Sviluppo di nanoparticelle di chitosano come sistema stabile di somministrazione di farmaci per proteine / siRNA

Abstract

Le nanoparticelle di chitosano (CS NPs) presentano buone proprietà fisico-chimiche come sistemi di somministrazione di farmaci. Lo scopo di questo studio è quello di determinare la modulazione dei parametri preparativi sulle caratteristiche fisiche e la stabilità colloidale di CS NPs. I CS NPS sono stati fabbricati mediante interazione ionica con solfato di destrano (DS) prima di determinare la loro stabilità allo stoccaggio. I più piccoli CS NPs di nm con una carica superficiale di mV sono stati prodotti quando CS e DS sono stati mescolati a pH 4 e con un rapporto di massa DS : CS di 0,5 : 1. Un’efficienza di intrappolamento del 98% è stata raggiunta quando BSA/siRNA è stato caricato nelle nanoparticelle. I risultati hanno anche mostrato che la dimensione delle particelle e la carica superficiale di CS NPs sono state leggermente modificate fino a 2 settimane se conservate a 4°C. Maggiori dimensioni delle particelle e carica superficiale sono state ottenute con l’aumento della concentrazione di DS. In conclusione, gli NPS erano sufficientemente stabili se mantenuti a 4°C e in grado di trasportare e proteggere le proteine.

1. Introduzione

Peptidi endogeni, proteine e oligonucleotidi sono tra i principali farmaci che attirano molta attenzione a causa delle loro grandi potenzialità nel trattamento di malattie croniche . Tuttavia, l’ambiente estremo in vivo del corpo umano ha sempre limitato le applicazioni terapeutiche di queste sostanze . Le nanoparticelle polimeriche hanno attirato molta attenzione come sistemi di consegna a causa della loro capacità di superare le barriere fisiologiche e proteggere e indirizzare le sostanze caricate a cellule specifiche . Polimeri naturali come il chitosano (CS) sono stati studiati per formare nanoparticelle . CS è un polisaccaride biodegradabile ed è derivato dalla deacetilazione della chitina . Oltre alla sua biocompatibilità, la bassa tossicità, le proprietà emostatiche e batteriostatiche contribuiscono anche alle sue varie applicazioni in campo farmaceutico . Diversi anioni sono stati studiati per crosslink CS come solfato di sodio e solfato di destrano (DS) . DS è in grado di modificare l’efficienza di intrappolamento di proteine e siRNA (EE) senza l’uso di agenti indurenti e controllare il tasso di rilascio del farmaco grazie alla sua elevata densità di carica . Inoltre DS è un materiale economico, produce nanoparticelle meccanicamente più stabili rispetto al tripolifosfato pentasodico (TPP) .

Diversi studi avevano riportato le caratteristiche uniche delle nanoparticelle di chitosano (CS NPs) utilizzando DS. Tuttavia, la modulazione dei parametri preparativi sulle loro caratteristiche fisiche non è ancora completamente studiata, ad esempio l’influenza dell’ostacolo sterico DS sull’attrazione elettrostatica tra CS e BSA . Inoltre, il fattore determinante di un sistema di somministrazione del farmaco di successo dipende dalle sue caratteristiche fisiche e stabilità. Pertanto, gli obiettivi del presente studio erano di modulare i parametri preparativi per ottenere particelle nanosizzate di CS NPS e determinare la loro stabilità colloidale a diverse temperature di stoccaggio e in vari mezzi di sospensione.

2. Materiali e metodi

2.1. Materiali

Chitosano a basso peso molecolare (70 kDa con il grado di deacetilazione 75% -85%), acido acetico glaciale, soluzione salina tampone fosfato (PBS), albumina sierica bovina (BSA, 46 kDa) e reagente Bradford è stato acquistato da Sigma-Aldrich Inc., USA. siRNA a doppio filamento (sense: 5 ‘- GAUAUGUCCGGUUAUGUAUU-3′, antisense: 3′-UACAUAACCGGACAUAAUCUU-5’) è stato acquistato da Thermoscientific Dharmacon, USA. Il solfato di destrano (DS) è stato acquistato da Fisher Scientific, Regno Unito. Protein ladder (High range), Laemmli sample buffer, 10x tris/glycine/sodium dodecyl sulfate buffer, ammonio persolfato, tetrametilendiammina (TEMED), soluzione bis al 2% e soluzione di acrilammide al 40% sono stati acquistati da Bio-Rad, USA. Il tampone Tris-HCl è stato ottenuto da Invitrogen, USA. Tutte le altre sostanze chimiche utilizzate erano di grado analitico.

2.2. Preparazione di CS NPS vuoto e caricato con BSA

Soluzione CS e DS sono stati sciolti rispettivamente in acido acetico 1% v / v e acqua distillata. Il pH della soluzione CS è stato regolato a pH 4 aggiungendo 1 M NaOH o 1 M HCl. Soluzione DS (0,05%, 0,1%, 0.15%, 0.2%, e 0.25% w/v) è stato aggiunto goccia a goccia in soluzione CS (0.1% w/v) sotto agitazione magnetica (Wisestir Digital Multipoint agitatore magnetico MS-MP8, DAIHAN Scientific, Corea) a 250 rpm per 15 min per formare nanoparticelle. Tutti i campioni sono stati fatti in triplice copia. Le nanoparticelle risultanti sono state lavate e raccolte mediante ultracentrifugazione (Optima L-100 XP Ultracentrifuge con rotore NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) due volte a 12 500 rpm per 15 min a 10°C. Per l’associazione BSA in CS NPs, BSA è stato sciolto in soluzione CS (0,1% p/v, pH 4) per produrre una concentrazione finale di 1 mg/mL. I CS NPS caricati con BSA sono stati quindi preparati con il metodo sopra descritto. Per l’associazione siRNA in CS NPs, 3 µL di siRNA (15 µg/µL) in acqua deionizzata sono stati aggiunti alla soluzione DS (0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, e 0.25% w/v) prima di aggiungere questo dropwise alla soluzione CS (0.1% w/v).

2.3. Studio di mobilità elettroforetica

Le misure di mobilità elettroforetica () di CS NPs sono state eseguite con uno Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK) ed è stato misurato in base al tempo di attesa. Ogni campione è stato analizzato in triplice copia.

2.4. Caratterizzazione delle nanoparticelle

La dimensione delle particelle, la carica superficiale e l’indice di polidispersità (PDI) di CS NPS appena preparati sono stati misurati utilizzando uno Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK), basato sulle tecniche di spettroscopia di correlazione dei fotoni (PCS). Durante l’analisi non sono state eseguite diluizioni. Ogni campione è stato analizzato in triplice copia. Le misurazioni sono state effettuate a 25°C.

2.5. Analisi morfologica

Caratterizzazione morfologica di scarico CS NPs, BSA / siRNA caricato CS NPs (DS : CS rapporto peso di 0.5: 1, 1 : 1) è stata effettuata utilizzando microscopia elettronica a trasmissione (TEM), Tecnai Spirit, FEI, Eindhoven (Paesi Bassi).

2.6. Efficienza di intrappolamento BSA/siRNA

I CS NPS caricati BSA/siRNA sono stati separati dalla soluzione mediante ultracentrifugazione (Optima L-100 XP Ultracentrifuge con rotore NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) a 14000 giri / min per 30 min. I supernatanti recuperati dalla centrifugazione sono stati decantati. Il contenuto di BSA nel surnatante è stato analizzato da uno spettrofotometro UV-Vis a 595 nm (U. V-1601; Shimadzu, Giappone) utilizzando il test della proteina Bradford secondo le istruzioni del produttore. Il contenuto di siRNA nel surnatante è stato analizzato da uno spettrofotometro UV-Vis a 260 nm. I campioni sono stati preparati e misurati in triplice copia. L’efficienza di intrappolamento BSA / siRNA (EE) è stata calcolata utilizzando la seguente equazione:

2.7. Stabilità di CS NPS

Appena preparato CS NPs (fatto da 0.05% e 0.1% w/v di DS e CS soluzione, resp.) sono stati centrifugati a 12 500 giri / min per 15 minuti prima della conservazione. Dopo ultracentrifugazione, i pellet ottenuti sono stati risospesi in acqua distillata (pH misurato di 6,6) o PBS pH 7,4. La dimensione delle particelle e la carica superficiale sono state misurate a tempi di conservazione predeterminati(0, 1, 2, 3, 5, 8, e 14 giorni), e a temperatura ambiente o 4°C.

2.8. In Vitro Drug Release Study

Il rilascio di BSA / siRNA è stato determinato da CS NPs con il più alto EE (DS : CS ratio 1: 1, EE = 98% ± 0.2 e , resp.). BSA / siRNA caricato CS NPs sono stati sospesi in soluzione tampone Tris-HCl (pH 7,4, 4 mL) e posto su un agitatore magnetico con una velocità di agitazione di 100 rpm a 37°C (MS MP8 Wise Stir Wertheim, Germania) per 48 h a 37°C. A intervalli di tempo predeterminati (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 20, 24, e 48 h), i campioni sono stati centrifugati a 14 000 rpm per 30 min a 10°C. Quindi, il surnatante è stato decantato e sostituito con un volume equivalente di soluzione tampone fresca. La quantità di BSA/siRNA rilasciato nel surnatante è stata analizzata da uno spettrofotometro UV-Vis (U. V-1601; Shimadzu, Giappone) a una lunghezza d’onda di 280 e 260 nm, rispettivamente.

2.9. Integrità BSA

L’integrità di BSA rilasciata da CS NPs è stata determinata da SDS-PAGE (12% resolving e 10% stacking gel) utilizzando il sistema Mini-Protein (Bio-Rad, USA). I campioni di BSA sono stati miscelati con il tampone del campione Laemmli in rapporto 1 : 1 e riscaldati a 95°C per 5 min. I campioni (15 µL) sono stati caricati nei pozzetti e il gel è stato eseguito utilizzando una Tetra cell del sistema Mini-proteico a una tensione costante di 150 V per 90 min con un buffer di corsa contenente Tris da 25 mm, glicina da 192 mm e SDS allo 0,1% a pH 8,3. Le bande del campione sono state colorate per 40 min con una soluzione blu di Coomassie allo 0,1% contenente acido acetico al 40% e metanolo al 10%, seguita da una colorazione durante la notte con una soluzione di acido acetico al 40% e metanolo al 10%.

2.10. Analisi statistica

Tutti i dati sono stati presentati come media ± deviazione standard (SD). L’analisi statistica (test ANOVA e analisi post-doc di Tukey) è stata eseguita utilizzando il pacchetto statistico per il programma Social (SPSS) versione 15. Un valore < 0,05 ha mostrato una differenza significativa tra la media dei gruppi testati.

3. Risultati

3.1. Dimensione delle particelle e carica superficiale

La figura 1 (a) mostra i risultati della mobilità elettrica () rispetto ai tempi di attesa. Dal grafico, si potrebbe osservare che il plateau rimasto e costante dopo 30 min. Ciò dimostra che la formazione di un doppio strato elettrico stabile (e.d.l.) non era istantanea ma richiedeva alcuni momenti. Gli effetti tra la concentrazione di CS e le concentrazioni finali di DS sulle dimensioni degli NPS di CS sono presentati nella figura 1, lettera b). È stato osservato che la maggior parte degli NPS CS con dimensioni inferiori a 500 nm sono stati ottenuti a una bassa concentrazione di CS (0,1% p/v). La concentrazione di DS ha anche influenzato la dimensione delle nanoparticelle (). Una tendenza crescente nella dimensione delle particelle potrebbe essere osservata con l’aumento della concentrazione DS da 0,05 a 0,25% p/v. In generale, la concentrazione DS di 0.lo 05% w/v (bassa concentrazione) ha prodotto nanoparticelle con dimensioni delle particelle inferiori a 500 nm. Contrariamente a ciò, sono state ottenute nanoparticelle di grandi dimensioni (>1000 nm) quando la concentrazione di entrambi i polimeri è stata aumentata allo 0,25% o superiore. Sulla base dei risultati, le concentrazioni di DS da 0,05 a 0,20% p/v sono state selezionate per i seguenti studi. Inoltre, un aumento del rapporto peso DS: CS (maggiore densità di cariche negative da DS presenti nel sistema) ha portato ad un aumento della dimensione delle particelle ma una diminuzione della carica superficiale delle particelle (Tabella 1 (sopra)). Poiché il peso CS ha superato la massa di DS, è stato ottenuto un valore positivo di + 56,2 ± 1,5 mV. Tuttavia, la carica superficiale delle particelle è diminuita a-mV quando è stato aggiunto DS più caricato negativamente. Era in continua diminuzione quando il rapporto peso DS: CS aveva raggiunto a 2,5: 1. Ci si aspettava che ciò fosse dovuto a un eccesso di molecole DS accumulate sulla superficie delle nanoparticelle.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 1

mobilità Elettroforetica in funzione del tempo (a) e l’effetto finale concentrazioni di CS e DS la dimensione delle particelle di nanoparticelle (b), .

La tabella 1 (sotto) mostra che DS 0.2% w/v possedeva la dimensione delle particelle più grande dopo essere stato caricato con BSA. La dimensione delle particelle era nm. Dimensione delle particelle per DS alla concentrazione di 0.1 e 0.15% w / v era anche più grande di quelli vuoti (). D’altra parte, sono stati osservati valori positivi più elevati di carica superficiale per le nanoparticelle caricate da BSA rispetto a quelle vuote. Questo è stato osservato per tutte le concentrazioni di DS. Inoltre, valori EE più elevati potrebbero essere raggiunti aumentando il rapporto peso DS: CS superiore a 0,5: 1. L’EE delle nanoparticelle al rapporto peso DS : CS di 1 : 1, 1,5 : 1 e 2 : 1 era%, % e%, rispettivamente. L’EE più alto è stato ottenuto con un rapporto peso DS: CS 1: 1 (Tabella 1 (sotto)).

La tabella 2 mostra che DS 0.il 2% p/v possedeva la dimensione delle particelle più grande (900 ± 60 nm) dopo essere stato caricato con siRNA. siRNA ha caricato CS NPS a diverse concentrazioni di DS (0,05, 0,1, 0,15 e 0,2% p/v) ha mostrato dimensioni delle particelle più piccole. L’EE delle nanoparticelle a DS: CS rapporto peso di 0.5 : 1, 1 : 1, 1.5 : 1, e 2: 1 era%,%, % e%, rispettivamente.

3.2. Morfologia

Le immagini del CS NPs sono state ottenute da TEM (Figura 2). Le figure 2 (a) e 2 (b) mostrano che le NP CS scaricate presentano una struttura sferica. Le immagini hanno dimostrato che le nanoparticelle generate da siRNA(Figure 2(e) e 2 (f)) mostravano morfologia irregolare; tuttavia, le nanoparticelle caricate da BSA mostravano morfologie allungate(Figure 2(c) e 2 (d)).

(a)

(b)

(c)

d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figura 2

immagini TEM di CS NPs. a) e b) CS NPS scaricato a 0,5 : 1 e 1 : 1, c) e d) BSA CS NPS caricato a 0,5: 1 e 1 : 1, e (e) e (f) siRNA caricato CS NPs a 0.5 : 1 e 1 : 1, rispettivamente. Tutte le immagini sono state scattate con un ingrandimento di 60 kX.

3.3. Stabilità di stoccaggio di CS NPs

Entrambe le nanoparticelle fatte da 0,05 e 0,10% p/v DS sono state aumentate nel tempo come mostrato nella Figura 3 (a) se conservate a temperatura ambiente. Un aumento significativo della dimensione delle particelle è stato osservato dopo il giorno 14 di conservazione, specialmente per DS 0,05% p/V. Questo è stato pensato per essere dovuto alla formazione di aggregati. Questo risultato corroborato con i risultati della carica superficiale che ha mostrato una diminuzione della carica superficiale a quasi neutro. Al contrario, quando sono stati conservati a 4°C, la loro dimensione delle particelle e la carica superficiale sono rimaste invariate fino a 14 giorni per nanoparticelle fatte da 0,10% p/v DS. Una leggera variazione è stata osservata per 0,05% p / v DS (Figure 4(a) e 4(b)). D’altra parte, quando queste nanoparticelle sono state sospese in PBS pH 7.4, tutte le formulazioni sono state aggregate a dimensioni maggiori di oltre 1 µm con valori di PDI superiori a 0.5. Le loro cariche superficiali delle particelle erano anche quasi neutre, che andavano da + 0.2 a + 2,5 mV.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 3

(a) la dimensione delle Particelle e (b) carica superficiale di CS NPs preparati a 0,05 e 0,01% p/v DS soluzione e conservati alla temperatura di 25°C. le Nanoparticelle sono state sospese in acqua distillata (pH nell’intervallo 6-7), .

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 4

(a) la dimensione delle Particelle e (b) carica superficiale di CS NPs preparati a 0.05 e 0.10% (w/v) e conservato a 4°C. le Nanoparticelle sono state sospese in acqua distillata (pH nell’intervallo 6-7), .

3.4. BSA In Vitro Release and Integrity

Figura 5(a) illustra che il rilascio di BSA potrebbe essere diviso in due fasi in base alla velocità di rilascio. Nella prima fase, il BSA è stato rapidamente rilasciato dal CS NPs e ha mostrato un rilascio a raffica nel primo 6 h. Ciò ha provocato un 45% ± 5 rilascio cumulativo di BSA. Nella seconda fase, BSA è stato rilasciato lentamente da 6 h fino a 48 h, con un conseguente rilascio cumulativo di BSA superiore al 60%. L’integrità di BSA rilasciata da CS NPS è stata valutata da SDS-PAGE ed è mostrata dalla Figura 5(b). Le bande osservate hanno confermato che il BSA che aveva subito i processi di caricamento e rilascio a 37°C dopo i giorni 1 e 2 non era diverso da quello degli standard BSA appena preparati. Pertanto, si potrebbe concludere che BSA è rimasto nella sua forma nativa nel CS NPS nelle condizioni sperimentali.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 5

(a) Il profilo di rilascio di BSA caricato CS NPs DS : CS rapporto di 1 : 1 a pH 7.4, . (b) Analisi SDS-PAGE di BSA rilasciato da CS NPs: (M) standard SDS-PAGE (BIO-RAD); (A) standard BSA 1 mg/mL; (B) standard BSA 0,2 mg/mL; (C) vuoto; (D) CS NPS scaricato; (E) e (F) BSA rilasciato da CS NPs (DS : rapporto CS di 1 : 1) ai giorni 1 e 2.

3.5. siRNA In Vitro Release

Figura 6 illustra che il rilascio di siRNA potrebbe essere diviso in due fasi in base alla velocità di rilascio. Nella prima fase, il siRNA è stato rapidamente rilasciato dal CS NPs e ha mostrato un rilascio a raffica nel primo 6 h. Ciò ha comportato un rilascio cumulativo di siRNA del 58% ± 5. Nella seconda fase, siRNA è stato rilasciato lentamente da 6 h fino a 48 h, con un conseguente rilascio cumulativo di BSA superiore all ‘ 85%.

Figura 6

Il profilo di rilascio di siRNA caricato CS NPs a DS : CS rapporto di 1: 1 a pH 7.4,.

4. Discussioni

Il metodo utilizzato per produrre CS NPS nel presente studio è un processo delicato e consente il controllo della dimensione delle particelle variando determinati parametri, ad esempio concentrazione di sali aggiunti, viscosità, quantità di non solvente e peso molecolare del polimero. Questo studio è stato avviato con l’indagine per ottenere informazioni sullo stato elettrico dei gruppi ionizzabili di CS NPS determinando il tempo di stabilizzazione di e.d.l. Questo passaggio è importante per ottenere risultati affidabili e riproducibili. I dati ottenuti hanno suggerito che la formazione di e.d.l stabile. durante la preparazione nanoparticelle richiesto alcuni momenti dopo aver interrotto l’agitazione. Questi momenti erano necessari affinché gli elettroliti penetrassero verso il nucleo delle particelle. Così, tempo di attesa di 40 min era necessario prima di CS NPs potrebbe essere misurato con precisione. Questo risultato era simile al CS-tripolifosfato (CS-TPP) NPs che suggeriva lo stesso tempo di attesa .

È stato condotto anche uno studio per determinare l’influenza della concentrazione polimerica sulla formazione di particelle. Lo studio mirava a stabilire la gamma di concentrazione di polielettroliti per produrre nanoparticelle con la dimensione desiderata. Per studiare gli effetti delle diverse concentrazioni di CS e DS sulla formazione di nanoparticelle, sono state preparate soluzioni di CS e DS di 0,1, 0,25 e 0,5% p/v. Volumi variabili della soluzione DS (1, 2, 3, 4, 5, 5.8, e 10 ml) sono stati miscelati con 5 ml di ciascuna concentrazione di CS (0,1–0,5% p/v). La concentrazione finale di CS e DS è stata calcolata e le dimensioni dei campioni sono state classificate come 100-500, 501-1000 o più di 1000 nm. Si è riscontrato che la dimensione delle particelle era influenzata dalla concentrazione di DS. Questo risultato corroborato con i risultati di CS-TPP NPs . In generale, la dimensione desiderata di nanoparticelle confinato tra 100 e 1000 nm. Tuttavia, studi precedenti hanno dimostrato che le nanoparticelle caricate normalmente produrrebbero dimensioni maggiori di quelle vuote. La dimensione inferiore a 500 nm è quindi favorevole.

Inoltre, i risultati hanno rivelato che solo la concentrazione di DS dello 0,05% p/v è stata in grado di produrre nanoparticelle con dimensioni delle particelle inferiori a 500 nm come mostrato nella Tabella 1. Era previsto come quando entrambi i polimeri erano in basse concentrazioni, l’aggiunta di DS al CS ha provocato piccoli nuclei di coacervato. Contrariamente a ciò, i grandi coacervati che superavano i 1000 nm tendevano a formarsi quando la concentrazione di entrambi i polimeri aumentava allo 0,25% o superiore. La capacità del chitosano di formare spontaneamente il coacervato è dovuta all’interazione di polielettroliti caricati in modo opposto per formare un complesso di polielettroliti con ridotta solubilità. La miscela di alta concentrazione di DS con CS è quindi più probabile che influenzi l’entanglement delle catene CS e la solubilità del complesso risultante. Di conseguenza, verrà prodotto un alto grado di complessazione e coacervato . La viscosità diminuita ad una concentrazione più bassa di CS inoltre ha provocato la migliore solubilità. Ciò ha permesso un’interazione più efficiente tra il CS cationico e gli ioni caricati in modo opposto, e quindi è stata prodotta una dimensione delle particelle più piccola . Inoltre, un aumento e un eccesso nella massa molare del polianione utilizzato hanno provocato particelle più grandi perché si sono formati complessi altamente neutralizzati e tendevano a flocculare . In questo studio, la carica superficiale delle particelle del sistema nanoparticolato dipendeva dal rapporto peso di DS e CS. La carica superficiale delle particelle è risultata aumentata al diminuire del rapporto. Questa relazione potrebbe essere utile per ottenere la densità di carica superficiale delle particelle desiderata per facilitare l’adesione e le proprietà di trasporto delle nanoparticelle.

Nel presente studio, l’incorporazione di BSA in CS NPs è stata ottenuta semplicemente mescolando la soluzione di CS acida contenente molecole di BSA disciolte con la soluzione DS a temperatura ambiente senza aggiunta di stabilizzatore. BSA è spesso usato come proteina modello perché abbraccia la caratteristica generale di altre proteine ed è biocompatibile per l’uomo. Si è constatato che CS NPS erano relativamente più grandi in termini di dimensioni dopo il caricamento con BSA. Ci si aspettava che la dimensione delle particelle aumentasse quando BSA veniva caricata con successo nelle nanoparticelle. Questa tendenza può essere probabilmente dovuta al peso molecolare e alle dimensioni delle molecole di BSA aggiunte. Queste grandi dimensioni delle particelle possono limitare il loro uso nella consegna di proteine. Nanoparticelle di 150-300 nm si trovano principalmente nel fegato e nella milza . Inoltre, secondo alcuni rapporti, il requisito di dimensione “ideale” per le nanoparticelle sviluppate per il trattamento del cancro è compreso tra 70 e 200 nm . Sebbene le nanoparticelle non debbano essere superiori a 150 nm per attraversare la barriera endoteliale, la letteratura riporta sempre la penetrazione di particelle più grandi dei limiti delle fenestrazioni. Infatti, la fenestrazione e la vascolarizzazione possono subire modifiche in varie condizioni patologiche .

Ad esempio, la crescita del tumore indurrà lo sviluppo di neovasculature caratterizzate da endotelio discontinuo con grandi fenestrazioni di 200-780 nm . Inoltre, è stato osservato che la carica superficiale delle particelle di nanoparticelle caricate da BSA era superiore a quella vuota. Ciò può essere dovuto la caratteristica cationica posseduta da BSA una volta presente nello stato acido. Le cariche positive delle molecole CS e BSA hanno quindi contribuito a un valore più elevato di carica superficiale delle particelle per le nanoparticelle caricate.

I polimeri cationici caricati positivamente possono efficacemente legarsi e proteggere gli acidi nucleici come DNA, oligonucleotidi e siRNA . In questo studio, l’incorporazione di siRNA in CS NPs è stata ottenuta semplicemente miscelando la soluzione CS acida con la soluzione DS contenente siRNA a temperatura ambiente. Si è riscontrato che la dimensione delle particelle di CS NPs era relativamente più piccola dopo il caricamento con siRNA. La dimensione più piccola di CS NPS caricato con siRNA potrebbe essere dovuto alla neutralizzazione di cariche negative di acido nucleico da polimero cationico con conseguente condensato nanoparticelle di dimensioni più piccole. Il CS NPS caricato siRNA ha anche mostrato un potenziale zeta più elevato rispetto al CS NPS vuoto, seguendo la stessa tendenza di quello del CS NPS caricato BSA.

Idealmente, un sistema di consegna di successo dovrebbe avere un alto grado di associazione di farmaci. Il CS NPS caricato siRNA ha mostrato una maggiore efficienza di intrappolamento (<90%) per tutti i rapporti di peso DS : CS. L’efficienza di intrappolamento delle nanoparticelle a DS: CS rapporto peso di 1 : 1, 1.5 : 1, e 2: 1 era superiore al rapporto peso di 0,5: 1. Questo fenomeno era probabilmente dovuto alla maggiore percentuale di DS presentato nelle nanoparticelle. Come più DS aggiunto, faciliterebbe più BSA di essere intrappolato in nanoparticelle. Ciò potrebbe essere spiegato dal fatto che BSA è una molecola zwitterionica. Al pH del mezzo di formulazione di 3,5-4,0, la solubilità di BSA potrebbe essere altamente aumentata a causa di un aumento delle cariche positive possedute da esso . Quindi, BSA sarebbe in grado di attaccare elettrostaticamente e caricare stabilmente nelle nanoparticelle. In soluzione acida, BSA potrebbe possedere carica positiva e competere con CS per interagire con DS elettrostaticamente. Questa scoperta è stata corroborata con l’aumento delle cariche superficiali positive di CS NPS caricati da BSA rispetto a quelli scaricati. Inoltre, ci sono siti multi-ionici su BSA, e questa caratteristica potrebbe facilitare l’incorporazione di BSA in nanoparticelle. Questo risultato differisce dal risultato con CS-TPP NPS .

Nello studio, l’interazione elettrostatica era presente tra BSA e CS, invece di BSA e TPP. È stato anche suggerito che BSA dovrebbe dissolversi in una soluzione con pH superiore al suo punto isoelettrico in modo che BSA possieda carica negativa e interagisca con le molecole CS caricate positivamente. Questa scoperta ha quindi dimostrato che l’interazione elettrostatica è il principale fattore che contribuisce a promuovere l’incorporazione di BSA nelle nanoparticelle tramite interazione CS-proteina o interazione DS-proteina.

TEM consente la visualizzazione su scala nanometrica di singole nanoparticelle e fornisce informazioni di dimensioni e morfologia. La morfologia delle particelle è un fattore importante per la stabilità colloidale e chimica, nonché per la bioattività delle nanoparticelle. siRNA caricato CS NPs ha mostrato morfologia irregolare; tuttavia, BSA caricato CS NPS ha mostrato morfologia allungata. Ciò potrebbe essere dovuto alle dimensioni maggiori di BSA che possono impigliarsi o agire come uno scudo per CS, limitando così l’esposizione complessiva di CS all’interno della struttura.

Anche il profilo di stabilità di CS NPS durante lo stoccaggio è importante. Queste informazioni potrebbero fornire una vista sulla stabilità delle nanoparticelle sotto diversi media e temperatura. La stabilità delle nanoparticelle è stata studiata valutando la loro variazione nella dimensione media delle particelle e nella carica superficiale nel tempo. In un primo momento, le nanoparticelle sono stati risospesi in acqua distillata a pH 6.6 che è stato filtrato da 0.2 µm filtro per rimuovere eventuali contaminanti presenti in acqua. Per questo studio, sono state testate solo nanoparticelle fatte da 0,05 e 0,10% p/v di DS. Altre concentrazioni di DS non sono state determinate a causa dell’aumento della dimensione delle particelle dopo la centrifugazione. La dimensione delle particelle era fino a nm e nm per 0,15% e 0,20% p / v DS, rispettivamente. L’incremento della dimensione delle particelle può a causa di CS NPS stessi erodere e perdere la loro forma sferica in un ambiente acquoso, e di conseguenza il diametro medio della particella aumenterebbe come risposta a questa erosione . Inoltre, le cariche superficiali delle particelle per le nanoparticelle ottenute da entrambe le concentrazioni stavano diminuendo nel tempo. Si sospettava che il CS potesse essere degradato in mezzi acquosi anche se in assenza di lisozimi. I risultati hanno mostrato che i CS NPS erano più stabili se conservati a 4°C poiché la dimensione delle particelle e la carica superficiale erano invariate o leggermente modificate fino a 14 giorni. I risultati hanno anche suggerito che i CS NPS non devono essere conservati a temperatura ambiente in quanto sono soggetti a degradazione. I risultati hanno quindi suggerito che i CS NPS conservati a temperatura ambiente sono più soggetti a degradazione rispetto a quelli conservati in ambiente fresco. Probabilmente era dovuto all’ambiente fresco che potrebbe rallentare il movimento cinetico delle nanoparticelle. Pertanto, le nanoparticelle potrebbero mantenere la loro forma sferica e l’erosione sarebbe meno probabile che si verifichi. Inoltre, è stato osservato che queste nanoparticelle sono state aggregate in PBS a pH 7.4. Ciò può attribuire alla carica superficiale delle particelle più bassa delle nanoparticelle in PBS, vicino al neutro. La carica superficiale delle particelle che è scesa a zero può indicare che CS NPs ha subito la cancellazione della carica da parte di gruppi fosfatici di PBS. Lo stato di carica neutro di queste nanoparticelle può causare la perdita di forze intra-e intermolecolari, importanti per mantenere le nanoparticelle individualmente. Di conseguenza, queste nanoparticelle non caricate possono iniziare ad aggregare e destabilizzare il sistema colloidale. A differenza del PBS, l’acqua distillata può fornire numerosi ioni idrogeno per formare legami idrogeno che possono aiutare a rompere l’aggregazione di nanoparticelle interagendo con gruppi ionizzabili di CS NPS.

Lo studio di rilascio in vitro di BSA e siRNA da CS NPs è stato effettuato in tampone Tris-HCL. Il rilascio di BSA e siRNA potrebbe essere diviso in due fasi in base alla velocità di rilascio. Nella prima fase, il farmaco è stato rapidamente rilasciato da CS NPs. Il rilascio di BSA e siRNA in questa fase potrebbe comportare la diffusione di BSA / siRNA legato alla superficie della particella. Nella seconda fase, BSA / siRNA è stato rilasciato lentamente a causa del gonfiore o della degradazione del polimero. Il rimanente BSA / siRNA in CS NPs non sarebbe completamente rilasciato fino a quando le particelle non fossero completamente erose o dissolte nel mezzo di rilascio. Ciò potrebbe essere dovuto all’interazione tra il BSA/siRNA rimanente e il gruppo amminico libero sui segmenti CS . Inoltre, il sistema sintetizzato che è stato precedentemente descritto come in grado di essere formulato in condizioni miti ha assicurato che la stabilità delle proteine caricate in CS NPs era intatta come determinato da SDS-PAGE.

5. Conclusioni

In sintesi, questo studio mostra che la concentrazione di CS e DS e il pH erano i parametri che controllavano la dimensione delle particelle e la carica superficiale di CS NPs. Nanoparticelle inferiori a 500 nm potrebbero essere ottenute con un rapporto peso DS: CS di 0,5: 1 a pH 4. Nel caso dell’intrappolamento di BSA, le nanoparticelle con rapporti di peso DS : CS più elevati hanno avuto efficienze di intrappolamento superiori all ‘ 88%. La più alta percentuale di efficienza di intrappolamento raggiunta è stata pari allo 0,10% p / v DS (rapporto DS : CS di 1 : 1). Tuttavia, CS NPS caricato con siRNA ha mostrato un’elevata efficienza di intrappolamento (>90%) per tutti i rapporti DS : CS. La temperatura di stoccaggio e il mezzo di sospensione sono risultati essere i fattori che potrebbero influenzare la stabilità di CS NPs. CS NPS erano labili e tendono a destabilizzare a temperatura ambiente, ma trattenere questo comportamento labile quando ambiente fresco (2-4°C) è stato fornito. Inoltre, CS NPS aveva una migliore stabilità in acqua distillata che in PBS che potrebbe essere dovuto a legami idrogeno che si formano tra molecole d’acqua e gruppi ionizzabili di CS NPS.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi personali o finanziari nella ricerca in corso.

Riconoscimento

Gli autori riconoscono con gratitudine il “Dana Lonjakan Penerbitan” dell’Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM-DLP-2011-001) per il finanziamento e il sostegno all’attuale progetto di ricerca.