CMV promoter mutánsok csökkent termelékenységvesztési hajlammal a cho sejtekben

az enhancer, a proximális és a mag promoter régió metilációra hajlamos CpG helyeinek hatásainak figyelemmel kísérése érdekében úgy döntöttünk, hogy nemcsak a C-179-et vizsgáljuk, hanem a citozinokat is a -508 (C-508) és -41 (C-41) pozíciókban. A kiválasztott CpG helyek egyike sem átfedésben van a Cricetidae fajok ismert transzkripciós faktorkötő helyeivel. A teljes GC-tartalom fenntartása érdekében C-G transzverziót hajtottunk végre (ábra. 1a). A C-41 mellett a C-13 a második citozin a mag promoter régiójában, amely gyakran metilezettnek tűnik. Mivel a C-13-G mutációja új CpG-helyet hozna létre, inkább a C-41G-t vizsgáltuk. a mutált promoter variánsokat hárombetűs kóddal rövidítettük, pl. a GCC variáns citozin helyett guanint tartalmaz a -508 helyzetben, míg a citozin bázisok -179 és -41 megmaradnak. CCC a mutálatlan kontroll hCMV-MIE (ábra. 1a). A mutált vagy natív promotereket különböző plazmidokba vezettük be, és különböző riporter gének elé helyeztük őket.

annak megállapítása érdekében, hogy a mutációk befolyásolják-e a promoter erősségét, két független kísérletet végeztünk a szekretált embrionális alkalikus foszfatázt (SEAP) expresszáló riporter plazmidok cho-K1 sejtekbe történő átmeneti transzfúziójával, és öt nappal a transzfekció után megvizsgáltuk a SEAP expresszióját. A mutálatlan promótert referenciaként használtuk (ábra. 1b). A SEAP expressziója a GGG, GCG és CGC promoterekből következetesen körülbelül 20% – kal alacsonyabb volt, mint a mutálatlan promoterből, kisebb eltérésekkel a párhuzamos kísérletek között. Általában, a C-G mutációk tendenciát mutattak a szerényen csökkent promoter erő felé, amely, azonban, elfogadhatónak tűnt.

ezután megkérdeztük, hogy a hCMV-MIE promoter variánsok befolyásolják-e a tartósan transzfektált CHO sejtek expressziós stabilitását hosszú távú tenyésztés során. Erre a célra egy eGFP riportert választottunk, amely lehetővé teszi a riporter génexpressziójának citometriás elemzését egyetlen sejt szintjén. az eGFP reporter plazmidjait cho-K1 sejtekbe transzfektáltuk, és metotrexáttal (MTX) három-négy független, tartósan transzfektált sejtcsoportot választottunk ki. Ezeket három hónap alatt tenyésztették MTX szelekciós szer jelenlétében. Harmincnégy és nyolcvanhét nappal a transzfekció után az eGFP expresszióját citometriával mértük (két medence elveszett a 34.és 87. nap között a szennyeződés miatt). A mérésenkénti 10 000 esemény fluoreszcencia intenzitásának geometriai átlagát minden sejtkészletre kiszámítottuk, és mindkét időpontra ábrázoltuk (ábra. 1c). Harmincnégy nappal a transzfekció után alig volt különbség a konstrukciók között. Csak egy CGC-készlet mutatott emelkedett expressziós szintet. Nyolcvanhét nappal a transzfekció után a CGC-vel transzfektált négy medence közül kettő, a CCG-vel transzfektált három medence közül kettő pedig jellegzetesen magasabb eGFP-értékeket mutatott, mint az összes többi medence, vagy a mutálatlan kontrollal, vagy a fennmaradó promoter variánsokkal transzfektálva. Ezek a megfigyelések az egyetlen C-41g vagy C-179g mutáció stabilizáló hatását sugallták az eGFP expressziójára. Ennek az eredménynek a megszilárdítása érdekében megismételtük a kísérletet mind a promoter variánsokkal, mind a nagyobb számú medencével. Tíz medencét hoztunk létre CCG-vel vagy CCC-vel, illetve nyolc medencét CGC-vel (két medence elveszett a szennyeződés miatt). A sejteket a korábbiaknak megfelelően tenyésztettük, és áramlási citometriával elemeztük a transzfekciót követő 42.naptól a 69. napig (ábra. 1D és kiegészítő ábra. S1 online). 42 nap elteltével az eGFP expressziója erősen megnövekedett négy CCG-készletben a CCC-kontrollcsoportokhoz képest, míg két CGC-készlet mérsékelt növekedést mutatott az eGFP-expresszióban (ábra. 1D, bal oldali panel). 69 nap elteltével három CCG-medence továbbra is magas eGFP-szintet mutatott, míg a CGC-medencék eGFP-expressziója a CCC-kontrollszintre csökkent (ábra. 1d, jobb panel). A csoportok közötti különbségeket minden időpontban teszteltük a nem paraméteres acél-Dwass teszttel. Az alfa szintet 0,05-re állították. Szignifikáns különbséget figyeltek meg a CCG és a CCC között a transzfekciót követő 56.napon (p = 0,0305; lásd a kiegészítő ábrát. S1 online). Együtt, Az eredmények ábra. Az 1c, d azt javasolta, hogy mind a C-41G, mind a C-179g mutációk késleltethetik a hCMV-MIE által vezérelt rekombináns gén expressziójának elvesztését.

a C-41G és a C-179g mutációk teljesen gátolják a DNS metilációját az adott helyen, mivel a guanin nem metilálható. Kíváncsiak voltunk, hogy ezek a mutációk a HCMV-MIE-n belüli más CpG-helyek metilációs szintjét is befolyásolták-e. Ezért az egyes HCMV-MIE variánsokban az összes CpG-hely metilációs szintjét biszulfit konverzióval mértük a következő generációs szekvenálással párosítva. Ebből a célból 42 és 69 nappal a transzfekció után kivontuk a genomi DNS-t a második kísérlet sejtkészleteiből, és biszulfittal kezeltük, hogy megkülönböztessük a metilezett és a nem metilezett citozint. a hCMV-MIE DNS-t amplifikáltuk és szekvenáltuk az Illumina MiSeq rendszerrel (ábra. 1e). A C-179-et a CCC-vel vagy CCG-vel transzfektált összes medencében a legerősebben metilezték, megerősítve a mutálatlan hCMV-MIE12-vel kapcsolatos korábbi megfigyeléseket. Továbbá, megfigyeltünk egy különálló metilezési mintát, amely nagyon hasonló volt az összes medencével, de az Általános intenzitásban különbözött. Különösen a mutálatlan C-508 és C-41 volt következetesen a leggyakrabban metilezett helyek között. A C-41 mutációja a promoter variáns CCG-ben, különösen a C-179 mutációja a CGC variánsban, úgy tűnik, hogy egyenletesen csökkenti az összes CpG-hely metilezését, nem pedig megváltoztatja a metilezési mintát. Amikor kiszámítottuk az átlagos metilációs szinteket az összes CPG-helyszínen az egyes medencéknél, alacsonyabb teljes metilációt észleltünk a mutált promoter variánsokkal (lásd a kiegészítő ábrát. S2 online). A különbség a CGC variánsnál volt a legszembetűnőbb, de az Steel-Dwass teszttel nem érte el a statisztikai szignifikanciát (6,05). Átlagosan a metiláció idővel növekedett minden konstrukcióval.

az epigenetikus promoter hangtompítás mellett a transzgén másolatok elvesztése a rekombináns sejtekben a termelés instabilitásának fő oka20. A relatív hozzájárulás becsléséhez a plazmid kópiák számát A transzfekció után 42 és 69 nappal qPCR-rel mértük. Az átlagos plazmid másolatok száma az idő múlásával csökkent, a konstrukciók között nincs nyilvánvaló különbség (lásd kiegészítő ábra. S2 online). Érdekes módon a másolatszámok eloszlása a CGC csoport alacsonyabb értékei felé tolódott el. Amikor azonban statisztikai szignifikanciát teszteltünk az Steel-Dwass teszttel, a konstrukciók közötti különbségek nem bizonyultak szignifikánsnak (6,05).

a véglegesen transzfektált sejtek halmazai a transzgén expressziójában és növekedési sebességében eltérő klónok rendkívül heterogén keverékei. A rendkívül produktív klónok növekedési üteme általában alacsony21. Ezért az alacsony termelő sejtek, amelyek közül sok a transzfekció után jelen van a tenyészetben, előbb-utóbb szinte elkerülhetetlenül túlnövekednek a magas termelőknél. A torzítás minimalizálása érdekében a C-179g és C-41G mutációkat vizsgáltuk a klonális sejtvonalakban. Mivel arra törekedtünk, hogy felmérjük a potenciális kereskedelmi termék előállítására gyakorolt hatásokat, riporterként IgG-IL2 fúziós fehérjére váltottunk. Így az IgG-IL2 expressziós plazmid könnyű lánc és nehéz lánc génje előtt olyan promoter variánsokat illesztettünk be, amelyek mindkét mutációt önmagukban (CGC vagy CCG) vagy kombinációban (CGG) tartalmazzák.

a CCG-t, CGC-t, CGG-t vagy a mutálatlan hCMV-MIE-t hordozó expressziós plazmidokat cho-K1 sejtekbe transzfektáltuk, és stabilan transzfektált klónokat izoláltunk 384-kútlemezeken. Konstrukciónként harminc klonális sejtvonalat választottak ki véletlenszerűen, és hat kútlemezre bővítették. Miután a sejtvonalak stabil növekedést mutattak, körülbelül két hónapig tanulmányoztuk termelékenységüket, a transzfekciót követő 68.naptól a 134. napig. Néhány sejtvonal elveszett a szennyeződés vagy a csökkent életképesség miatt, mégis konstrukciónként 23-29 klónt vizsgáltak a teljes időtartam alatt.

a teljes vizsgálat során meghatároztuk az IgG-IL2 koncentrációt a sejtkultúrában felülúszók és a sejtenkénti és napi termelékenység (specifikus termelékenység qP). A vizsgálat kezdetén (68.nap) és végén (134. nap) a CGC-vel transzfektált sejtvonalak szignifikánsan magasabb titereket mutattak, mint a kontroll transzfektánsok (6,05; ábra). 2a). Figyelemre méltóan magas titerű sejtvonalakat figyeltek meg a CGG transzfektánsok között a 68.napon, valamint a CCG és CGG transzfektánsok között a 134. napon. Amikor összehasonlítottuk a különböző konstrukciókkal transzfektált sejtvonalak specifikus produktivitásait, hasonló megfigyeléseket tettünk (ábra. 2b). A sejtszámlálás pontatlanságának kompenzálása érdekében átlagoltuk két szakasz QP specifikus produktivitását az elején (68-71.nap és 83-86. nap a transzfekció után, ami a legkorábbi elérhető adatpontok) és három szakaszt a hosszú távú tenyésztés végén (124-127. nap, 127-131. nap és 131-134. nap a transzfekció után). A hosszú távú tenyésztés végén szignifikáns különbségeket figyeltek meg a CGC-vel vagy CCC-vel transzfektált sejtvonalak között (6,05).

a hCMV-MIE CGC és CCG variánsok stabilizálják a rekombináns fehérje termelését klonális CHO sejtvonalakban.

a) A Cho klónok IgG-IL2 titere 68 nappal(bal oldali panel) és 134 nappal (jobb oldali panel) a transzfekció után. B) A CHO klónok fajlagos termelékenysége a hosszú távú termesztés kezdetén (bal oldali panel) és végén (jobb oldali panel). A korai qP értékeket két korai szakasz qP értékeinek átlagolásával számítottuk ki, amelyek a két legkorábbi adatpontot képviselik (a transzfekciót követő 68-71.és 83-86. nap). A késői qP értékeket az utolsó három szakasz (124-127.nap, 127-131. nap és a transzfekciót követő 131-134. nap) átlagolásával számítottuk ki (c) a specifikus produktivitások százalékos változása a hosszú távú termesztés során, a b) pontban bemutatott adatok alapján, egy jackknife–elemzéssel azonosított kiugró értékkel (bal oldali panel) és anélkül (jobb oldali panel). Csak azokat a klónokat vették figyelembe, amelyek a 68.napon kimutatható termékszintet produkáltak. a-c) a promoter variánsok azonosítása és a független cellakészletek száma (N) az x tengely alatt van feltüntetve. A dobozok felső és alsó vége az egyes csoportok első és harmadik kvartilisét jelenti. A bajusz végei a legalacsonyabb és legmagasabb értékeket képviselik, amelyek még mindig az 1,5-szeres interkvartilis tartományon belül vannak. A szürke vonal az Y-változó teljes átlagát jelzi a diagramban. Az acél-Dwass teszt szerinti csoportok közötti szignifikáns különbségeket (6,05) a p-értékek jelzik.

a G-179-et vagy G-41-et hordozó sejtvonalak magasabb titerei és specifikus produktivitása arra utal, hogy ezeknek a mutációknak stabilizáló hatása van a hCMV-Mie által vezérelt génexpresszióra. Ennek a hatásnak a dokumentálása érdekében kiszámítottuk a qP százalékos változását a hosszú távú tenyésztés során minden egyes sejtvonalra, mint a termelési stabilitás legmegfelelőbb mércéjét (ábra. 2c). Természetesen ez csak akkor volt megvalósítható, ha a sejtvonalak még mindig IgG-IL2-t termeltek a transzfekció utáni 68. napon. Az egyik kontrolltranszfektáns 500% – kal növelte a specifikus termelékenységét, és a jackknife outlier analízissel kiugró értékként azonosították (ábra. 2c, bal telek). Ezért ezt a sejtvonalat kizárták a további elemzésből (ábra. 2c, jobb telek). A CGC-vel vagy CCG-vel transzfektált sejtvonalak szignifikánsan stabilabbak voltak, mint a CCC-vel transzfektált kontroll sejtvonalak (6,05). Meglepő módon a kettős mutáns CGG nem különbözött a kontrolltól.