Développement de nanoparticules de Chitosane comme Système d’administration de Médicaments stable pour les protéines/ARNsi

Résumé

Les nanoparticules de Chitosane (NPS CS) présentent de bonnes propriétés physico-chimiques en tant que systèmes d’administration de médicaments. Le but de cette étude est de déterminer la modulation des paramètres préparatifs sur les caractéristiques physiques et la stabilité colloïdale des NPS CS. Les NPS CS ont été fabriqués par interaction ionique avec le sulfate de dextrane (DS) avant de déterminer leur stabilité au stockage. Les plus petits NPs CS de nm avec une charge de surface de mV ont été produits lorsque CS et DS ont été mélangés à pH 4 et avec un rapport massique DS: CS de 0,5: 1. Une efficacité de piégeage de 98% a été atteinte lorsque le BSA/siRNA a été chargé dans les nanoparticules. Les résultats ont également montré que la taille des particules et la charge de surface des NPs CS étaient légèrement modifiées jusqu’à 2 semaines lorsqu’elles étaient stockées à 4 ° C. Une plus grande taille des particules et une charge de surface ont été obtenues avec l’augmentation de la concentration de DS. En conclusion, les NPS étaient suffisamment stables lorsqu’ils étaient maintenus à 4 ° C et capables de transporter et de protéger les protéines.

1. Introduction

Les peptides, protéines et oligonucléotides endogènes sont parmi les principaux médicaments qui attirent beaucoup l’attention en raison de leur grand potentiel dans le traitement des maladies chroniques. Cependant, l’environnement extrême in vivo du corps humain a toujours limité les applications thérapeutiques de ces substances. Les nanoparticules polymères ont attiré beaucoup d’attention en tant que systèmes d’administration en raison de leur capacité à surmonter les barrières physiologiques et à protéger et cibler les substances chargées vers des cellules spécifiques. Des polymères naturels tels que le chitosane (CS) ont été étudiés pour former des nanoparticules. CS est un polysaccharide biodégradable, et il est dérivé de la désacétylation de la chitine. Outre sa biocompatibilité, sa faible toxicité, ses propriétés hémostatiques et bactériostatiques contribuent également à ses diverses applications dans le domaine pharmaceutique. Plusieurs anions ont été étudiés pour réticuler les CS comme le sulfate de sodium et le sulfate de dextrane (DS). DS est capable de modifier l’efficacité de piégeage (EE) des protéines et des ARNSI sans utiliser d’agents durcissants et de contrôler le taux de libération du médicament en raison de sa densité de charge élevée. En outre, le DS est un matériau bon marché, il produit des nanoparticules mécaniquement plus stables que le tripolyphosphate de pentasodium (TPP).

Plusieurs études avaient rapporté les caractéristiques uniques des nanoparticules de chitosane (NPS CS) utilisant DS. Cependant, la modulation des paramètres préparatifs sur leurs caractéristiques physiques n’est pas encore entièrement étudiée, par exemple, l’influence de l’obstacle stérique DS sur l’attraction électrostatique entre CS et BSA. De plus, le facteur déterminant de la réussite d’un système d’administration de médicaments dépend de ses caractéristiques physiques et de sa stabilité. Par conséquent, les objectifs de la présente étude étaient de moduler les paramètres préparatifs pour obtenir des particules nanosisées de NPS CS et de déterminer leur stabilité colloïdale à différentes températures de stockage et dans divers milieux de suspension.

2. Matériaux et méthodes

2.1. Matériaux

Le chitosane de faible poids moléculaire (70 kDa avec un degré de désacétylation de 75% à 85%), l’acide acétique glacial, la solution saline tamponnée au phosphate (PBS), l’albumine sérique bovine (BSA, 46 kDa) et le réactif de Bradford ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich Inc., USA. Le siRNA double brin (sens: 5′-GAUUAUGGGUUAUGUAUU-3′, antisens: 3′-UACAUAACCGGACAUAUAUCUU-5′) a été acheté à Thermoscientific Dharmacon, aux États-Unis. Le sulfate de dextrane (DS) a été acheté auprès de Fisher Scientific, Royaume-Uni. Une échelle de protéines (gamme élevée), un tampon d’échantillon de Laemmli, un tampon tris / glycine / dodécylsulfate de sodium 10x, du persulfate d’ammonium, de la tétraméthylènediamine (TEMED), une solution de bis à 2% et une solution d’acrylamide à 40% ont été achetés auprès de Bio-Rad, aux États-Unis. Le tampon Tris-HCl a été obtenu auprès d’Invitrogen, aux États-Unis. Tous les autres produits chimiques utilisés étaient de qualité analytique.

2.2. Préparation des solutions de CS NPs

à blanc et de CS NPs chargées en BSA ont été dissoutes dans de l’acide acétique à 1% v/v et de l’eau distillée, respectivement. Le pH de la solution de CS a été ajusté à pH 4 en ajoutant du NaOH à 1 M ou du HCl à 1 M. Solution DS (0,05%, 0,1%, 0.15%, 0,2% et 0,25% p / v) ont été ajoutés goutte à goutte dans une solution de CS (0,1% p / v) sous agitation magnétique (Agitateur magnétique Multipoint numérique WiseStir MS-MP8, DAIHAN Scientific, Corée) à 250 tr / min pendant 15 min pour former des nanoparticules. Tous les échantillons ont été réalisés en trois exemplaires. Les nanoparticules résultantes ont été lavées et récoltées par ultracentrifugation (Ultracentrifugeuse Optima L-100 XP avec rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) deux fois à 12 500 tr/min pendant 15 min à 10°C. Pour l’association du BSA en NPs CS, le BSA a été dissous dans une solution de CS (0,1% p/v, pH 4) pour produire une concentration finale de 1 mg/mL. Les NPS CS chargés en BSA ont ensuite été préparés selon la méthode ci-dessus. Pour l’association des ARNsi en NPs CS, 3 µL d’ARNsi (15 µg / µL) dans de l’eau désionisée ont été ajoutés à la solution de DS (0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, et 0,25% p / v) avant de l’ajouter goutte à goutte à la solution CS (0,1% p/v).

2.3. Étude de mobilité électrophorétique

Des mesures de mobilité électrophorétique () de NPS CS ont été effectuées avec un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Royaume-Uni) et ont été mesurées par rapport au temps d’attente. Chaque échantillon a été analysé en trois exemplaires.

2.4. Caractérisation des nanoparticules

La taille des particules, la charge de surface et l’indice de polydispersité (PDI) des NPS CS fraîchement préparés ont été mesurés à l’aide d’un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Royaume-Uni), basé sur les techniques de spectroscopie de corrélation de photons (PCS). Aucune dilution n’a été effectuée pendant l’analyse. Chaque échantillon a été analysé en trois exemplaires. Les mesures ont été effectuées à 25°C

2,5. Analyse morphologique

Caractérisation morphologique des NPS CS déchargés, NPs CS chargés BSA / siRNA (rapport pondéral DS: CS de 0,5: 1,1 : 1) a été réalisée en microscopie électronique à transmission (TEM), Tecnai Spirit, FEI, Eindhoven (Pays-Bas).

2.6. Efficacité de piégeage BSA/siRNA

Les NPS CS chargés de BSA/siRNA ont été séparés de la solution par ultracentrifugation (Ultracentrifugeuse Optima L-100 XP avec rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) à 14000 tr/min pendant 30 min. Les surnageants récupérés à la centrifugation sont décantés. La teneur en BSA du surnageant a été analysée par un spectrophotomètre UV-Vis à 595 nm (U.V-1601; Shimadzu, Japon) en utilisant le test de protéines de Bradford selon les instructions du fabricant. La teneur en siRNA dans le surnageant a été analysée par un spectrophotomètre UV-Vis à 260 nm. Des échantillons ont été préparés et mesurés en trois exemplaires. L’efficacité de piégeage BSA/siRNA (EE) a été calculée à l’aide de l’équation suivante :

2,7. Stabilité des NPS CS

NPs CS fraîchement préparés (fabriqués à partir de 0,05% et 0,1% p / v de solution de DS et de CS, resp.) ont été centrifugées à 12 500 tr/min pendant 15 min avant stockage. Après ultracentrifugation, les pastilles obtenues ont été remises en suspension soit dans de l’eau distillée (pH mesuré de 6,6), soit dans du PBS pH 7,4. La taille des particules et la charge de surface ont été mesurées à des durées de stockage prédéterminées (0, 1, 2, 3, 5, 8, et 14 jours), et à température ambiante ou 4°C

2,8. Étude de libération in Vitro de médicaments

La libération de BSA / siRNA a été déterminée à partir de NPS CS présentant l’EE la plus élevée (rapport DS: CS 1: 1, EE = 98% ± 0,2 et, resp.). Des NPS CS chargés de BSA/siRNA ont été mis en suspension dans une solution tampon Tris-HCl (pH 7,4,4 mL) et placés sur un agitateur magnétique avec une vitesse d’agitation de 100 tr/min à 37 °C (MS MP8 Wise Stir Wertheim, Allemagne) pendant 48 h à 37 °C à des intervalles de temps prédéterminés (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 20, 24, et 48 h), les échantillons ont été centrifugés à 14 000 tr/min pendant 30 min à 10°C. Puis, le surnageant a été décanté et remplacé par un volume équivalent de solution tampon fraîche. La quantité de BSA/siRNA libérée dans le surnageant a été analysée par un spectrophotomètre UV-Vis (U.V-1601; Shimadzu, Japon) à une longueur d’onde de 280 et 260 nm, respectivement.

2.9. Intégrité de la BSA

L’intégrité de la BSA libérée par les NPS CS a été déterminée par SDS-PAGE (gel de résolution à 12% et d’empilement à 10%) en utilisant le système Mini-Protein (Bio-Rad, USA). Les échantillons de BSA ont été mélangés au tampon d’échantillon Laemmli dans un rapport 1: 1 et chauffés à 95 ° C pendant 5 min. Des échantillons (15 µL) ont été chargés dans les puits et le gel a été exécuté à l’aide d’une cellule Tétra à système Mini-protéique à une tension constante de 150 V pendant 90 min avec un tampon de fonctionnement contenant 25 mm de Tris, 192 mm de glycine et 0,1% de SDS à pH 8,3. Les bandes d’échantillons ont été colorées pendant 40 min avec une solution bleue de Coomassie à 0,1% contenant de l’acide acétique à 40% et du méthanol à 10%, puis colorées pendant une nuit avec une solution d’acide acétique à 40% et de méthanol à 10%.

2.10. Analyse statistique

Toutes les données ont été présentées en moyenne ± écart-type (ET). L’analyse statistique (test ANOVA et analyse posthoc de Tukey) a été réalisée à l’aide du Package statistique pour le programme social (SPSS) version 15. Une valeur < 0,05 a montré une différence significative entre la moyenne des groupes testés.

3. Résultats

3.1. Taille des particules et Charge de surface

La figure 1 (a) montre les résultats de la mobilité électrique () par rapport au temps d’attente. À partir du graphique, on peut observer que le plateau est resté et constant après 30 min. Ceci démontre que la formation d’une double couche électrique stable (e.d.l.) n’a pas été instantanée mais a nécessité quelques instants. Les effets entre la concentration de CS et les concentrations finales de DS sur la taille des NPS CS sont présentés à la figure 1 (b). On a observé que la plupart des NPS CS de taille inférieure à 500 nm étaient obtenus à une faible concentration en CS (0,1% p/v). La concentration de DS a également influencé la taille des nanoparticules (). Une tendance croissante de la taille des particules a pu être observée avec l’augmentation de la concentration de DS de 0,05 à 0,25% p / v. En général, la concentration de DS de 0.05% p / v (faible concentration) a produit des nanoparticules dont la taille des particules est inférieure à 500 nm. Contrairement à cela, de grosses nanoparticules (> 1000 nm) ont été obtenues lorsque la concentration des deux polymères a été augmentée à 0,25% ou plus. Sur la base des résultats, des concentrations de DS de 0,05 à 0,20 % p/v ont été sélectionnées pour les études suivantes. De plus, une augmentation du rapport pondéral DS:CS (densité plus élevée de charges négatives de DS présentes dans le système) a entraîné une augmentation de la taille des particules mais une diminution de la charge de surface des particules (Tableau 1 (ci-dessus)). Comme le poids CS dépassait la masse de DS, une valeur positive de + 56,2 ± 1,5 mV a été obtenue. Cependant, la charge de surface des particules a diminué à −mV lorsque des DS plus chargés négativement ont été ajoutés. Il diminuait continuellement lorsque le rapport pondéral DS:CS avait atteint 2,5:1. Cela devait être dû à un excès de molécules de DS accumulées à la surface des nanoparticules.

(a)

(d)

(a)
(b)

Figure 1

Mobilité électrophorétique en fonction du temps (a) et de l’effet des concentrations finales de CS et de DS sur la taille des particules des nanoparticules (b),.

Le tableau 1 (ci-dessous) montre que DS 0,2% p/v possédait la plus grande taille de particules après avoir été chargé en BSA. La taille des particules était nm. Taille des particules pour DS à des concentrations de 0,1 et 0.15% w / v était également plus grand que les vides (). D’autre part, des valeurs positives plus élevées de charge de surface ont été observées pour les nanoparticules chargées en BSA par rapport aux nanoparticules vides. Ceci a été observé pour toutes les concentrations de DS. De plus, des valeurs d’EE plus élevées pourraient être obtenues en augmentant le rapport pondéral DS: CS au-dessus de 0,5: 1. L’EE des nanoparticules au rapport pondéral DS: CS de 1: 1, 1,5: 1 et 2: 1 était respectivement %, % et %. L’EE la plus élevée a été obtenue avec un rapport pondéral DS:CS 1:1 (Tableau 1 (ci-dessous)).

Le tableau 2 montre que DS 0.2% p/v possédait la plus grande taille de particule (900 ± 60 nm) après avoir été chargé en ARNsi. L’ARNSI chargé de NPS CS à différentes concentrations de DS (0,05, 0,1, 0,15 et 0,2% p / v) a montré une taille de particule plus petite. L’EE des nanoparticules au rapport pondéral DS:CS de 0.5 : 1, 1 : 1, 1.5 : 1, et 2:1 était %, %,% et %, respectivement.

3.2. Morphologie

Les images des NPS CS ont été obtenues par TEM (Figure 2). Les figures 2(a) et 2(b) montrent que les NPS CS déchargés présentaient une structure sphérique. Les images ont démontré que les nanoparticules générées à partir d’ARNsi (Figures 2(e) et 2(f)) présentaient une morphologie irrégulière ; cependant, les nanoparticules chargées en BSA présentaient des morphologies allongées (Figures 2(c) et 2(d)).

(a)

(d)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figure 2

Images TEM de CS NPs. (a) et (b) NPS CS déchargés à 0,5:1 et 1:1, (c) et (d) NPs CS chargés par BSA à 0,5:1 et 1 : 1, et (e) et (f) siRNA chargé CS NPs à 0,5:1 et 1:1, respectivement. Toutes les images ont été prises à un grossissement de 60 kX.

3.3. La stabilité au stockage des NPs CS

Les deux nanoparticules fabriquées à partir de DS de 0,05 et 0,10% p / v ont augmenté de taille au fil du temps, comme le montre la figure 3 (a) lorsqu’elles sont stockées à température ambiante. Une augmentation significative de la taille des particules a été observée après le jour 14 de stockage en particulier pour 0,05% p/v DS. On pensait que cela était dû à la formation d’agrégats. Cette constatation est corroborée par les résultats de la charge de surface qui ont montré une diminution de la charge de surface à presque neutre. En revanche, lorsqu’elles ont été stockées à 4 ° C, leur taille de particules et leur charge de surface sont restées inchangées jusqu’à 14 jours pour des nanoparticules fabriquées à partir de DS à 0,10% p / v. Un léger changement a été observé pour 0,05 % p/v DS (figures 4(a) et 4(b)). En revanche, lorsque ces nanoparticules étaient en suspension dans du PBS pH 7,4, toutes les formulations étaient agrégées à des tailles plus grandes de plus de 1 µm avec des valeurs de PDI supérieures à 0,5. Leurs charges de surface de particules étaient également presque neutres, allant de +0.2 à +2,5 mV.

(a)

(d)

(a)
(b)

Figure 3

( a) Taille des particules et (b) charge de surface de NPS CS préparés à 0,05 et 0,01% p / v de solution de DS et stockés à 25 ° C. Des nanoparticules ont été mises en suspension dans de l’eau distillée (pH compris entre 6 et 7).

(a)

(d)

(a)
(b)

Figure 4

( a) Taille des particules et (b) charge de surface de NPS CS préparés à 0,05 et 0,10% p / v et stockés à 4 ° C. Des nanoparticules ont été mises en suspension dans de l’eau distillée (pH compris entre 6 et 7).

3.4. Libération et intégrité in vitro de BSA

La figure 5(a) illustre que la libération de BSA pourrait être divisée en deux étapes en fonction du taux de libération. Dans la première étape, le BSA a été rapidement libéré du NPs CS et a montré une libération en rafale au cours des 6 premières heures. Cela a entraîné une libération cumulative de BSA de 45% ± 5. Dans la deuxième étape, le BSA a été lentement libéré de 6 h à 48 h, ce qui a entraîné un rejet cumulé de BSA de plus de 60%. L’intégrité de la BSA libérée par les NPS CS a été évaluée par la PAGE de la FDS et est illustrée par la figure 5 (b). Les bandes observées ont confirmé que les BSA ayant subi les processus de chargement et de rejet à 37 ° C après les jours 1 et 2 n’étaient pas différents de ceux des étalons BSA fraîchement préparés. Par conséquent, on pourrait conclure que le BSA est resté sous sa forme native dans le NPS CS dans les conditions expérimentales.

(a)

(d)

(a)
(b)

Figure 5

( a) Le profil de libération des NPS CS chargés par BSA à un rapport DS: CS de 1: 1 à pH 7.4, . (b) Analyse de la PAGE de la FDS de la BSA libérée par les NPS CS: (M) normes de la PAGE de la FDS (BIO-RAD); (A) Norme de la BSA 1 mg / mL; (B) norme de la BSA 0,2 mg / mL; (C) vierge; (D) NPS CS déchargés; (E) et (F) BSA libérée par les NPs CS (rapport DS: CS de 1: 1) aux jours 1 et 2.

3.5. Libération in vitro d’ARNsi

La figure 6 illustre que la libération d’ARNsi pourrait être divisée en deux étapes en fonction du taux de libération. Dans la première étape, le siRNA a été rapidement libéré du CS NPs et a montré une libération en rafale dans les 6 premières heures. Cela a entraîné une libération cumulative d’ARNsi de 58% ± 5. Dans la deuxième étape, l’ARNsi a été lentement libéré de 6 h à 48 h, ce qui a entraîné une libération cumulée de BSA de plus de 85%.

Figure 6

Le profil de libération de NPs CS chargés par siRNA à un rapport DS: CS de 1: 1 à pH 7,4,.

4. Discussions

La méthode utilisée pour produire des NPS CS dans la présente étude est un procédé doux, et elle permet de contrôler la taille des particules en faisant varier certains paramètres par exemple, la concentration en sels ajoutés, la viscosité, la quantité de non-solvant et le poids moléculaire du polymère. Cette étude a été lancée avec l’investigation pour obtenir des informations sur l’état électrique des groupes ionisables de NPs CS en déterminant le temps de stabilisation de l’e.d.l. Cette étape est importante pour obtenir des résultats fiables et reproductibles. Les données obtenues suggèrent que la formation d’e.d.l stable. pendant la préparation des nanoparticules, il a fallu quelques instants après l’arrêt de l’agitation. Ces moments étaient nécessaires pour que les électrolytes pénètrent vers le noyau des particules. Ainsi, un temps d’attente de 40 min était nécessaire avant que des NPS CS puissent être mesurés avec précision. Cette conclusion était similaire à celle du NPS CS-tripolyphosphate (CS-TPP) qui suggérait le même temps d’attente.

Une étude a également été réalisée pour déterminer l’influence de la concentration en polymère sur la formation de particules. L’étude visait à établir la gamme de concentrations de polyélectrolytes pour produire des nanoparticules de la taille souhaitée. Pour étudier les effets des concentrations variables de CS et de DS sur la formation de nanoparticules, des solutions de CS et de DS de 0,1, 0,25 et 0,5% p/v ont été préparées. Volumes variables de solution DS (1, 2, 3, 4, 5, 5.8, et 10 mL) ont été mélangés avec 5 mL de chaque concentration de CS (0,1–0,5% p/v). La concentration finale de CS et de DS a été calculée et les tailles des échantillons ont été classées entre 100 et 500, 501 et 1000 ou plus de 1000 nm. Il a été constaté que la taille des particules était affectée par la concentration de DS. Cette constatation est corroborée par les résultats des NPS du CS-TPP. En général, la taille désirée des nanoparticules confinées entre 100 et 1000 nm. Cependant, des études antérieures ont montré que les nanoparticules chargées produiraient normalement une taille plus grande que les nanoparticules vides. La taille inférieure à 500 nm est donc favorable.

De plus, les résultats ont révélé que seule une concentration de DS de 0,05% p / v était capable de produire des nanoparticules de taille de particule inférieure à 500 nm comme indiqué dans le tableau 1. On s’y attendait, car lorsque les deux polymères étaient en faibles concentrations, l’ajout de DS au CS entraînait la formation de petits noyaux coacervés. Contrairement à cela, de gros coacervats dont la taille dépassait 1000 nm avaient tendance à se former lorsque la concentration des deux polymères augmentait à 0,25% ou plus. La capacité du chitosane à former spontanément du coacervat est due à l’interaction de polyélectrolytes chargés de manière opposée pour former un complexe de polyélectrolytes à solubilité réduite. Le mélange de forte concentration de DS et de CS est donc plus susceptible d’affecter l’enchevêtrement des chaînes de CS et la solubilité du complexe résultant. En conséquence, un degré élevé de complexation et de coacervat sera produit. La diminution de la viscosité à une concentration plus faible de CS a également entraîné une meilleure solubilité. Cela a permis une interaction plus efficace entre le CS cationique et les ions chargés de manière opposée, et donc une taille de particule plus petite a été produite. De plus, une augmentation et un excès de la masse molaire du polyanion utilisé ont entraîné des particules plus grosses car des complexes hautement neutralisés se sont formés et ils ont eu tendance à floculer. Dans cette étude, la charge de surface des particules du système nanoparticulaire dépendait du rapport pondéral DS et CS. On a constaté que la charge de surface des particules augmentait à mesure que le rapport diminuait. Cette relation pourrait être utile pour obtenir la densité de charge de surface des particules souhaitée afin de faciliter les propriétés d’adhésion et de transport des nanoparticules.

Dans la présente étude, l’incorporation de BSA dans des NPS CS a été obtenue en mélangeant simplement la solution acide de CS contenant des molécules de BSA dissoutes avec la solution de DS à température ambiante sans ajout de stabilisant. La BSA est fréquemment utilisée comme protéine modèle car elle épouse les caractéristiques générales des autres protéines et elle est biocompatible pour l’homme. Il a été constaté que les NPS CS étaient relativement plus grands après le chargement avec BSA. On s’attendait à ce que la taille des particules augmente lorsque le BSA était chargé avec succès dans des nanoparticules. Cette tendance peut être due au poids moléculaire et à la taille des molécules de BSA ajoutées. Ces grandes tailles de particules peuvent limiter leur utilisation dans l’apport de protéines. Les nanoparticules de 150 à 300 nm se trouvent principalement dans le foie et la rate. En outre, selon certains rapports, l’exigence de taille “idéale” pour les nanoparticules développées pour le traitement du cancer se situe entre 70 et 200 nm. Bien que les nanoparticules ne doivent pas dépasser 150 nm pour franchir la barrière endothéliale, la littérature rapporte toujours la pénétration de particules plus grandes que les limites des fenêtres. En effet, la fenestration et le système vasculaire peuvent subir des modifications dans diverses conditions pathologiques.

Par exemple, la croissance tumorale induira le développement d’une néovascularisation caractérisée par un endothélium discontinu avec de grandes fenestrations de 200 à 780 nm. De plus, il a été observé que la charge de surface des particules des nanoparticules chargées en BSA était plus élevée que celles vides. Cela peut être dû à la caractéristique cationique que possède le BSA lorsqu’il est présent à l’état acide. Les charges positives des molécules CS et BSA ont donc contribué à une valeur plus élevée de la charge de surface des particules pour les nanoparticules chargées.

Les polymères cationiques chargés positivement peuvent se lier et protéger efficacement les acides nucléiques tels que l’ADN, les oligonucléotides et les ARNSI. Dans cette étude, l’incorporation de siRNA dans le NPS CS a été obtenue en mélangeant simplement la solution acide de CS avec la solution de DS contenant du siRNA à température ambiante. Il a été constaté que la taille des particules de NPS CS était relativement plus petite après le chargement avec l’ARNsi. La plus petite taille des NPS CS chargés d’ARNSI pourrait être due à la neutralisation des charges négatives d’acide nucléique par un polymère cationique, ce qui donne des nanoparticules condensées de plus petite taille. Les NPS CS chargés par siRNA ont également montré un potentiel zêta plus élevé que les NPS CS vierges, suivant la même tendance que celle des NPS CS chargés par BSA.

Idéalement, un système d’administration réussi devrait comporter un degré élevé d’association de médicaments. Les NPS CS chargés par siRNA ont montré une efficacité de piégeage plus élevée (< 90%) pour tous les rapports pondéraux DS: CS. L’efficacité de piégeage des nanoparticules à un rapport pondéral DS: CS de 1: 1, 1,5 : 1, et 2: 1 était supérieur au rapport pondéral de 0,5: 1. Ce phénomène était très probablement dû à une proportion plus élevée de DS présentée dans les nanoparticules. Comme plus de DS ont ajouté, cela faciliterait l’piégeage de plus de BSA dans des nanoparticules. Cela pourrait s’expliquer par le fait que BSA est une molécule zwitterionique. Au pH du milieu de formulation de 3,5 à 4,0, la solubilité du BSA pourrait être fortement augmentée en raison de l’augmentation des charges positives qu’il possède. Ainsi, BSA serait capable de se fixer électrostatiquement et de se charger de manière stable dans les nanoparticules. En solution acide, BSA pourrait posséder une charge positive et rivaliser avec CS pour interagir électrostatiquement avec DS. Cette constatation a été corroborée par l’augmentation des charges de surface positives des NPS CS chargés par BSA par rapport aux NPS non chargés. De plus, il existe des sites multi-ioniques sur BSA, et cette caractéristique pourrait faciliter l’incorporation de BSA dans des nanoparticules. Cette constatation diffère de celle des IP du CS-TPP.

Dans l’étude, l’interaction électrostatique était présente entre BSA et CS, au lieu de BSA et de TPP. Il a également été suggéré que le BSA devrait se dissoudre dans une solution dont le pH est supérieur à son point isoélectrique afin que le BSA possède une charge négative et interagisse avec les molécules de CS chargées positivement. Cette découverte a donc démontré que l’interaction électrostatique est le principal facteur contribuant à favoriser l’incorporation de la BSA dans les nanoparticules, soit via l’interaction CS-protéine, soit par l’interaction DS-protéine.

TEM permet la visualisation à l’échelle nanométrique de nanoparticules individuelles et fournit des informations de taille et de morphologie. La morphologie des particules est un facteur important pour la stabilité colloïdale et chimique ainsi que pour la bioactivité des nanoparticules. Les NPS CS chargés de siRNA présentaient une morphologie irrégulière; cependant, les NPs CS chargés de BSA présentaient une morphologie allongée. Cela pourrait être dû à une plus grande taille de BSA qui peut s’emmêler ou agir comme un bouclier contre le CS, limitant ainsi l’exposition globale du CS à l’intérieur de la structure.

Le profil de stabilité des NPS CS lors du stockage est également important. Ces informations pourraient fournir une vue sur la stabilité des nanoparticules sous différents milieux et à différentes températures. La stabilité des nanoparticules a été étudiée en évaluant leur variation de la taille moyenne des particules et de la charge de surface au fil du temps. Dans un premier temps, les nanoparticules ont été remises en suspension dans de l’eau distillée à pH 6,6 qui a été filtrée par un filtre de 0,2 µm pour éliminer d’éventuels contaminants présents dans l’eau. Pour cette étude, seules des nanoparticules composées de 0,05 et 0,10 % p/v de DS ont été testées. Les autres concentrations de DS n’ont pas été déterminées en raison de l’augmentation de la taille des particules après centrifugation. La taille des particules était jusqu’à nm et nm pour 0,15% et 0,20% p / v DS, respectivement. L’augmentation de la taille des particules peut, en raison des NPS CS eux-mêmes, s’éroder et perdre leur forme sphérique dans un environnement aqueux, et par conséquent, le diamètre moyen des particules augmenterait en réponse à cette érosion. De plus, les charges de surface des particules pour les nanoparticules fabriquées à partir des deux concentrations diminuaient avec le temps. On soupçonne que le CS peut être dégradé en milieu aqueux même en l’absence de lysozymes. Les résultats ont montré que les NPS CS étaient plus stables lorsqu’ils étaient stockés à 4 ° C car leur taille de particules et leur charge de surface étaient inchangées ou légèrement modifiées jusqu’à 14 jours. Les résultats suggèrent également que les NPS CS ne devraient pas être stockés à température ambiante car ils sont sujets à la dégradation. Les résultats suggèrent donc que les NPS CS stockés à température ambiante sont plus sujets à la dégradation que ceux stockés dans un environnement frais. C’était probablement dû à l’environnement frais qui peut ralentir le mouvement cinétique des nanoparticules. Ainsi, les nanoparticules pourraient conserver leur forme sphérique et l’érosion serait moins susceptible de se produire. De plus, il a été observé que ces nanoparticules étaient agrégées dans du PBS à pH 7,4. Cela peut être attribué à une charge de surface de particules plus faible des nanoparticules dans le PBS, proche du neutre. La charge de surface des particules qui est tombée à zéro peut indiquer que les NPS CS ont subi une annulation de charge par des groupes phosphate de PBS. L’état de charge neutre de ces nanoparticules peut entraîner une perte de forces intra et intermoléculaires, importantes pour maintenir les nanoparticules individuellement. En conséquence, ces nanoparticules non chargées peuvent commencer à s’agréger et à déstabiliser le système colloïdal. Contrairement au PBS, l’eau distillée peut fournir de nombreux ions hydrogène pour former des liaisons hydrogène qui peuvent aider à briser l’agrégation des nanoparticules en interagissant avec des groupes ionisables de NPS CS.

L’étude de libération in vitro de BSA et de siRNA à partir de NPs CS a été réalisée en tampon Tris-HCL. La libération de BSA et de siRNA pourrait être divisée en deux étapes en fonction du taux de libération. Dans la première étape, le médicament a été rapidement libéré de CS NPs. La libération de BSA et d’ARNsi à ce stade pourrait impliquer la diffusion de BSA/ARNsi liés à la surface des particules. Dans la deuxième étape, le BSA / siRNA a été libéré lentement en raison du gonflement ou de la dégradation du polymère. Le BSA / siRNA restant dans les NPS CS ne serait pas complètement libéré tant que les particules n’auraient pas été complètement érodées ou dissoutes dans un milieu de libération. Cela pourrait être dû à l’interaction entre le groupe BSA / siRNA restant et le groupe amino libre sur les segments CS. De plus, le système synthétisé qui a été précédemment décrit comme pouvant être formulé dans des conditions douces assurait que la stabilité des protéines chargées en NPS CS était intacte telle que déterminée par SDS-PAGE.

5. Conclusions

En résumé, cette étude montre que la concentration en CS et en DS ainsi que le pH étaient les paramètres contrôlant la taille des particules et la charge de surface des NPs CS. Des nanoparticules inférieures à 500 nm ont pu être obtenues à un rapport pondéral DS:CS de 0,5:1 à pH 4. Dans le cas du piégeage par BSA, les nanoparticules avec des rapports pondéraux DS: CS plus élevés ont une efficacité de piégeage supérieure à 88%. Le pourcentage le plus élevé d’efficacité de piégeage atteint était de 0,10% p / v DS (rapport DS: CS de 1: 1). Cependant, les NPS CS chargés d’ARNsi ont montré une efficacité de piégeage élevée (> 90%) pour tous les rapports DS: CS. Il a été constaté que la température de stockage et le milieu de suspension étaient les facteurs susceptibles d’influencer la stabilité des NPS CS. Les NPS CS étaient labiles et ont tendance à se déstabiliser à température ambiante, mais ils retiennent ce comportement labile lorsqu’un environnement frais (2-4 ° C) est fourni. De plus, les NPS CS avaient une meilleure stabilité dans l’eau distillée que dans le PBS, ce qui pourrait être dû aux liaisons hydrogène qui se sont formées entre les molécules d’eau et les groupes ionisables de NPS CS.

Conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts personnel ou financier dans la recherche en cours.

Remerciements

Les auteurs remercient la “Dana Lonjakan Penerbitan” de l’Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM-DLP-2011-001) pour le financement et le soutien du projet de recherche en cours.