a kitozán nanorészecskék mint stabil gyógyszeradagoló rendszer fejlesztése fehérje/siRNS számára

absztrakt

a kitozán nanorészecskék (CS NPs) jó fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek, mint gyógyszeradagoló rendszerek. A tanulmány célja a CS NPs fizikai jellemzőire és kolloid stabilitására vonatkozó preparatív paraméterek modulációjának meghatározása. A CS NP-ket Ionos interakcióval állították elő dextrán-szulfát (DS) tárolási stabilitásuk meghatározása előtt. Az nm legkisebb CS NP-jét MV felületi töltéssel akkor állítottuk elő, amikor a CS-t és a DS-t 4 pH-n keverték, 0,5 : 1 DS : CS tömegaránnyal. 98% – os befogási hatékonyságot értek el, amikor a BSA/siRNS-t betöltötték a nanorészecskékbe. Az eredmények azt is kimutatták, hogy a részecskeméret és a CS NPs felületi töltése kissé megváltozott 2 hétig, amikor 4CC-n tárolták. nagyobb részecskeméretet és felületi töltést kaptunk a DS koncentrációjának növelésével. Összefoglalva, az NP-k kellően stabilak voltak, ha 4CC-n tartották őket, és képesek voltak a fehérje hordozására és védelmére.

1. Bevezetés

az endogén peptidek, a fehérjék és az oligonukleotidok a legfontosabb gyógyszerek közé tartoznak, amelyek nagy potenciállal rendelkeznek a krónikus betegségek kezelésében . Az emberi test szélsőséges in vivo környezete azonban mindig korlátozta ezen anyagok terápiás alkalmazását . A polimer nanorészecskék nagy figyelmet szenteltek a szállítási rendszereknek, mivel képesek legyőzni a fiziológiai akadályokat, és megvédeni és megcélozni a betöltött anyagokat bizonyos sejtekhez . A természetben előforduló polimerek, például a kitozán (CS) nanorészecskék képződését vizsgálták . A CS egy biológiailag lebomló poliszacharid, amely a kitin dezacetilezéséből származik . Biokompatibilitása mellett alacsony toxicitása, vérzéscsillapító és bakteriosztatikus tulajdonságai is hozzájárulnak a gyógyszerészeti alkalmazásokhoz . Számos aniont vizsgáltak a CS, például a nátrium-szulfát és a dextrán-szulfát (DS) térhálósítására . A DS képes módosítani a fehérje és az siRNS befogási hatékonyságát (ee) keményítőszerek használata nélkül, és magas töltéssűrűsége miatt szabályozza a gyógyszer felszabadulásának sebességét . Amellett, hogy a DS olcsó anyag, mechanikusan stabilabb nanorészecskéket állít elő, mint a pentanátrium-tripolifoszfát (TPP) .

számos tanulmány számolt be a kitozán nanorészecskék (CS NPs) egyedi tulajdonságairól DS alkalmazásával. A preparatív paraméterek fizikai jellemzőikre gyakorolt modulációját azonban még mindig nem vizsgálták teljes körűen, például a DS szterikus akadálynak a CS és a BSA közötti elektrosztatikus vonzásra gyakorolt hatását . Ezenkívül a sikeres gyógyszeradagoló rendszer meghatározója a fizikai tulajdonságaitól és stabilitásától függ. Ezért a jelen tanulmány célja az volt, hogy modulálja a preparatív paramétereket a CS NPs nanosizált részecskéinek előállításához és kolloid stabilitásuk meghatározásához különböző tárolási hőmérsékleteken és különböző szuszpenziós közegekben.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Anyagok

kis molekulatömegű kitozánt (70 kDa dezacetilezési fok 75-85%), jégecetsavat, foszfátpufferelt sóoldatot (PBS), szarvasmarha szérumalbumint (BSA, 46 kDa) és Bradford reagenst vásároltak a Sigma-Aldrich Inc. – től., USA. A kettős szálú siRNA-t (sense: 5′-GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUAUUU-3′, antisense: 3′-UACAUAACCGGACAUAAUCUU-5′) Az Amerikai Thermoscientific Dharmacon-tól vásárolták. Dextrán-szulfát (DS) vásárolt Fisher Scientific, Egyesült Királyság. Protein létra (High range), Laemmli mintapuffer, 10x tris/glicin/nátrium dodecil-szulfát puffer, ammónium-perszulfát, tetrametilén-diamin (TEMED), 2% bisz oldat és 40% akrilamid oldat vásárolták Bio-Rad, USA. A Tris-HCl puffert az Invitrogen-től (USA) szerezték be. Az összes többi felhasznált vegyi anyag analitikai minőségű volt.

2.2. A vakpróba és a BSA-val töltött CS NPs

CS és DS oldatot 1 térfogatszázalékos ecetsavban, illetve desztillált vízben oldottuk. a CS oldat pH-ját 4-es pH-ra állítottuk be 1 M NaOH vagy 1 M HCl hozzáadásával. DS megoldás (0,05%, 0,1%, 0.15%, 0,2% és 0,25% w/v) cseppenként CS oldatba (0,1% w/v) adtunk mágneses keverés közben (WISESTIR Digital Multipoint Magnetic Stirrer MS-MP8, Daihan Scientific, Korea) 250 fordulat / perc sebességgel 15 percig nanorészecskék képződéséhez. Minden mintát három példányban készítettünk. Az így kapott nanorészecskéket ultracentrifugálással (Optima L-100 XP Ultracentrifuge NV 70.1 rotorral, Beckman-Coulter, USA) mossuk és betakarítjuk kétszer 12 500 fordulat/perc sebességgel 15 percig 10 KB-nál.a BSA társulása CS NPs-be, a BSA-t CS-oldatban oldottuk (0,1% m/v, pH 4), Hogy 1 mg / mL végső koncentrációt kapjunk. A BSA-val töltött CS NP-ket ezután a fenti módszerrel állítottuk elő. A CS NPs-be történő siRNS-asszociációhoz a DS-oldathoz 3 (15) deionizált vízben lévő siRNS-t (15) adtunk (0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0,25% w / v), mielőtt cseppenként hozzáadná a CS oldathoz (0,1% w/v).

2.3. Elektroforetikus mobilitási vizsgálat

a CS NPs elektroforetikus mobilitási méréseit () Nano zs (Malvern Instruments, Egyesült Királyság) Zetazizátorral végezték, és a várakozási idő alapján mérték. Minden mintát három példányban elemeztünk.

2.4. Nanorészecskék jellemzése

a frissen elkészített CS NPs részecskeméretét, felületi töltését és polidiszperzitási indexét (PDI) Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK) segítségével mértük, a Fotonkorrelációs spektroszkópia (pcs) technikák alapján. Az elemzés során nem végeztek hígítást. Minden mintát három példányban elemeztünk. A méréseket 25 C.

2.5-nél végeztük. Morfológiai elemzés

terheletlen CS NPs, BSA/siRNS betöltött CS NPs morfológiai jellemzése (DS : CS tömegarány 0,5 : 1, 1 : 1) transzmissziós elektronmikroszkóppal (TEM), Tecnai Spirit, FEI, Eindhoven (Hollandia).

2.6. BSA / siRNS befogási hatékonyság

a BSA/siRNS betöltött CS NP-ket ultracentrifugálással választottuk el az oldattól (Optima L-100 XP Ultracentrifuge NV 70.1 rotorral, Beckman-Coulter, USA) 14000 fordulat / perc sebességgel 30 percig. A centrifugálás során visszanyert felülúszókat dekantáltuk. A felülúszó BSA-tartalmát UV-Vis spektrofotométerrel elemeztük 595 nm-en (U. V-1601; Shimadzu, Japán) a Bradford protein assay alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint. a felülúszó siRNS-tartalmát UV-Vis spektrofotométerrel elemeztük 260 nm-en. A mintákat három példányban készítettük el és mértük. A BSA / siRNS befogási hatékonyságát (EE) a következő egyenlet segítségével számítottuk ki:

2.7. Stabilitása CS NPs

frissen elkészített CS NPs (készült 0,05% és 0,1% m / v DS és CS oldat, ill.) 12 500 fordulat / perc sebességgel centrifugáltuk 15 percig tárolás előtt. Ultracentrifugálás után a kapott pelleteket vagy desztillált vízben (mért pH 6,6) vagy PBS pH 7,4-ben reszuszpendáltuk. A részecskeméretet és a felületi töltést előre meghatározott tárolási idő alatt mértük (0, 1, 2, 3, 5, 8, és 14 nap), és vagy környezeti hőmérsékleten, vagy 4 6578 C.

2.8. In Vitro Gyógyszerleadási vizsgálat

a BSA/siRNS felszabadulását a legmagasabb EE-vel rendelkező CS NPs-ből határozták meg (DS : CS arány 1 : 1, EE = 98%, 0,2, ill.). A BSA / siRNS betöltött CS NP-ket Tris-HCl pufferoldatban (pH 7,4, 4 mL) szuszpendáltuk, és egy mágneses keverőre helyeztük, 100 fordulat / perc keverési sebességgel 37 Kb-on (MS MP8 Wise Stir Wertheim, Németország) 48 órán át 37 Kb-n.előre meghatározott időközönként (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 20, 24, és 48 óra), a mintákat 14 000 fordulat / perc sebességgel centrifugáltuk 30 percen keresztül 10 6CC-on. Ezután a felülúszót dekantáltuk, és ezzel egyenértékű mennyiségű friss pufferoldattal helyettesítettük. A felülúszóban felszabaduló BSA/siRNS mennyiségét UV-Vis spektrofotométerrel (U. V-1601; Shimadzu, Japán) 280, illetve 260 nm hullámhosszon elemeztük.

2.9. BSA integritás

a CS NPs-ből felszabaduló BSA integritását SDS-PAGE (12% resolving and 10% stacking gel) határozta meg Mini-Protein System (Bio-Rad, USA) alkalmazásával. A BSA mintákat Laemmli mintapufferrel 1 : 1 arányban kevertük, majd 95 Ca-n 5 percig hevítettük. A mintákat (15 6CL) a kutakba töltöttük, és a gélt egy mini-Protein rendszerű Tetra cellával futtattuk 150 V állandó feszültséggel 90 percig, 25 mM-es Tris-t, 192 mM-es glicint és 0,1% SDS-t tartalmazó pufferrel 8,3 pH-n. A mintasávokat 40 percen át festettük 0,1% Coomassie blue oldattal, amely 40% ecetsavat és 10% metanolt tartalmaz, majd egy éjszakán át festettük 40% ecetsav és 10% metanol oldattal.

2.10. Statisztikai analízis

az összes adatot középértékként mutattuk be. A statisztikai elemzést (ANOVA-teszt és Tukey posthoc-analízise) a szociális (SPSS) program 15.verziójának statisztikai csomagjával végeztük. A < 0,05 érték szignifikáns különbséget mutatott a vizsgált csoportok átlaga között.

3. Eredmények

3.1. Részecskeméret és felületi töltés

az 1(a) ábra az elektromos mobilitás () eredményeit mutatja be a várakozási idő függvényében. A grafikonból megfigyelhető volt, hogy a megmaradt fennsík és állandó 30 perc után. Ez azt mutatja, hogy a stabil elektromos kettős réteg (e.d.l.) kialakulása nem volt pillanatnyi, hanem néhány pillanatot igényelt. A CS koncentráció és a DS végső koncentráció közötti, a CS NPs méretére gyakorolt hatásokat az 1(b) ábra mutatja be. Megfigyelték, hogy az 500 nm-nél kisebb méretű CS NP-k többségét alacsony CS-koncentrációban (0,1% w/v) kaptuk. A DS-koncentráció a nanorészecskék méretét is befolyásolta (). A részecskeméret növekvő tendenciája figyelhető meg a DS-koncentráció 0,05-ről 0,25% – ra történő növelésével.05% w / v (alacsony koncentráció) előállított nanorészecskék részecskemérete kisebb, mint 500 nm. Ezzel ellentétben nagy nanorészecskéket (>1000 nm) kaptunk, amikor mindkét polimer koncentrációját 0,25% – ra vagy annál magasabbra növeltük. Az eredmények alapján a következő vizsgálatokhoz 0,05-0,20% w/v DS-koncentrációt választottunk ki. Ezenkívül a DS : CS tömegarány növekedése (a rendszerben jelen lévő DS-ből származó negatív töltések nagyobb sűrűsége) a részecskeméret növekedéséhez, de a részecske felületi töltésének csökkenéséhez vezetett (1.táblázat (fent)). Mivel a CS tömege meghaladta a DS tömegét, +56,2 6,5 MV pozitív értéket kaptunk. A részecske felületi töltése azonban − mV-re csökkent, amikor negatívabb töltésű DS-t adtak hozzá. Folyamatosan csökkent, amikor a DS : CS súlyarány elérte a 2,5: 1-et. Ez várhatóan a nanorészecskék felületén felhalmozódott DS-molekulák feleslegének tudható be.

(a)

(b)

a)
b)

ábra 1

elektroforetikus mobilitás az idő függvényében (a) és a CS és DS végső koncentrációjának hatása a nanorészecskék részecskeméretére (b),.

az 1. táblázat (lent) azt mutatja, hogy a DS 0,2 tömeg% – a rendelkezett a legnagyobb részecskemérettel, miután BSA-val terhelték. A részecskeméret nm volt. A DS részecskemérete 0,1 és 0 koncentrációban.15% w / v is nagyobb volt, mint az üresek (). Másrészt a felszíni töltés magasabb pozitív értékeit figyelték meg a BSA terhelt nanorészecskéknél az üresekhez képest. Ezt minden DS-koncentrációnál megfigyelték. Ezenkívül magasabb EE értékeket lehet elérni a DS : CS tömegarány 0,5 : 1 fölé emelésével. A nanorészecskék EE-je 1 : 1, 1,5 : 1 és 2 : 1 DS : CS tömegarány mellett%, % és % volt. A legmagasabb EE értéket 1 : 1 arányú DS : CS tömegaránnyal kaptuk (1.táblázat (lent)).

a 2.táblázat azt mutatja, hogy a DS 0.2% m/v rendelkezett a legnagyobb részecskemérettel (900 60 nm), miután siRNS-t töltöttek be. az siRNS-ben betöltött CS NPs különböző DS koncentrációkban (0,05, 0,1, 0,15 és 0,2% w/v) kisebb részecskeméretet mutatott. A nanorészecskék EE-je DS-nél: CS tömegarány 0.5 : 1, 1 : 1, 1.5 : 1, a 2 : 1 pedig%,%, % és % volt.

3.2. Morfológia

a CS NPs képeit TEM-Mel kaptuk (2.ábra). A 2.A) és 2. B) ábra azt mutatja, hogy a terheletlen CS NP-k gömb alakú szerkezetet mutattak. A képek azt mutatták, hogy az siRNS-ből előállított nanorészecskék (2.E) és 2. F) ábra) szabálytalan morfológiát mutattak, azonban a BSA terhelt nanorészecskék hosszúkás morfológiát mutattak(2. C) és 2. d) ábra).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

ábra 2

TEM képek CS NPs. (A) és (b) kirakodott CS NPs 0,5 : 1 és 1 : 1, (c) és (d) BSA betöltött CS NPs 0,5 : 1 és 1 : 1, és (e) és (f) az siRNS 0,5 : 1, illetve 1 : 1 arányban töltötte be a CS NPs-t. Az összes kép 60 kX-os nagyítással készült.

3.3. A CS NPs tárolási stabilitása

mind a 0,05, mind a 0,10% w/v DS-ből készült nanorészecskék mérete idővel megnőtt, amint azt a 3(a) ábra mutatja, környezeti hőmérsékleten tárolva. A részecskeméret jelentős növekedését figyelték meg a tárolás 14. napja után, különösen 0,05% m / v DS esetén. Úgy gondolták, hogy ennek oka az aggregátumok kialakulása. Ez a megállapítás megerősítette a felületi töltés eredményeit, amelyek a felületi töltés majdnem semlegesre csökkenését mutatták. Ezzel szemben, amikor a részecskéket 4 (6) C-on tárolták, részecskeméretük és felületi töltésük 14 napig változatlan maradt a 0,10% (m/v) DS-ből készült nanorészecskék esetében. Enyhe változást figyeltek meg 0,05% (m/v) DS értéknél(4.A) és 4. b) ábra). Másrészt, amikor ezeket a nanorészecskéket PBS pH 7,4-ben szuszpendáltuk, az összes készítményt nagyobb méretűre aggregáltuk, több mint 1 MHz-re, 0,5-nél nagyobb PDI-értékekkel. Részecske felszíni töltéseik szintén majdnem semlegesek voltak, +0-tól kezdve.2 hogy +2,5 mV.

(a)

(b)

a)
b)

ábra 3

(a) részecskeméret és (b) felületi töltése CS NPs készített 0,05 és 0,01% w/v DS oldat és tárolt 25 Kb C. nanorészecskék szuszpendáltuk desztillált vízben (pH tartományban 6-7), .

(a)

(b)

a)
b)

ábra 4

(a) részecskeméret és (b) felületi töltése CS NPs készített 0,05 és 0,10% w / v és tárolt 4 db C. nanorészecskék szuszpendáltuk desztillált vízben (pH tartományban 6-7),.

3.4. BSA In Vitro felszabadulás és integritás

az 5(a) ábra szemlélteti, hogy a BSA felszabadulása a felszabadulási sebesség alapján két szakaszra osztható. Az első szakaszban a BSA gyorsan felszabadult a CS NPs-ből, és az első 6 h. Ez a BSA 45% – os 5 kumulatív felszabadulását eredményezte. A második szakaszban a BSA lassan felszabadult 6 órától 48 óráig, ami több mint 60% kumulatív BSA felszabadulást eredményezett. A CS NPS-ből felszabaduló BSA integritását az SDS-PAGE értékelte, és az 5(b) ábra mutatja. A megfigyelt sávok megerősítették, hogy azok a BSA-k, amelyek a 37.és 2. nap után elviselték a terhelési és felszabadulási folyamatokat, nem különböztek a frissen elkészített BSA-szabványokétól. Ezért azt a következtetést lehetett levonni, hogy a BSA a kísérleti körülmények között a CS NPs-ben eredeti formájában maradt.

(a)

(b)

a)
b)

ábra 5

(a) a BSA terhelt CS NPs kibocsátási profilja DS : CS arány 1: 1 pH-nál 7.4, . b) a CS NPs-ből felszabaduló BSA SDS-OLDALELEMZÉSE: M) SDS-PAGE standardok (BIO-RAD); A) 1 mg/mL BSA standard; B) 0,2 mg/mL BSA standard; C) üres; d) kirakodott CS NPs; E) és F) a CS NPs-ből felszabaduló BSA (1 : 1 DS : CS arány) az 1.és 2. napon.

3.5. siRNS In Vitro felszabadulás

a 6.ábra szemlélteti, hogy az siRNS felszabadulása a felszabadulási sebesség alapján két szakaszra osztható. Az első szakaszban az siRNS gyorsan felszabadult a CS NPs-ből, és az első 6 órában tört felszabadulást mutatott. Ez az siRNS 58% – os 5% – os kumulatív felszabadulását eredményezte. A második szakaszban az siRNS lassan felszabadult az 6 h-tól az 48 h-ig, ami több mint 85% kumulatív BSA felszabadulást eredményezett.

ábra 6

a kiadás profilja siRNS betöltött CS NPs a DS : CS arány 1: 1 pH 7,4, .

4. Megbeszélések

a jelen tanulmányban a CS NP-k előállítására alkalmazott módszer enyhe folyamat, és lehetővé teszi a részecskeméret szabályozását bizonyos paraméterek változtatásával, például a hozzáadott sók koncentrációjával, a viszkozitással, a nem oldódó anyagok mennyiségével és a polimer molekulatömegével. Ezt a vizsgálatot azzal a vizsgálattal kezdték, hogy információt szerezzenek a CS NP-k ionizálható csoportjainak elektromos állapotáról az e.d.l. stabilizációs idejének meghatározásával.ez a lépés fontos a megbízható és reprodukálható eredmények eléréséhez. A kapott adatok arra utalnak, hogy stabil e.d.l. során nanorészecskék előkészítése szükséges néhány pillanatig leállítása után a keverést. Ezekre a pillanatokra azért volt szükség, hogy az elektrolitok behatolhassanak a részecskék magja felé. Így 40 perces várakozási időre volt szükség, mielőtt a CS NPs-t pontosan meg lehetett volna mérni. Ez a megállapítás hasonló volt a CS-tripolifoszfát (CS-TPP) NPs-hez, amely ugyanazt a várakozási időt javasolta .

vizsgálatot is végeztek a polimer koncentrációjának a részecskeképződésre gyakorolt hatásának meghatározására. A vizsgálat célja a polielektrolitok koncentrációjának meghatározása volt a kívánt méretű nanorészecskék előállításához. A CS és DS különböző koncentrációinak a nanorészecskék képződésére gyakorolt hatásának tanulmányozására 0,1, 0,25 és 0,5 tömegszázalékos CS és DS oldatot készítettünk. Változó térfogatú DS megoldás (1, 2, 3, 4, 5, 5.8, és 10 mL) minden egyes CS–koncentrációból 5 mL-t (0,1-0,5 m/v%) kevertünk. Kiszámítottuk a CS és a DS végső koncentrációját, és a minták méretét 100-500, 501-1000 vagy 1000 nm-nél nagyobb kategóriába soroltuk. Megállapítottuk, hogy a részecskeméretet a DS koncentráció befolyásolta. Ez a megállapítás megerősítette a CS-TPP NPs eredményeit . Általában a nanorészecskék kívánt mérete 100-1000 nm között van. Korábbi tanulmányok azonban kimutatták, hogy a betöltött nanorészecskék általában nagyobb méretűek, mint az üresek. Ezért az 500 nm alatti méret kedvező.

ezenkívül az eredmények azt mutatták, hogy csak a 0,05 tömeg% – os DS-koncentráció képes 500 nm-nél kisebb részecskeméretű nanorészecskéket előállítani, amint azt az 1.táblázat mutatja. Várható volt, mivel amikor mindkét polimer alacsony koncentrációban volt, a DS hozzáadása a CS-hez kis koacervátmagokat eredményezett. Ezzel ellentétben az 1000 nm – t meghaladó nagy koacervátumok hajlamosak kialakulni, amikor mindkét polimer koncentrációja 0,25% – ra vagy annál magasabb. A kitozán spontán koacervátképző képessége az ellentétesen töltött polielektrolitok kölcsönhatásának köszönhető, hogy csökkent oldhatóságú polielektrolit komplexet képezzenek. A nagy koncentrációjú DS és a CS keveréke ezért nagyobb valószínűséggel befolyásolja a CS láncok összefonódását és az eredményül kapott komplex oldhatóságát. Ennek eredményeként magas fokú komplexáció és koacervátum keletkezik . A csökkent viszkozitás alacsonyabb CS koncentrációnál szintén jobb oldhatóságot eredményezett. Ez lehetővé tette a kationos CS és az ellentétes töltésű ionok közötti hatékonyabb kölcsönhatást, így kisebb részecskeméret jött létre . Ezenkívül a felhasznált polianion moláris tömegének növekedése és feleslege nagyobb részecskéket eredményezett, mivel erősen semlegesített komplexek képződtek, és hajlamosak voltak flokkulálni . Ebben a tanulmányban a nanorészecskés rendszer részecske felületi töltése a DS és a CS tömegarányától függött. Megállapították, hogy a részecske felületi töltése növekszik az arány csökkenésével. Ez a kapcsolat hasznos lehet a kívánt részecske felületi töltéssűrűség eléréséhez, hogy megkönnyítse a nanorészecskék tapadását és szállítási tulajdonságait.

jelen vizsgálatban a BSA beépülését a CS NPs-be az oldott BSA-molekulákat tartalmazó savas CS-oldat egyszerű keverésével értük el a DS-oldattal szobahőmérsékleten, stabilizátor hozzáadása nélkül. A BSA-t gyakran használják modellfehérjeként, mivel magában foglalja más fehérjék általános jellemzőit, és biokompatibilis az emberek számára. Megállapítást nyert, hogy a CS NP-k viszonylag nagyobb méretűek voltak a BSA-val való betöltés után. A részecskeméret várhatóan növekedni fog, amikor a BSA-t sikeresen betöltötték a nanorészecskékbe. Ez a tendencia valószínűleg a hozzáadott BSA molekulák molekulatömegének és méretének köszönhető. Ezek a nagy részecskeméretek korlátozhatják felhasználásukat a fehérje szállításában. A 150-300 nm-es nanorészecskék elsősorban a májban és a lépben találhatók . Emellett egyes jelentések szerint a rák kezelésére kifejlesztett nanorészecskék” ideális ” méretigénye 70 és 200 nm között van . Bár a nanorészecskék nem lehetnek nagyobbak, mint 150 nm, hogy átlépjék az endoteliális gátat, az irodalom mindig beszámol a részecskék behatolásáról, amelyek nagyobbak, mint a fenestrációk határai. Valójában a fenestráció és az érrendszer különböző kóros körülmények között módosulhat .

például a tumor növekedése indukálja a neovaszkulatúra kialakulását, amelyet nem folytonos endothelium jellemez, nagy 200-780 nm-es fenestrációval . Emellett megfigyelték, hogy a BSA terhelt Nanorészecske részecske felületi töltése magasabb volt, mint az üresek. Ennek oka lehet a BSA kationos jellemzője, ha savas állapotban van jelen. A CS és a BSA molekulák pozitív töltései ezért hozzájárultak a terhelt nanorészecskék részecske felületi töltésének magasabb értékéhez.

a pozitív töltésű kationos polimerek hatékonyan kötődnek és védik a nukleinsavakat, például a DNS-t , az oligonukleotidokat és az siRNS-t . Ebben a tanulmányban az siRNS beépülését a CS NPs-be úgy értük el, hogy a savas CS-oldatot szobahőmérsékleten egyszerűen összekeverjük az siRNS-t tartalmazó DS-oldattal. Megállapítást nyert, hogy a CS NPs részecskemérete viszonylag kisebb volt az siRNS-sel való betöltés után. Az siRNS-sel töltött CS NPs kisebb mérete a nukleinsav negatív töltéseinek kationos polimer általi semlegesítésének tudható be, ami kisebb méretű nanorészecskéket kondenzált. Az siRNS betöltött CS NP-k szintén magasabb zéta potenciált mutattak, mint az üres CS NP-k, ugyanazt a tendenciát követve, mint a BSA betöltött CS NP-k.

ideális esetben a sikeres szállítási rendszernek magas fokú asszociációs kábítószerrel kell rendelkeznie. Az siRNS-ben betöltött CS NPs nagyobb befogási hatékonyságot mutatott (<90%) az összes DS : CS súlyaránynál. A nanorészecskék befogási hatékonysága DS : CS tömegarányban 1: 1, 1,5 : Az 1 és a 2 : 1 arány magasabb volt, mint a 0,5 : 1 tömegarány. Ez a jelenség valószínűleg a nanorészecskékben megjelenő DS nagyobb arányának köszönhető. Mivel több DS hozzá, ez megkönnyítené több BSA kell csapdába nanorészecskék. Ez azzal magyarázható, hogy a BSA egy zwitterionikus molekula. A 3,5–4,0-es formulációs közeg pH-jánál a BSA oldhatósága nagymértékben megnőhet az általa birtokolt megnövekedett pozitív töltések miatt . Így a BSA képes lenne elektrosztatikusan rögzíteni és stabilan betölteni a nanorészecskéket. Savas oldatban a BSA pozitív töltéssel rendelkezhet, és versenyezhet a CS-vel, hogy elektrosztatikusan kölcsönhatásba lépjen a DS-vel. Ezt a megállapítást megerősítette a BSA-val terhelt CS NPS megnövekedett pozitív felületi töltése a terheletlenekhez képest. Sőt, vannak többionos helyek a BSA-n, és ez a funkció megkönnyítheti a BSA nanorészecskékbe történő beépítését. Ez a megállapítás eltér a CS-TPP NPs-től .

a vizsgálatban az elektrosztatikus kölcsönhatás a BSA és a CS között volt jelen, a BSA és a TPP helyett. Azt is javasolták, hogy a BSA oldódjon olyan oldatban, amelynek pH-ja magasabb, mint az izoelektromos pontja, hogy a BSA negatív töltéssel rendelkezzen, és kölcsönhatásba lépjen a pozitív töltésű CS molekulákkal. Ez a megállapítás tehát bebizonyította, hogy az elektrosztatikus kölcsönhatás a fő hozzájáruló tényező a BSA beépülésének elősegítéséhez nanorészecskék akár CS-fehérje kölcsönhatás, akár DS-fehérje kölcsönhatás révén.

a TEM lehetővé teszi az egyes nanorészecskék nanoméretű megjelenítését, és információt nyújt mind a méretről, mind a morfológiáról. A részecske morfológiája fontos tényező a kolloid és kémiai stabilitás, valamint a nanorészecskék bioaktivitása szempontjából. az siRNS-ben betöltött CS NPs szabálytalan morfológiát mutatott; a BSA-ban betöltött CS NPs azonban hosszúkás morfológiát mutatott. Ennek oka lehet a BSA nagyobb mérete, amely összefonódhat vagy pajzsként viselkedhet a CS számára, ezáltal korlátozva a CS teljes kitettségét a struktúrán belül.

a CS NPs Stabilitási profilja tároláskor szintén fontos. Ez az információ képet adhat a nanorészecskék stabilitásáról különböző közegek és hőmérséklet mellett. A nanorészecskék stabilitását az átlagos részecskeméret és a felületi töltés időbeli változásának értékelésével vizsgálták. Először a nanorészecskéket 6,6-os pH-értékű desztillált vízben reszuszpendáltuk, amelyet 0,2 MHz-es szűrővel szűrtünk, hogy eltávolítsuk a vízben lévő lehetséges szennyeződéseket. Ehhez a vizsgálathoz csak a DS 0,05 és 0,10 tömegszázalékából készült nanorészecskéket tesztelték. Más DS-koncentrációkat nem határoztunk meg a centrifugálás utáni megnövekedett részecskeméret miatt. A részecskeméret legfeljebb nm volt 0,15%, illetve 0,20% m/v DS esetén. A részecskeméret növekedése a CS NP-k miatt vizes környezetben maguk is erodálódhatnak és elveszíthetik gömb alakjukat, következésképpen a részecske átlagos átmérője emelkedne erre az erózióra adott válaszként . Ezenkívül a mindkét koncentrációból előállított nanorészecskék részecske felületi töltése idővel csökkent. Gyanították, hogy a CS vizes közegben lebomlik, annak ellenére, hogy lizozimok nincsenek. Az eredmények azt mutatták, hogy a CS NP-k stabilabbak voltak, ha 4CC-n tárolták őket, mivel részecskeméretük és felületi töltésük 14 napig változatlan vagy kissé megváltozott. Az eredmények azt is sugallták, hogy a CS NP-ket nem szabad környezeti hőmérsékleten tárolni, mivel hajlamosak a lebomlásra. Az eredmények ezért azt sugallták, hogy a szobahőmérsékleten tárolt CS NP-k hajlamosabbak a lebomlásra, mint a hűvös környezetben tároltak. Valószínűleg a hűvös környezetnek köszönhető, amely lelassíthatja a nanorészecskék kinetikus mozgását. Így a nanorészecskék megtarthatják gömb alakjukat,és az erózió kevésbé valószínű. Ezenkívül megfigyelték, hogy ezeket a nanorészecskéket PBS-ben 7,4 pH-n aggregálták. Ez a nanorészecskék alacsonyabb részecske felületi töltésének tulajdonítható a PBS-ben, közel a semlegeshez. A nullára esett részecske felületi töltése azt jelezheti, hogy a CS NPs-t a PBS foszfátcsoportjai töltötték le. Ezeknek a nanorészecskéknek a semleges töltöttségi állapota az intra-és intermolekuláris erők elvesztését okozhatja, ami fontos a nanorészecskék egyedi fenntartásához. Ennek eredményeként ezek a töltetlen nanorészecskék elkezdhetnek aggregálódni és destabilizálni a kolloid rendszert. A PBS-szel ellentétben a desztillált víz számos hidrogénionot képes létrehozni hidrogénkötések, amelyek elősegíthetik a nanorészecskék aggregációjának megszakítását azáltal, hogy kölcsönhatásba lépnek a CS NP-k ionizálható csoportjaival.

a CS NPs-ből származó BSA és siRNS in vitro felszabadulási vizsgálatát Tris-HCL pufferben végezték. A BSA és az siRNS felszabadulása a felszabadulási sebesség alapján két szakaszra osztható. Az első szakaszban a gyógyszer gyorsan felszabadult a CS NPs-ből. A BSA és az siRNS felszabadulása ebben a szakaszban magában foglalhatja a részecske felszínén kötött BSA/siRNS diffúzióját. A második szakaszban a BSA/siRNS lassan szabadult fel a polimer duzzanata vagy lebomlása miatt. A CS NPs-ben fennmaradó BSA/siRNS nem szabadul fel teljesen, amíg a részecskék teljesen erodálódnak vagy feloldódnak a felszabaduló közegben. Ennek oka lehet a fennmaradó BSA/siRNS és a CS szegmenseken lévő szabad aminocsoport közötti kölcsönhatás . Ezenkívül az a szintetizált rendszer, amelyet korábban úgy írtak le, hogy enyhe körülmények között képes megfogalmazni, biztosította, hogy a CS NPs-be betöltött fehérjék stabilitása sértetlen volt, amint azt az SDS-PAGE meghatározta.

5. Következtetések

összefoglalva, ez a tanulmány azt mutatja, hogy a CS és a DS koncentrációja, valamint a pH voltak a CS NPs részecskeméretét és felületi töltését szabályozó paraméterek. Az 500 nm-nél kisebb nanorészecskéket 0,5 : 1-es DS : CS tömegarány mellett, 4-es pH mellett lehetett elérni. A BSA befogása esetén a nagyobb DS : CS tömegarányú nanorészecskék nagyobb befogási hatékonysággal rendelkeznek, több mint 88%. Az elért befogási hatékonyság legnagyobb százaléka 0,10% w / v DS volt (DS : CS arány 1 : 1). Az siRNS-sel töltött CS NP-k azonban nagy befogási hatékonyságot mutattak (>90%) az összes DS : CS Arány esetében. Megállapították, hogy a tárolási hőmérséklet és a szuszpenziós közeg olyan tényezők, amelyek befolyásolhatják a CS NPs stabilitását. A CS NP-k labilisak voltak, és hajlamosak destabilizálni a környezeti hőmérsékleten, de visszatartják ezt a labilis viselkedést, ha hűvös környezetet (2-4 kb C) biztosítottak. Ezenkívül a CS NP-k jobban stabilak voltak a desztillált vízben, mint a PBS-ben, ami a vízmolekulák és a CS NP-k ionizálható csoportjai között kialakult hidrogénkötéseknek tudható be.

összeférhetetlenség

a szerzők kijelentik, hogy a jelenlegi kutatásban nincs személyes vagy pénzügyi összeférhetetlenség.

Köszönetnyilvánítás

a szerzők hálásan elismerik a “Dana Lonjakan Penerbitan” Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM-DLP-2011-001) a jelenlegi kutatási projekt finanszírozásáért és támogatásáért.