lla. Hiukkaskoko oli nm. Hiukkaskoko DS: lle pitoisuuksina 0,1 ja 0.15% w/v oli myös suurempi kuin tyhjät (). Toisaalta BSA: han ladatuilla nanohiukkasilla havaittiin suurempia positiivisia pintavarausarvoja kuin tyhjillä. Tämä havaittiin kaikilla DS-pitoisuuksilla. Lisäksi korkeampia EE-arvoja voitaisiin saavuttaa nostamalla DS : CS-painosuhde yli 0,5: 1. Nanohiukkasten EE DS: CS-painosuhteessa 1: 1, 1,5: 1 ja 2: 1 oli vastaavasti%, % ja%. Suurin EE saatiin DS: CS-painosuhteella 1: 1 (Taulukko 1 (alla)).

taulukon 2 mukaan DS 0.2% w / v: n hiukkaskoko oli suurin (900 ± 60 nm) siRNA-lastin jälkeen. siRNA lastasi CS NPs: ää eri DS-pitoisuuksilla (0,05, 0,1, 0,15 ja 0,2% w/v), ja hiukkaskoko oli pienempi. Nanohiukkasten EE DS: CS painosuhde 0.5 : 1, 1 : 1, 1.5 : 1, ja 2: 1 oli%,%, % ja%, vastaavasti.

3.2. Morfologia

CS NPs: n kuvat sai TEM (kuva 2). Kuvat 2 a ja 2 b osoittavat, että kuormittamattomilla CS NPs: llä oli pallomainen rakenne. Kuvat osoittivat, että sirnasta tuotetut nanohiukkaset (Kuvat 2(e) ja 2(f)) osoittivat epäsäännöllistä morfologiaa, mutta BSA: n ladatuissa nanohiukkasissa näkyi pitkulaisia morfologioita (Kuvat 2(c) ja 2(d)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

kuva 2

TEM kuvia CS NPs. a) ja b) purettu CS NPs klo 0.5 : 1 ja 1 : 1, c) ja d) BSA lastattu CS NPs klo 0.5 : 1 ja 1 : 1, ja (e) ja (f) siRNA latasi CS NPs : n arvoon 0,5 : 1 ja 1: 1. Kaikki kuvat otettiin 60 kX suurennoksella.

3.3. CS NPS: n Varastointistabiilisuus

sekä 0,05-että 0,10-prosenttisten W/v DS: n nanohiukkasten koko kasvoi ajan myötä, kuten kuvassa 3 a esitetään, kun niitä varastoitiin ympäristön lämpötilassa. Hiukkaskoko kasvoi merkittävästi varastointipäivän 14 jälkeen erityisesti 0,05% W/v DS: llä. Tämän arveltiin johtuvan kiviaineksen muodostumisesta. Tämä havainto vahvistettiin pintavarauksen tuloksilla, jotka osoittivat pintavarauksen vähenevän lähes neutraaliksi. Sen sijaan kun niitä säilytettiin 4°C: ssa, niiden hiukkaskoko ja pintavaraus pysyivät muuttumattomina jopa 14 vuorokautta 0,10% w/v DS: stä valmistetuille nanohiukkasille. Pieni muutos havaittiin 0, 05% w/v DS: llä (kuvat 4(a) ja 4(b)). Toisaalta, kun nämä nanohiukkaset suspendoitiin PBS pH 7.4: ään, kaikki formulaatiot yhdistettiin suurempiin, yli 1 µm: n kokoihin PDI-arvojen ollessa yli 0.5. Myös niiden hiukkasten pintalataukset olivat lähes neutraaleja, vaihdellen +0: sta.2 – +2,5 mV.

(a)

(b)

(a)
(b)

kuva 3

(a) hiukkaskoko ja B) CS NPs: n pintavaraus, joka on valmistettu 0,05-0,01% w/v DS-liuoksessa ja varastoitu 25°C: ssa .nanohiukkaset suspendoitiin tislattuun veteen (pH välillä 6-7).

(a)

(b)

(a)
(b)

Kuva 4

(a) hiukkaskoko ja B) CS NPs: n pintavaraus, joka on valmistettu 0,05 ja 0,10% w/v: ssä ja varastoitu 4°C: ssa .nanohiukkaset suspendoitiin tislattuun veteen (pH välillä 6-7).

3.4. BSA: n vapautuminen in Vitro ja eheys

kuva 5(A) havainnollistaa, että BSA: n vapautuminen voidaan jakaa kahteen vaiheeseen vapautumisnopeuden perusteella. Ensimmäisessä vaiheessa BSA vapautui nopeasti CS NPs: stä, ja se purkautui ensimmäisen 6 tunnin aikana. tämä johti 45 ± 5 prosentin kumulatiiviseen BSA: n vapautumiseen. Toisessa vaiheessa BSA vapautui hitaasti 6 h: sta 48 h: iin, jolloin kumulatiivinen BSA: n vapautuminen oli yli 60%. SDS-PAGE arvioi CS NPS: ltä vapautetun BSA: n eheyden, ja se esitetään kuvassa 5(b). Havaitut kaistat vahvistivat, että BSA, joka oli kestänyt lastaus-ja vapautusprosessit 37°C: ssa päivien 1 ja 2 jälkeen, ei eronnut juuri valmistetuista BSA-standardeista. Näin ollen voitiin päätellä, että BSA säilyi alkuperäisessä muodossaan CS NPs: ssä koeolosuhteissa.

(a)

(b)

(a)
(b)

kuva 5

(a) BSA : n vapautusprofiili, jossa CS NPS on ladattu DS : CS-suhteessa 1: 1 pH: ssa 7.4, . (B) SDS-PAGE analysis of BSA released from CS NPs: (m) SDS-PAGE standards (BIO-RAD); (a) BSA standard 1 mg/mL; (B) BSA standard 0.2 mg/mL; (C) blank; (d) purettu CS NPs; (E) and (F) BSA vapautettu CS NPS (DS : CS suhde 1 : 1) päivinä 1 ja 2.

3.5. Sirnan In Vitro-julkaisu

kuva 6 havainnollistaa, että sirnan vapautuminen voidaan jakaa kahteen vaiheeseen vapautumisnopeuden perusteella. Ensimmäisessä vaiheessa siRNA irtosi nopeasti CS NPs: stä ja näytti purskeen vapautumista ensimmäisen 6 tunnin aikana. Tämä johti sirnan kumulatiiviseen vapautumiseen 58% ± 5. Toisessa vaiheessa siRNA vapautui hitaasti 6 h: sta 48 h: iin, jolloin kumulatiivinen BSA: n vapautuminen oli yli 85%.

kuva 6

sirnan vapautusprofiili latasi CS NPs : n DS : CS-suhteessa 1: 1 pH: ssa 7,4, .

4. Keskustelut

tässä tutkimuksessa käytetty menetelmä CS NPs: n tuottamiseksi on lievä prosessi, ja se mahdollistaa hiukkaskoon säätelyn muuttamalla tiettyjä parametreja, kuten lisättyjen suolojen pitoisuutta, viskositeettia, sulamattomien aineiden määrää ja polymeerin molekyylipainoa. Tämä tutkimus aloitettiin tutkimuksella, jonka tarkoituksena oli saada tietoa IONISOITUVIEN CS NPs-ryhmien sähköisestä tilasta määrittämällä e.d.l: n stabilointiaika. tämä vaihe on tärkeä luotettavien ja toistettavissa olevien tulosten saamiseksi. Saadut tiedot viittasivat vakaan e.d.l: n muodostumiseen. nanohiukkasten valmistelu vaati joitakin hetkiä sekoittamisen lopettamisen jälkeen. Näitä hetkiä tarvittiin, jotta elektrolyytit pääsisivät tunkeutumaan kohti hiukkasten ydintä. Odotusaika oli siis 40 minuuttia, ennen kuin CS NPs voitiin mitata tarkasti. Tämä havainto oli samankaltainen kuin CS-tripolyfosfaatti (CS-TPP) NPs, joka viittasi samaan odotusaikaan .

suoritettiin myös tutkimus, jossa selvitettiin polymeeripitoisuuden vaikutusta hiukkasten muodostumiseen. Tutkimuksessa pyrittiin selvittämään polyelektrolyyttikonsentraation vaihteluväli halutun kokoisten nanohiukkasten tuottamiseksi. Cs-ja DS-pitoisuuksien vaihtelevien vaikutusten tutkimiseksi nanohiukkasten muodostumiseen valmistettiin CS-ja DS-ratkaisu 0,1, 0,25 ja 0,5% w/v. DS-ratkaisun volyymit vaihtelevat (1, 2, 3, 4, 5, 5.8, ja 10 mL) sekoitettiin 5 mL: aan kutakin CS–pitoisuutta (0, 1-0, 5% w/v). Lopulliset cs-ja DS-pitoisuudet laskettiin, ja näytteiden koot luokiteltiin joko 100-500, 501-1000 tai yli 1000 nm. Havaittiin, että hiukkaskokoon vaikutti DS-pitoisuus. Tämä päätelmä vahvistettiin CS-TPP NPs: n tulosten perusteella . Yleensä nanohiukkasten haluttu koko rajoittui 100-1000 nm: n välille. Aiemmat tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että ladatut nanohiukkaset tuottaisivat normaalisti suuremman koon kuin tyhjät. Alle 500 nm: n koko on siis suotuisa.

lisäksi tulokset osoittivat, että vain 0,05% w/v: n DS-konsentraatio pystyi tuottamaan nanohiukkasia, joiden hiukkaskoko oli alle 500 nm, kuten taulukossa 1 on esitetty. Se oli odotettavissa, sillä kun molemmat polymeerit olivat pieninä pitoisuuksina, DS: n lisääminen CS: ään johti pieniin koakervatiytimiin. Toisin kuin suuret, kooltaan yli 1000 nm: n koaservatit pyrkivät muodostumaan, kun molempien polymeerien pitoisuus nousi 0,25 prosenttiin tai yli. Kitosaanin kyky muodostaa spontaanisti koaservatia johtuu vastakkaisesti varautuneiden polyelektrolyyttien vuorovaikutuksesta muodostaen polyelektrolyyttikompleksin, jolla on alentunut liukoisuus. DS: n suuren pitoisuuden ja CS: n seos vaikuttaa siten todennäköisemmin CS-ketjujen takertumiseen ja tuloksena olevan kompleksin liukoisuuteen. Tämän seurauksena syntyy runsaasti kompleksoitumista ja coacervatea . Alentunut viskositeetti pienemmällä CS-pitoisuudella johti myös parempaan liukoisuuteen. Tämä mahdollisti kationisten CS: n ja vastakkaisesti varautuneiden ionien tehokkaamman vuorovaikutuksen, ja näin syntyi pienempi hiukkaskoko . Lisäksi käytetyn polyanionin moolimassan kasvu ja ylimäärä johtivat suurempiin hiukkasiin, koska muodostui hyvin neutralisoituneita komplekseja ja niillä oli taipumus flokkuloitua . Tässä tutkimuksessa nanopartikkelien pintavaraus oli riippuvainen DS: n ja CS: n painosuhteesta. Hiukkasten pintavarauksen havaittiin kasvavan suhteen pienentyessä. Tästä suhteesta voisi olla hyötyä halutun hiukkaspinnan varaustiheyden saavuttamisessa nanohiukkasten tarttumis-ja kuljetusominaisuuksien helpottamiseksi.

tässä tutkimuksessa BSA: n sisällyttäminen CS NPs: ään saatiin aikaan yksinkertaisesti sekoittamalla liuotettuja BSA-molekyylejä sisältävä hapan CS-liuos huoneenlämpöiseen DS-liuokseen ilman stabilointiainetta. BSA: ta käytetään usein malliproteiinina, koska se käsittää muiden proteiinien yleisen ominaisuuden ja se on bioyhteensopiva ihmiselle. Todettiin, että CS NPs oli kooltaan verrattain suurempi BSA: lla lastaamisen jälkeen. Hiukkaskoon odotettiin kasvavan, kun BSA: ta onnistuttiin lastaamaan nanohiukkasiin. Tämä suuntaus voi mahdollisesti johtua lisättyjen BSA-molekyylien molekyylipainosta ja koosta. Nämä suuret hiukkaskoot saattavat rajoittaa niiden käyttöä proteiinin toimituksessa. 150-300 nm: n nanohiukkasia on lähinnä maksassa ja pernassa . Lisäksi joidenkin raporttien mukaan syövän hoitoon kehitettyjen nanohiukkasten “ihanteellinen” kokovaatimus on 70-200 nm . Vaikka nanohiukkasten pitäisi olla enintään 150 nm ylittääkseen endoteelin esteen, kirjallisuudessa ilmoitetaan aina fenestraatioiden rajoja suurempien hiukkasten tunkeutumisesta. Itse asiassa fenestraatio ja verisuonitus voivat muuttua erilaisissa patologisissa olosuhteissa .

esimerkiksi kasvaimen kasvu indusoi uuskasvun, jolle on ominaista epäjatkuva Endoteeli ja suuret fenestraatiot 200-780 nm . Lisäksi havaittiin, että BSA: n ladatun nanohiukkasen hiukkaspinnan varaus oli suurempi kuin tyhjien. Tämä voi johtua BSA: n kationisesta ominaisuudesta happamassa tilassa. Cs-ja BSA-molekyylien positiiviset varaukset ovat siis osaltaan lisänneet hiukkaspinnan varauksen arvoa ladatuille nanohiukkasille.

positiivisesti varautuneet kationipolymeerit voivat tehokkaasti sitoutua ja suojata nukleiinihappoja, kuten DNA: ta , oligonukleotideja ja sirnaa . Tässä tutkimuksessa siRNA liitettiin CS NPs: ään yksinkertaisesti sekoittamalla hapanta CS-liuosta sirnaa sisältävään DS-liuokseen huoneenlämmössä. Havaittiin, että CS NPS: n hiukkaskoko oli sirnalla lastaamisen jälkeen suhteellisesti pienempi. Sirnalla lastattujen CS NPs: ien pienempi koko voi johtua kationipolymeerin aiheuttamasta nukleiinihapon negatiivisten varausten neutraloitumisesta, jolloin syntyy kondensoituneita pienempikokoisia nanohiukkasia. SiRNA: lla ladatussa CS NPS: ssä oli myös suurempi zeta-potentiaali kuin tyhjässä CS NPS: ssä, mikä noudatti samaa kehityssuuntaa kuin BSA: lla ladatussa CS NPS: ssä.

onnistuneen annostelujärjestelmän tulisi olla hyvin yhdistävä lääkeaine. SiRNA-kuormatussa CS NPs-mallissa kiinnijäämishyötysuhde oli parempi (<90%) kaikilla DS : CS-painosuhteilla. Nanohiukkasten kiinniottotehokkuus DS : CS-painosuhteessa 1: 1, 1.5 : 1, ja 2 : 1 oli suurempi kuin painosuhde 0,5: 1. Ilmiö johtui mitä todennäköisimmin siitä, että NANOPARTIKKELEISSA oli enemmän DS: ää. DS: n lisääminen helpottaisi BSA: n kiinnittymistä nanohiukkasiin. Tämä voidaan selittää sillä, että BSA on zwitterioninen molekyyli. Väliaineen pH-arvolla 3, 5-4, 0 BSA: n liukoisuus voi olla hyvin lisääntynyt sen sisältämien positiivisten varausten lisääntymisen vuoksi . Näin BSA pystyisi elektrostaattisesti kiinnittymään ja latautumaan vakaasti nanohiukkasiin. Happamassa liuoksessa BSA: lla voisi olla positiivinen varaus ja se kilpailisi CS: n kanssa vuorovaikutuksessa DS: n kanssa sähköstaattisesti. Tätä päätelmää tukivat BSA: n lastaamien CS NPS: ien positiiviset pintalataukset verrattuna lastaamattomiin. Lisäksi BSA: lla on multi-ionisia sivustoja, ja tämä ominaisuus voisi helpottaa BSA: n liittämistä nanohiukkasiin. Tämä havainto eroaa CS-TPP NPs: n kanssa tehdystä havainnosta .

tutkimuksessa sähköstaattinen vuorovaikutus oli BSA: n ja CS: n välillä BSA: n ja TPP: n sijaan. Ehdotettiin myös, että BSA: n pitäisi liueta liuokseen, jonka pH on suurempi kuin sen isoelektrinen piste, jotta BSA: lla olisi negatiivinen varaus ja se olisi vuorovaikutuksessa positiivisesti varautuneiden CS-molekyylien kanssa. Tämä havainto osoitti, että sähköstaattinen vuorovaikutus on tärkein tekijä, joka edistää BSA: n liittymistä nanohiukkasiin joko CS-proteiini-vuorovaikutuksen tai DS-proteiini-vuorovaikutuksen kautta.

TEM mahdollistaa yksittäisten nanohiukkasten nanomittakaavan visualisoinnin ja antaa tietoa sekä koosta että morfologiasta. Hiukkasmorfologia on tärkeä tekijä kolloidisen ja kemiallisen stabiilisuuden sekä nanohiukkasten bioaktiivisuuden kannalta. siRNA ladattu CS NPs osoitti epäsäännöllinen morfologia, mutta BSA ladattu cs NPs osoitti pitkänomainen morfologia. Tämä voi johtua BSA: n suuremmasta koosta, joka voi kietoutua CS: ään tai toimia sen suojana, mikä rajoittaa CS: n kokonaisaltistusta rakenteen sisällä.

tärkeää on myös CS NPs: n Säilyvyysprofiili varastoinnin aikana. Nämä tiedot voisivat antaa kuvan nanohiukkasten vakaudesta eri väliaineissa ja lämpötiloissa. Nanohiukkasten stabiilisuutta tutkittiin arvioimalla niiden vaihtelua keskimääräisessä hiukkaskoossa ja pintavarauksessa ajan kuluessa. Aluksi nanohiukkaset suspendoitiin uudelleen tislattuun veteen, jonka pH oli 6,6, joka suodatettiin 0,2 µm: n suodattimella mahdollisten vedessä olevien epäpuhtauksien poistamiseksi. Tätä tutkimusta varten testattiin vain nanohiukkasia, jotka oli valmistettu 0,05 ja 0,10% w/v DS: stä. Muita DS-pitoisuuksia ei määritetty sentrifugoinnin jälkeen kasvaneen hiukkaskoon vuoksi. Hiukkaskoko oli 0,15% ja 0,20% w/v DS. Partikkelikoon kasvu saattaa CS NPs: n vuoksi heikentää ja menettää pallomaisen muotonsa vesiympäristössä, ja näin ollen partikkelin keskimääräinen halkaisija kasvaisi tämän eroosion seurauksena . Lisäksi molemmista pitoisuuksista valmistettujen nanohiukkasten hiukkaspintavaraukset pienenivät ajan myötä. Epäiltiin, että CS saattaa hajota vesipitoisissa väliaineissa, vaikka lysotsyymejä ei olisikaan. Tulokset osoittivat, että CS NPs oli vakaampi, kun sitä säilytettiin 4°C: ssa, koska niiden hiukkaskoko ja pintavaraus pysyivät muuttumattomina tai hieman muuttuivat 14 päivään asti. Tulokset viittasivat myös siihen, että CS NPs: ää ei pitäisi säilyttää ympäristön lämpötilassa, koska se on altis hajoamiselle. Tulokset viittasivat siis siihen, että huoneenlämmössä säilytetyt CS NPs: t hajoavat herkemmin kuin viileässä säilytetyt. Syynä oli todennäköisesti viileä ympäristö, joka saattaa hidastaa nanohiukkasten kineettistä liikettä. Näin nanohiukkaset voisivat säilyttää pallomaisen muotonsa ja eroosio olisi epätodennäköisempää. Lisäksi havaittiin, että nämä nanohiukkaset aggregoituivat PBS: ssä pH: ssa 7,4. Tämä saattaa viitata nanohiukkasten pienempään pintavaraukseen PBS: ssä, lähellä neutraalia. Hiukkasten pintavaraus, joka laski nollaan, voi viitata siihen, että PBS: n fosfaattiryhmät olivat peruneet CS NPs: n varauksen. Näiden nanohiukkasten neutraalisti varautunut tila voi aiheuttaa intermolekulaaristen voimien häviämistä, mikä on tärkeää nanohiukkasten yksittäin säilyttämisen kannalta. Tämän seurauksena nämä lataamattomat nanohiukkaset voivat alkaa kasautua ja horjuttaa kolloidista järjestelmää. Toisin kuin PBS, Tislattu vesi voi tuottaa lukuisia vetyioneja muodostamaan vetysidoksia, jotka voivat auttaa rikkomaan nanohiukkasten aggregaatiota vuorovaikutuksessa ionisoituvien CS NPs-ryhmien kanssa.

CS NPs: n BSA: n ja sirnan in vitro-release-tutkimus tehtiin Tris-HCL-puskurissa. BSA: n ja sirnan julkaisu voitiin jakaa kahteen vaiheeseen julkaisutahdin perusteella. Ensimmäisessä vaiheessa lääke vapautui nopeasti CS NPs: stä. BSA: n ja sirnan vapautuminen tässä vaiheessa saattaa liittyä BSA/siRNA: n diffuusioon hiukkasen pinnalla. Toisessa vaiheessa BSA / siRNA vapautui hitaasti polymeerin turpoamisen tai hajoamisen vuoksi. Jäljelle jäävä BSA/siRNA CS NPs: ssä vapautuisi kokonaan vasta, kun hiukkaset olisivat täysin syöpyneet tai liuenneet vapautumisalustaan. Tämä saattoi johtua jäljellä olevan BSA/siRNA-ryhmän ja vapaan amino-ryhmän yhteisvaikutuksesta CS-segmenteissä . Lisäksi syntetisoitu järjestelmä, jonka on aiemmin kuvattu pystyvän muotoilemaan miedoissa olosuhteissa, varmisti, että CS NPs: ään ladattujen proteiinien stabiilisuus oli SDS-Pagen mukaan ennallaan.

5. Päätelmät

yhteenvetona tämä tutkimus osoittaa, että CS-ja DS-pitoisuus sekä pH olivat CS NPs: n hiukkaskokoa ja pintavarausta säätelevät parametrit. Alle 500 nm : n nanohiukkasia voitaisiin saada DS : CS-painosuhteessa 0,5: 1 pH: ssa 4. BSA : n kiinnijäämisessä nanohiukkasilla, joilla on korkeampi DS: CS-painosuhde, on ollut suurempi kiinnijäämisetehokkuus, yli 88 prosenttia. Suurin saavutettava kiinnijäämishyötysuhde oli 0,10% w / v DS (DS : CS-suhde 1: 1). SiRNA : lla ladattu CS NPs osoitti kuitenkin suurta kiinnijäämishyötysuhdetta (>90%) kaikilla DS: CS-suhteilla. Varastointilämpötilan ja suspendoivan väliaineen havaittiin olevan tekijöitä, jotka voivat vaikuttaa CS NPs: n stabiilisuuteen. CS NPs: t olivat labiileja ja pyrkivät epävakauttamaan ympäristön lämpötilassa, mutta pidättävät tämän labiilin käyttäytymisen viileässä ympäristössä (2-4°C). Lisäksi CS NPs: llä oli parempi stabiilisuus tislatussa vedessä kuin PBS: llä, mikä saattoi johtua vesimolekyylien ja CS NPS: n ionisoituvien ryhmien välille muodostuneista vetysidoksista.

eturistiriita

kirjoittajat toteavat, ettei tämänhetkisessä tutkimuksessa ole henkilökohtaista tai taloudellista eturistiriitaa.

tunnustus

kirjoittajat kiittävät Universiti Kebangsaan Malesian (UKM-DLP-2011-001) “Dana Lonjakan Penerbitania” nykyisen tutkimushankkeen rahoittamisesta ja tukemisesta.