Frontiers in Genetics

Der alkalische comet Assay (single cell gel electrophoresis) ist die am weitesten verbreitete Methode zur Messung von DNA-Schäden in eukaryotischen Zellen (Neri et al., 2015). Es erkennt Strangbrüche (SBs) und alkali-labile Stellen bei Frequenzen von einigen hundert bis zu mehreren tausend Brüchen pro Zelle — ein biologisch nützlicher Bereich, der sich von niedrigen endogenen Schadensniveaus bis hin zu Schäden erstreckt, die experimentell verursacht werden können, ohne Zellen abzutöten. Verdauung der Nukleoide nach Lyse mit bestimmten läsionsspezifischen Reparaturendonukleasen ermöglicht die Messung anderer Schäden als SBs; Insbesondere Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase (FPG) wurde häufig verwendet, um veränderte Purine nachzuweisen, die vom Enzym in DNA umgewandelt werden. Kürzlich (Cortés-Gutiérrez et al., 2014) entwickelten einen zweidimensionalen Two-Tailed Comet Assay (TT-comet), der zwischen einzelsträngigen (SSBs) und doppelsträngigen DNA-Brüchen (DSBs) in denselben Kometen in Spermien unterscheiden kann.

Seit dem ersten Bericht von Ostling und Johanson (1984) ist der Comet-Assay in der Genotoxizitätsprüfung von Chemikalien sowohl in In-vitro- als auch In-vivo-Modellen weit verbreitet. Ein Vorteil bei letzterem ist, dass Zellen aus verschiedenen Geweben in einer Vielzahl von eukaryotischen Organismen untersucht werden können. In den letzten 15 Jahren wurde der Comet-Assay in Drosophila melanogaster ausgiebig eingesetzt, um die Genotoxizität von Chemikalien zu testen (Gaivão und Sierra, 2014). Dieser Ansatz ist sehr nützlich, da Drosophila melanogaster ein wertvolles Modell für alle Arten von Prozessen im Zusammenhang mit der menschlichen Gesundheit ist, einschließlich DNA-Schadensreaktionen.

Die Verwendung von Pflanzen sowie einer Vielzahl terrestrischer und aquatischer Arten im Comet-Assay hat in den letzten zehn Jahren dramatisch zugenommen (Costa et al., 2014; de Lapuente et al., 2015; Santos et al., 2015), insbesondere in der Umweltrisikobewertung (ERA). Eine kürzlich durchgeführte Validierungsstudie hat gezeigt, dass der In-vitro-Comet-Assay in Kombination mit FPG eine wirksame ergänzende Evidenzlinie in ERA sein kann, selbst in besonders schwierigen natürlichen Szenarien wie Mündungsumgebungen (Costa et al., 2014).

In den letzten zehn Jahren hat die Herstellung und Verwendung von Materialien in Nanogröße erheblich zugenommen, und infolgedessen auch die Exposition des Menschen gegenüber diesen Arten von Materialien. Das Erkennen und Verstehen der Gefahren von Nanomaterialien (NMs) in Bezug auf die menschliche Gesundheit ist keine einfache Angelegenheit. Nicht nur die chemische Zusammensetzung von NMs ist für ihre Genotoxizität verantwortlich, sondern auch Form, spezifische Oberfläche, Größe, Größenverteilung und Zetapotential bestimmen die Auswirkungen dieser Materialien auf das Genom. Obwohl es immer noch eine Debatte über die Eignung von Standard-Genotoxizitätstests zur Untersuchung der Auswirkungen von NMs gibt, war der Comet-Assay aufgrund seiner Robustheit, Vielseitigkeit und Zuverlässigkeit die bisher am häufigsten verwendete Methode in der Nanogenotoxikologie (Azqueta und Dusinska, 2015). Neben der Untersuchung der Genotoxizität von Strahlung und verschiedenen Chemikalien wurde der Plant comet Assay kürzlich auch zur Untersuchung der genotoxischen Auswirkungen von NPs eingesetzt (Santos et al., 2015).

Eine weitere Anwendung des Comet-Assays ist ein wertvolles experimentelles Werkzeug für das Human-Biomonitoring sowie in klinischen Studien. Das Sammeln von Blut oder Geweben ist nicht immer bei allen Menschen möglich, und andere Quellen von Zellen, die nicht-invasiv gesammelt werden können, wurden mit dem Comet-Assay getestet; zum Beispiel verschiedene Arten von Epithelzellen (Rojas et al., 2014) sowie Spermien (Cortés-Gutiérrez et al., 2014; Brunborg et al., 2015).

Parallel zur Entwicklung des Comet—Assays zur DNA—Schadensmessung wurden Assays zur DNA-Reparatur – ein wesentliches Element der genotoxischen zellulären Reaktion – entwickelt. Der einfachste Ansatz zur DNA-Reparaturmessung besteht darin, Zellen mit einem DNA-schädigenden Mittel zu behandeln und sie dann zu inkubieren, damit die Reparatur fortgesetzt werden kann, wobei die Menge des verbleibenden Schadens in Intervallen gemessen wird. Ein alternativer, biochemischer Ansatz zur Beurteilung der Reparaturkapazität wurde 1994 beschrieben (Collins et al., 1994), und seitdem wurden verschiedene modifizierte Versionen des Assays zur Messung sowohl der Basenexzisionsreparatur (BER) als auch der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) veröffentlicht (rezensiert von Azqueta et al., 2014). Dieser biochemische Ansatz wurde angewendet, um die Auswirkungen von Umwelt, Ernährung, Lebensstil und Beruf auf die DNA-Reparaturkapazität zusätzlich zu klinischen Untersuchungen zu untersuchen (Azqueta et al., 2014).

Dieser alternative In-vitro-Ansatz zur DNA-Reparatur bewertet die Reparaturaktivität eines Zellextrakts auf einem DNA-Substrat, das definierte Läsionen enthält. Der Comet-Assay wird verwendet, um die Akkumulation von DNA-Brüchen (Reparaturzwischenprodukten) mit der Inkubationszeit zu verfolgen. Kürzlich haben Slyskova und Kollegen als erste die In-vitro-DNA-Reparaturtests für BER und NER erfolgreich auf menschliche Gewebeproben angewendet; speziell kolorektale Karzinombiopsien (Slyskova et al., 2012, 2014).

Eine andere Art von DNA-Reparatur-Assay, mit dem Zellen, die in das Gel eingebettet sind, vor der Lyse repariert werden können, wurde kürzlich eingeführt, um die DNA-Reparaturkinetik genauer zu untersuchen; insbesondere um die Regulation von BER-Proteinen durch posttranskriptionelle Modifikationen zu untersuchen (Nickson und Parsons, 2014). Eine weitere Möglichkeit, die DNA-Reparatur auf der Ebene spezifischer Gene zu untersuchen, ist die Comet-FISH-Technik, bei der fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden verwendet werden, die mit der einzelsträngigen DNA im Kometenschwanz hybridisieren. McAllister et al. (2014) untersuchten mit dieser Methode die bevorzugte Strangbruchreparatur in Bulk-DNA sowie in ausgewählten Regionen mit aktiv transkribierten Genen.

Die Untersuchung der Kinetik der Reparatur induzierter Schäden wird zu unserem Verständnis der zellulären Reaktionen auf genotoxische Chemikalien beitragen. Darüber hinaus kann die Bedeutung der DNA-Reparatur als Akteur im (anti-) krebserzeugenden Prozess aufgeklärt werden, indem die Reparatur auf der Ebene spezifischer Krebszielgewebe betrachtet wird. Die Regulation der Reparatur — und anderer Aspekte der zellulären Reaktion auf genotoxische Verbindungen – wird wahrscheinlich epigenetische Mechanismen beinhalten, und der Comet-Assay wurde erfolgreich eingesetzt, um Änderungen des globalen DNA-Methylierungsmusters in einzelnen Zellen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen zu messen (Lewies et al., 2014).

Prozent Schwanz—DNA wird als bester Deskriptor für DNA—Bruchhäufigkeiten empfohlen, da die genannten Kometen – und das Ausmaß der Schädigung – leicht visualisiert werden können. Viele Forscher bevorzugen jedoch immer noch die Verwendung des Schwanzmoments (Møller et al., 2014). Tatsächlich werden die beiden Deskriptoren in ähnlicher Weise von den Assaybedingungen beeinflusst (Azqueta et al., 2011; Ersson und Möller, 2011).

Variabilität im Comet-Assay ist ein wichtiges Thema, unabhängig davon, ob es sich um die Verwendung verschiedener Protokolle oder um unkontrollierbare oder zufällige experimentelle Variationen handelt. Die Einbeziehung von Referenzstandards in alle Experimente wird empfohlen, insbesondere wenn eine große Anzahl von Proben — beispielsweise aus einer Biomonitoring—Studie – zu verschiedenen Anlässen analysiert wird. Referenzstandards sind Zellen mit einer bekannten Menge an DNA-Schäden; entweder unbehandelte Zellen (Negativkontrolle), röntgenbelichtete Zellen (Positivkontrolle) oder mit Photosensibilisator plus Licht behandelte Zellen (Positivkontrolle für Assays einschließlich FPG-Inkubation), Batch-präpariert und als Aliquots eingefroren. Wenn in einem Versuchslauf erhebliche Abweichungen in den Standards auftreten, können die Probenergebnisse normalisiert werden (Collins et al., 2014). Wenn Referenzstandards zwischen Laboratorien ausgetauscht werden, können Ergebnisse aus diesen Laboratorien leichter verglichen werden.

Referenzstandardzellen werden normalerweise in Gelen parallel zu Probengelen gesetzt. Interne Standards – d.h., Standardzellen im selben Gel wie Probenzellen – wäre ideal; aber es ist natürlich wichtig, die beiden Zelltypen unterscheiden zu können. Fischzellen, die entweder größer oder kleiner in der Genomgröße im Vergleich zu menschlichen Zellen sind, wurden erfolgreich für diesen Zweck angenommen (Brunborg et al., 2015). Diese Referenzzellen können in Kombination mit einer Standard- oder Kalibrierkurve verwendet werden (die mit Zellen erstellt wird, denen unterschiedliche Dosen ionisierender Strahlung verabreicht werden), wodurch eine genauere Quantifizierung von DNA-Läsionen ermöglicht wird, die als DNA-Bruchhäufigkeit und nicht als% der DNA ausgedrückt werden.

Statistiken sind ein wichtiges Werkzeug in allen Anwendungen des Comet-Assays, um zu überprüfen, ob kleine Unterschiede zufällig auftreten. Prägnante Beschreibungen statistischer Analysen und Empfehlungen für Tests wurden veröffentlicht (Lovell et al., 1999; Lovell und Omori, 2008). Møller und Loft (2014) erinnern uns daran, dass bei der Planung von Experimenten ein angemessenes Studiendesign und eine angemessene statistische Aussagekraft sorgfältig berücksichtigt werden sollten, um die statistische Analyse des Comet-Assays einfach zu halten.

Wie bei allen biologischen Assays ist die Datenintegration entscheidend, um die Comet-Assay-Ergebnisse im größeren Bild zu interpretieren. Die Integration der vom Comet-Assay bereitgestellten Informationen mit anderen DNA-Schadensindikatoren und zellulären Reaktionen (z. B. oxidativer Stress, Zellteilung oder Zelltod) wurde sowohl im ERA angewendet (Costa et al., 2014; Santos et al., 2015) sowie Humanstudien (Biomonitoring) (z.B. Langie et al., 2010; Slyskova et al., 2012). Auch die Einbeziehung von “Omics” -Daten wird dazu beitragen, die Wirkungsweise genotoxischer Verbindungen zu entschlüsseln (Slyskova et al., 2012, 2014; Santos et al., 2015) – obwohl es erwähnenswert ist, dass mehrere Studien gezeigt haben, dass phänotypische Maßnahmen der DNA-Reparatur nicht unbedingt mit genomischen oder transkriptomischen Daten korrelieren (Collins et al., 2012; Slyskova et al., 2012, 2014); Die verschiedenen Ansätze sollten als komplementär betrachtet werden.

Selbst nach drei Jahrzehnten der Entwicklung und Modifikation ist der Comet-Assay immer noch ein ziemlich einfacher, vielseitiger, aber arbeitsintensiver Assay. Verschiedene Hochdurchsatzmodifikationen des Assays wurden kürzlich überprüft (Brunborg et al., 2014). Sowohl In-vivo- als auch In-vitro-Anwendungen würden von weiteren Verbesserungen der Effizienz, der Standardisierung des Protokolls und des Durchsatzes profitieren. Automatisierung und Miniaturisierung sind in vielen Bereichen der Biologie gängige Strategien, die Änderungen der Anzahl der pro Experiment analysierten Proben um Größenordnungen ermöglichen, subjektive Verzerrungen verringern und die Reproduzierbarkeit verbessern.

Also – worauf können wir in den nächsten 30 Jahren hoffen? Akzeptanz des In-vitro-Comet-Assays für Genotoxizitätstests, kostengünstiges automatisiertes Comet-Scoring, um Forscher vor endloser mikroskopischer Betrachtung zu bewahren, Protokollstandardisierung (vielleicht) und zuverlässige interne Referenzstandards, mehr Human-Biomonitoring-Studien zur DNA-Reparatur (Akzeptanz, dass phänotypische Assays einen wichtigen Platz neben Genomik und Transkriptomik einnehmen), Umweltüberwachung unter Verwendung einer Vielzahl von Tier- und Pflanzenarten; und viele weitere unvorhersehbare Entwicklungen und Anwendungen.

Interessenkonflikterklärung

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagung

Wir möchten uns bei allen Autoren sowie Rezensenten und Herausgebern bedanken, die zu diesem Grenzforschungsthema beigetragen haben. SL ist Empfänger eines Postdoktorandenstipendiums des AXA Research Fund und des Cefic-LRI Innovative Science Award 2013. AA dankt dem Ministerio de Economía y Competitividad (‘Ramón y Cajal’-Programm, 2013) der spanischen Regierung für die persönliche Unterstützung.