rozwój nanocząstek chitozanu jako stabilnego systemu dostarczania leków dla białka/siRNA

Streszczenie

nanocząstki chitozanu (CS NPs) wykazują dobre właściwości fizykochemiczne jako systemy dostarczania leków. Celem pracy jest określenie modulacji parametrów preparatywnych na właściwości fizyczne i stabilność koloidalną CS NPs. CS np wytwarzano przez interakcję jonową z siarczanem dekstranu (DS) przed określeniem ich trwałości podczas przechowywania. Najmniejsze CS NPs nm z ładunkiem powierzchniowym mV uzyskano, gdy CS i DS zmieszano przy pH 4 i przy stosunku masy ds: CS 0,5: 1. Skuteczność uwięzienia wynoszącą 98% uzyskano po załadowaniu BSA / siRNA do nanocząstek. Wyniki wykazały również, że wielkość cząstek i ładunek powierzchniowy CS NPs zostały nieznacznie zmienione do 2 tygodni, gdy są przechowywane w temperaturze 4°C. większy rozmiar cząstek i ładunek powierzchniowy uzyskano przy zwiększaniu stężenia DS. Podsumowując, NPs były wystarczająco stabilne, gdy były przechowywane w temperaturze 4°C i zdolne do przenoszenia i ochrony białka.

1. Wprowadzenie

endogenne peptydy, białko i oligonukleotydy są jednymi z głównych leków, które przyciągają uwagę ze względu na duży potencjał w leczeniu chorób przewlekłych . Jednak ekstremalne środowisko in vivo ludzkiego ciała zawsze ograniczało terapeutyczne zastosowania tych substancji . Nanocząstki polimerowe przyciągnęły wiele uwagi jako systemy dostarczania ze względu na ich zdolność do pokonywania barier fizjologicznych oraz ochrony i kierowania załadowanych substancji do określonych komórek . Naturalnie występujące polimery, takie jak chitozan (CS) badano do tworzenia nanocząstek . CS jest biodegradowalnym polisacharydem i pochodzi z deacetylacji chityny . Oprócz biokompatybilności, niska toksyczność, hemostatyczne i bakteriostatyczne właściwości przyczyniają się również do różnych zastosowań w dziedzinie farmacji . Kilka anionów zostało zbadanych w celu usieciowania CS, takich jak siarczan sodu i siarczan dekstranu (DS) . DS jest w stanie modyfikować skuteczność uwięzienia białka i siRNA (ee) bez użycia środków utwardzających i kontrolować szybkość uwalniania leku ze względu na wysoką gęstość ładunku . Poza tym DS jest tanim materiałem, wytwarza mechanicznie bardziej stabilne nanocząstki w porównaniu do tripolifosforanu pentasodu (TPP) .

w kilku badaniach odnotowano unikalne cechy nanocząstek chitozanu (CS NPS) przy użyciu DS. Jednak modulacja parametrów preparatywnych na ich właściwości fizyczne nie jest jeszcze w pełni zbadana, na przykład wpływ przeszkody sterycznej DS na przyciąganie elektrostatyczne między CS i BSA . Ponadto wyznacznik skutecznego systemu podawania leku zależy od jego właściwości fizycznych i stabilności. W związku z tym celem niniejszego badania była modulacja parametrów preparatywnych w celu uzyskania nanozwiązanych cząstek CS NPs oraz określenie ich trwałości koloidalnej w różnych temperaturach przechowywania i w różnych nośnikach zawiesinowych.

2. Materiały i metody

2.1. Materiały

chitozan o niskiej masie cząsteczkowej (70 kDa ze stopniem deacetylacji 75%-85%), kwas octowy lodowaty, sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS), albumina surowicy bydlęcej (BSA, 46 kDa) i odczynnik Bradforda zostały zakupione od Sigma-Aldrich Inc., USA. Dwuniciowy siRNA (sens: 5′-GAUUAUGUCGGUUAUGUAUU-3′, antysens: 3′-UACAUAACCGACAUAAUCUU-5′) został zakupiony w Thermoscientific Dharmacon w USA. Siarczan dekstranu (DS) został zakupiony w Fisher Scientific w Wielkiej Brytanii. Drabina białkowa (Wysoki zakres), bufor próbki Laemmli, 10x bufor siarczanu dodecylu tris/glicyny/sodu, Nadsiarczan amonu, tetrametylenodiamina (TEMED), 2% roztwór bis i 40% roztwór akrylamidu zakupiono w firmie Bio-Rad, USA. Bufor Tris-HCl otrzymano z Invitrogenu w USA. Wszystkie inne użyte chemikalia były klasy analitycznej.

2.2. Przygotowanie ślepej próby i CS NPS

CS i DS roztwór rozpuszczono odpowiednio w 1% obj.kwasu octowego i wodzie destylowanej. pH roztworu CS dostosowano do pH 4 przez dodanie 1 M NaOH lub 1 m HCl. Roztwór DS (0,05%, 0,1%, 0.15%, 0,2% i 0,25% w/v) dodano kroplami do roztworu CS (0,1% w/v) pod mieszadłem magnetycznym (WiseStir Digital Multipoint Magnetic Stirrer MS-MP8, Daihan Scientific, Korea) przy 250 obr. / min przez 15 minut w celu utworzenia nanocząstek. Wszystkie próbki wykonano w trzech egzemplarzach. Otrzymane nanocząstki przemyto i zebrano w drodze ultracentryfugacji (Optima l-100 XP Ultracentryfuge z wirnikiem NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) dwa razy przy 12 500 obr./min przez 15 minut w temperaturze 10°C. w celu połączenia BSA z CS NPS, BSA rozpuszczono w roztworze CS (0,1% w/v, pH 4) w celu uzyskania końcowego stężenia 1 mg / mL. CS NPS załadowane BSA zostały następnie przygotowane powyższą metodą. W celu powiązania siRNA z CS NPs do roztworu DS Dodano 3 µL siRNA (15 µg/µL) w dejonizowanej wodzie (0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, i 0,25% w/v) przed dodaniem tego kroplami do roztworu CS (0,1% w/v).

2.3. Badanie mobilności elektroforetycznej

pomiary mobilności elektroforetycznej () CS NPs przeprowadzono za pomocą Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK) i mierzono czas oczekiwania. Każdą próbkę analizowano w trzech egzemplarzach.

2.4. Charakterystyka nanocząstek

wielkość cząstek, ładunek powierzchniowy i wskaźnik polidyspersyjności (PDI) świeżo przygotowanego CS NPs mierzono za pomocą Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK), w oparciu o techniki spektroskopii korelacji fotonów (pcs). Podczas analizy nie przeprowadzono rozcieńczeń. Każdą próbkę analizowano w trzech egzemplarzach. Pomiary wykonano w temperaturze 25°C.

2,5. Analiza morfologiczna

charakterystyka morfologiczna nieobciążonych CS NPs, BSA / siRNA załadowanych CS NPS (ds: CS stosunek wagowy 0,5: 1 , 1 : 1) przeprowadzono przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej (tem), Tecnai Spirit, FEI, Eindhoven (Holandia).

2.6. Wydajność uwięzienia BSA/siRNA

załadowane BSA/siRNA CS NPs zostały oddzielone od roztworu przez ultracentryfugację (Optima l-100 XP Ultracentryfuge z wirnikiem NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) przy 14000 obr. / min przez 30 min. Supernatanty odzyskane z odwirowania były dekantowane. Zawartość BSA w supernatancie analizowano spektrofotometrem UV-Vis przy 595 nm (U. V-1601; Shimadzu, Japonia) przy użyciu testu białka Bradforda zgodnie z instrukcją producenta. zawartość siRNA w supernatancie analizowano spektrofotometrem UV-Vis przy 260 nm. Próbki przygotowano i zmierzono w trzech egzemplarzach. Efektywność uwięzienia BSA / siRNA (ee) obliczono za pomocą następującego równania:

2.7. Stabilność CS NPS

świeżo przygotowany CS NPS (wykonany z 0,05% i 0,1% wagowych roztworu DS i CS, lub) wirowano z prędkością 12 500 obr / min przez 15 minut przed przechowywaniem. Po ultracentryfugacji otrzymane granulki ponownie zawieszono w wodzie destylowanej (zmierzone pH 6,6) lub PBS pH 7,4. Wielkość cząstek i ładunek powierzchniowy mierzono z góry ustalonym czasem przechowywania(0, 1, 2, 3, 5, 8,

2, 8. Badanie in Vitro uwalniania leku

uwalnianie BSA/siRNA oznaczono z CS NPs o najwyższym współczynniku EE (ds: CS stosunek 1: 1, ee = 98% ± 0,2 i, resp.). Załadowane BSA / siRNA CS NPs zawieszono w roztworze buforowym Tris-HCl (pH 7,4, 4 mL) i umieszczono na mieszadle magnetycznym z prędkością mieszania 100 obr. / min w 37°C (MS MP8 Wise Stir Wertheim, Niemcy) przez 48 godzin w 37°C. w ustalonych odstępach czasu (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 20, 24, i 48 h), próbki odwirowywano przy 14 000 obr. / min przez 30 min w temperaturze 10°C. Następnie supernatant dekantowano i zastąpiono równoważną objętością świeżego roztworu buforowego. Ilość uwolnionego BSA / siRNA w supernatancie analizowano spektrofotometrem UV-Vis (U. V-1601; Shimadzu, Japonia) przy długości fali odpowiednio 280 i 260 nm.

2.9. Integralność BSA

integralność BSA uwolnionego z CS NPs oznaczono za pomocą SDS-PAGE (12% rozdzielcza i 10% żelu układającego) przy użyciu systemu Mini-Protein (Bio-Rad, USA). Próbki BSA zmieszano z buforem Laemmli w stosunku 1: 1 i ogrzewano w temperaturze 95°C przez 5 minut. Próbki (15 µL) załadowano do studzienek i żel przepuszczano za pomocą komórki Tetra systemu Mini-białkowego przy stałym napięciu 150 V przez 90 minut z buforem roboczym zawierającym 25 mM Tris, 192 mm glicynę i 0,1% SDS przy pH 8,3. Pasma próbki barwiono przez 40 minut 0,1% roztworem coomassie Blue zawierającym 40% kwasu octowego i 10% metanolu, a następnie barwiono przez noc roztworem 40% kwasu octowego i 10% metanolu.

2.10. Analiza statystyczna

wszystkie dane przedstawiono jako średnie ± odchylenie standardowe (SD). Analiza statystyczna (test ANOVA i analiza posthoc Tukeya) została przeprowadzona przy użyciu pakietu statystycznego dla programu społecznego (SPSS) w wersji 15. Wartość < 0,05 wykazała istotną różnicę między średnią badanych grup.

3. Wyniki

3.1. Wielkość cząstek i ładunek powierzchniowy

Rysunek 1(A) przedstawia wyniki mobilności elektrycznej () w stosunku do czasu oczekiwania. Z wykresu można było zaobserwować, że pozostał plateau i stały po 30 min. Pokazuje to, że tworzenie stabilnej elektrycznej podwójnej warstwy (e.d.l.) nie było natychmiastowe, ale wymagało kilku chwil. Wpływ pomiędzy stężeniem CS a stężeniem końcowym DS na wielkość NPS CS przedstawiono na fig. 1 (b). Zaobserwowano, że większość NPS CS o wielkości mniejszej niż 500 nm uzyskano przy niskim stężeniu CS (0,1% w/v). Stężenie DS miało również wpływ na wielkość nanocząstek (). Wzrost wielkości cząstek można zaobserwować przy zwiększaniu stężenia DS z 0,05 do 0,25% w / v. ogólnie, stężenie DS wynosi 0.05% w / v (niskie stężenie) wytwarzało nanocząstki o wielkości cząstek mniejszej niż 500 nm. W przeciwieństwie do tego, Duże nanocząstki (>1000 nm) uzyskano, gdy stężenie obu polimerów zostało zwiększone do 0,25% lub powyżej. Na podstawie wyników, stężenia DS od 0,05 do 0,20% wagowych wybrano do następujących badań. Ponadto wzrost stosunku masy DS: CS (większa gęstość ujemnych ładunków z DS obecnych w systemie) doprowadził do wzrostu wielkości cząstek, ale do zmniejszenia ładunku powierzchniowego cząstek (Tabela 1 (powyżej)). Ponieważ masa CS przekroczyła masę DS, uzyskano dodatnią wartość + 56,2 ± 1,5 mV. Jednak ładunek powierzchniowy cząstek zmniejszył się do − mV, gdy dodano więcej ujemnie naładowanych DS. Stale malał, gdy stosunek wagowy DS : CS osiągnął 2,5: 1. Spodziewano się, że będzie to spowodowane nadmiarem cząsteczek DS nagromadzonych na powierzchni nanocząstek.

(a)

(b)

(a)
(b)

Rysunek 1

ruchliwość elektroforetyczna jako funkcja czasu (a) i wpływ końcowych stężeń CS i DS na wielkość cząstek nanocząstek (b),.

Tabela 1 (poniżej) pokazuje, że DS 0,2% w/v posiadał największą wielkość cząstek po załadowaniu BSA. Wielkość cząstek wynosiła nm. Wielkość cząstek dla DS w stężeniu 0,1 i 0.15% w / v było również większe niż puste (). Z drugiej strony, wyższe dodatnie wartości ładunku powierzchniowego zaobserwowano dla nanocząstek obciążonych BSA w porównaniu do pustych. Obserwowano to dla wszystkich stężeń DS. Ponadto wyższe wartości EE można osiągnąć poprzez zwiększenie stosunku wagowego DS: CS powyżej 0,5 : 1. EE nanocząstek w stosunku wagowym ds : CS 1 : 1, 1,5 : 1 i 2 : 1 wynosiło odpowiednio%, % i%. Najwyższe EE uzyskano przy stosunku wagowym ds: CS 1: 1 (Tabela 1 (poniżej)).

Tabela 2 pokazuje, że DS 0.2% wagowych posiadało największą wielkość cząstek (900 ± 60 nm) po załadowaniu siRNA. CS NPS obciążone siRNA w różnych stężeniach DS (0,05, 0,1, 0,15 i 0,2% w/v) wykazały mniejszy rozmiar cząstek. EE nanocząstek w stosunku wagowym ds: CS 0.5 : 1, 1 : 1, 1.5 : 1, i 2: 1 wynosiły odpowiednio%,%, % i%.

3.2. Morfologia

obrazy CS NPs uzyskano za pomocą tem (Rysunek 2). Rysunki 2(a) i 2(b) pokazują, że nieobciążone CS NPs wykazywały strukturę sferyczną. Na zdjęciach wykazano, że nanocząstki wytworzone z siRNA(fig. 2(e) i 2 (f)) wykazywały nieregularną morfologię; jednak nanocząstki obciążone BSA wykazywały wydłużone morfologie(fig.2(c) i 2 (d)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Rysunek 2

zdjęcia tem z CS NPs. a) i b) rozładowane CS NPs przy 0,5 : 1 i 1: 1, c) I d) BSA załadowane CS NPS przy 0,5: 1 i 1 : 1, oraz (e) i (f) siRNA załadowały CS NPs odpowiednio w 0,5 : 1 i 1 : 1. Wszystkie zdjęcia wykonano przy powiększeniu 60 kX.

3.3. Stabilność przechowywania CS NPS

zarówno nanocząstki wykonane z 0,05 i 0,10% wagowych DS zwiększały się w czasie, jak pokazano na fig. 3(a) podczas przechowywania w temperaturze otoczenia. Po 14. dniu przechowywania zaobserwowano znaczny wzrost wielkości cząstek, zwłaszcza dla 0,05% wagowych DS. Uważano, że jest to spowodowane tworzeniem się skupisk. To odkrycie potwierdziły wyniki ładunku powierzchniowego, które wykazały spadek ładunku powierzchniowego do prawie neutralnego. W przeciwieństwie do tego, gdy były przechowywane w temperaturze 4°c, ich wielkość cząstek i ładunek powierzchniowy pozostały niezmienione do 14 dni dla nanocząstek wykonanych z 0,10% w/v DS. Zaobserwowano nieznaczną zmianę dla 0,05% M / v DS(Fig. 4(A) i 4 (b)). Z drugiej strony, gdy te nanocząstki zawieszono w PBS pH 7,4, wszystkie preparaty agregowano do większych rozmiarów większych niż 1 µm o wartościach PDI większych niż 0,5. Ich ładunki powierzchniowe były również prawie neutralne, wahały się od +0.2 do +2,5 mV.

(a)

(b)

(a)
(b)

Rysunek 3

(a) wielkość cząstek i (b) ładunek powierzchniowy CS NPs przygotowany w 0,05 i 0,01% wagowych roztworu DS i przechowywany w temperaturze 25°C. nanocząstki zawieszono w wodzie destylowanej (pH w zakresie 6-7),.

(a)

(b)

(a)
(b)

Rysunek 4

(a) wielkość cząstek i (b) ładunek powierzchniowy CS NPs przygotowany w 0,05 i 0,10% wagowych i przechowywany w temperaturze 4°C. nanocząstki zawieszono w wodzie destylowanej (pH w zakresie 6-7),.

3.4. BSA in Vitro Release and Integrity

Fig.5(A) ilustruje, że uwalnianie BSA można podzielić na dwa etapy w zależności od szybkości uwalniania. W pierwszym etapie BSA został szybko uwolniony z CS NPs i wykazał uwalnianie seryjne w ciągu pierwszych 6 godzin. spowodowało to skumulowane uwalnianie BSA w 45% ± 5. W drugim etapie BSA był powoli uwalniany od 6 do 48 godzin, co skutkowało łącznym uwalnianiem BSA o ponad 60%. Integralność BSA uwolnionego z CS NPS została oceniona przez SDS-PAGE i jest pokazana na rysunku 5 (b). Zaobserwowane zespoły potwierdziły, że BSA, który przetrwał procesy ładowania i uwalniania w temperaturze 37°C po dniach 1 i 2, nie różnił się od świeżo przygotowanych norm BSA. W związku z tym można stwierdzić, że BSA pozostała w swojej rodzimej formie w CS NPs w warunkach eksperymentalnych.

(a)

(b)

(a)
(b)

Rysunek 5

(a) profil uwalniania BSA załadowany CS NPS w stosunku ds: CS 1: 1 przy pH 7.4, . b) SDS-PAGE analysis of BSA released from CS NPs: (M) SDS-PAGE standards (BIO-RAD); (a) BSA standard 1 mg/mL; (B) BSA standard 0,2 mg/mL; (C) ślepa próba; (d) unloaded CS NPs; (E) I (F) BSA released from CS NPs (ds : CS ratio 1 : 1) w dniach 1 i 2.

3.5. wydanie siRNA In Vitro

Fig.6 ilustruje, że uwalnianie siRNA można podzielić na dwa etapy w zależności od szybkości uwalniania. W pierwszym etapie siRNA został szybko uwolniony z CS NPs i wykazał uwalnianie seryjne w ciągu pierwszych 6 godzin. Spowodowało to skumulowane uwalnianie siRNA w 58% ± 5. W drugim etapie siRNA uwalniano powoli od 6 h do 48 h, w wyniku czego łączne uwalnianie BSA wynosiło ponad 85%.

Rysunek 6

profil uwalniania siRNA załadowany CS NPS w stosunku ds: CS 1: 1 przy pH 7,4,.

4. Dyskusje

metoda zastosowana do produkcji CS NPs w niniejszym badaniu jest procesem łagodnym i umożliwia kontrolę wielkości cząstek poprzez zmianę pewnych parametrów, na przykład stężenia dodanych soli, lepkości, ilości substancji niesolwentowych i masy cząsteczkowej polimeru. Badanie to rozpoczęto od badania w celu uzyskania informacji dotyczących stanu elektrycznego jonizowalnych grup CS NPS poprzez określenie czasu stabilizacji e.d. l. ten krok jest ważny dla uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Uzyskane dane sugerowały, że powstanie stabilnego e. d. l. podczas nanocząstek przygotowania wymagane kilka chwil po zatrzymaniu mieszania. Te momenty były potrzebne, aby elektrolity przenikały w kierunku jądra cząstek. Tak więc czas oczekiwania wynoszący 40 minut był potrzebny, aby można było dokładnie zmierzyć CS NPs. To odkrycie było podobne do CS-tripolifosforanu (CS-TPP) NPs, który sugerował ten sam czas oczekiwania .

przeprowadzono również badania mające na celu określenie wpływu stężenia polimeru na powstawanie cząstek. Celem badań było określenie zakresu stężeń polielektrolitów do wytwarzania nanocząstek o pożądanej wielkości. Aby zbadać wpływ różnych stężeń CS i DS na tworzenie nanocząstek, przygotowano roztwory CS i DS o stężeniach 0,1, 0,25 i 0,5% wagowych. Zmienne objętości roztworu DS(1, 2, 3, 4, 5, 5.8, i 10 mL) zmieszano z 5 mL każdego stężenia CS (0,1–0,5% m/v). Obliczono końcowe stężenie CS i DS, a rozmiary próbek podzielono na 100-500, 501-1000 lub więcej niż 1000 nm. Stwierdzono, że stężenie DS miało wpływ na wielkość cząstek. To odkrycie zostało potwierdzone wynikami CS – TPP NPs . Ogólnie rzecz biorąc, pożądany rozmiar nanocząstek mieści się w granicach 100-1000 nm. Jednak poprzednie badania wykazały, że załadowane nanocząstki normalnie wytwarzałyby większy rozmiar niż puste. Wielkość poniżej 500 nm jest zatem korzystna.

co więcej, Wyniki wykazały, że tylko stężenie DS wynoszące 0,05% w / v było w stanie wytworzyć nanocząstki o wielkości cząstek mniejszej niż 500 nm, jak pokazano w tabeli 1. Spodziewano się, że gdy oba polimery były w niskich stężeniach, dodanie DS do CS spowodowało małe jądra koakerwatu. W przeciwieństwie do tego, Duże coacervates, które przekroczyły 1000 nm wielkości tendencję do tworzenia, gdy stężenie obu polimerów wzrosła do 0,25% lub powyżej. Zdolność chitozanu do spontanicznego tworzenia koacerwatu wynika z interakcji przeciwstawnie naładowanych polielektrolitów w celu utworzenia kompleksu polielektrolitu o zmniejszonej rozpuszczalności. Mieszanina wysokiego stężenia DS z CS jest zatem bardziej prawdopodobne, aby wpływać na splątanie łańcuchów CS i rozpuszczalność powstałego kompleksu. W rezultacie powstanie wysoki stopień kompleksacji i koacervate . Zmniejszona lepkość przy niższym stężeniu CS również powodowała lepszą rozpuszczalność. Pozwoliło to na bardziej efektywną interakcję między kationowym CS i przeciwstawnie naładowanymi jonami, a tym samym uzyskano mniejszy rozmiar cząstek . Ponadto wzrost i nadmiar masy molowej użytego polianionu powodował powstanie większych cząstek, ponieważ powstały wysoce zneutralizowane kompleksy i miały tendencję do flokulacji . W tym badaniu ładunek powierzchniowy cząstek układu nanocząstek był zależny od stosunku wagowego DS i CS. Stwierdzono, że ładunek powierzchniowy cząstek wzrastał wraz ze zmniejszeniem stosunku. Związek ten może być przydatny w uzyskiwaniu pożądanej gęstości ładunku powierzchniowego cząstek w celu ułatwienia adhezji i właściwości transportowych nanocząstek.

w niniejszym badaniu włączenie BSA do CS NPs uzyskano po prostu przez zmieszanie kwaśnego roztworu CS zawierającego rozpuszczone cząsteczki BSA z roztworem DS w temperaturze pokojowej bez dodawania stabilizatora. BSA jest często stosowany jako białko modelowe, ponieważ obejmuje ogólną charakterystykę innych białek i jest biokompatybilny z ludźmi. Stwierdzono, że CS NPs były stosunkowo większe po załadowaniu za pomocą BSA. Spodziewano się, że rozmiar cząstek wzrośnie, gdy BSA został pomyślnie załadowany do nanocząstek. Tendencja ta może być prawdopodobnie spowodowana masą cząsteczkową i wielkością dodanych cząsteczek BSA. Te duże rozmiary cząstek mogą ograniczać ich wykorzystanie w dostarczaniu białka. Nanocząstki o długości 150-300 nm znajdują się głównie w wątrobie i śledzionie . Poza tym, według niektórych doniesień, zapotrzebowanie na “idealny” rozmiar nanocząstek opracowanych do leczenia raka wynosi od 70 do 200 nm . Chociaż nanocząstki nie powinny być większe niż 150 nm, aby przekroczyć barierę śródbłonka, Literatura zawsze podaje penetrację cząstek większych niż granice fenestracji. Rzeczywiście, fenestracja i unaczynienie mogą ulegać modyfikacji w różnych warunkach patologicznych .

na przykład wzrost guza spowoduje rozwój neowaskulatury charakteryzującej się nieciągłym śródbłonkiem z dużymi fenestracjami 200-780 nm . Poza tym zaobserwowano, że ładunek powierzchniowy nanocząstek obciążonych BSA był wyższy niż puste. Może to być spowodowane właściwością kationową posiadaną przez BSA, gdy występuje w stanie kwaśnym. Dodatnie ładunki z cząsteczek CS i BSA przyczyniły się zatem do zwiększenia wartości ładunku powierzchniowego cząstek dla załadowanych nanocząstek.

dodatnio naładowane polimery kationowe mogą skutecznie wiązać się i chronić kwasy nukleinowe, takie jak DNA , oligonukleotydy i siRNA . W badaniu tym włączanie siRNA do CS NPs uzyskano przez proste zmieszanie kwaśnego roztworu CS z roztworem DS zawierającym siRNA w temperaturze pokojowej. Stwierdzono, że wielkość cząstek CS NPs była stosunkowo mniejsza po załadowaniu siRNA. Mniejszy rozmiar CS NPS załadowany siRNA może być spowodowany neutralizacją ujemnych ładunków kwasu nukleinowego przez kationowy polimer w wyniku skondensowanych mniejszych nanocząstek. SiRNA loaded CS NPS również wykazywał większy potencjał zeta niż puste CS NPS, podążając tym samym trendem co BSA loaded CS NPS.

idealnie, udany system dostarczania powinien mieć wysoki stopień kojarzenia leków. Załadowany siRNA CS NPS wykazywał wyższą skuteczność uwięzienia (<90%) dla wszystkich współczynników wagowych ds: CS. Skuteczność uwięzienia nanocząstek w stosunku wagowym ds: CS 1: 1, 1,5 : 1, A 2 : 1 był wyższy niż stosunek wagowy 0,5 : 1. Zjawisko to było prawdopodobnie spowodowane większym udziałem DS w nanocząstkach. W miarę dodawania kolejnych DS ułatwiłoby to uwięzienie większej liczby BSA w nanocząstkach. Można to wyjaśnić faktem, że BSA jest cząsteczką zwitterionową. Przy pH pożywki formulacyjnej 3,5–4,0 rozpuszczalność BSA może być znacznie zwiększona z powodu zwiększonych posiadanych przez nią ładunków dodatnich . W ten sposób BSA byłby w stanie elektrostatycznie dołączyć i stabilnie załadować do nanocząstek. W kwaśnym roztworze BSA może posiadać ładunek dodatni i konkurować z CS, aby oddziaływać elektrostatycznie z DS. Stwierdzenie to zostało potwierdzone zwiększonymi dodatnimi ładunkami powierzchniowymi CS NPS załadowanych BSA w porównaniu z ładunkami rozładowanymi. Co więcej, na BSA znajdują się miejsca wielojonowe, a ta cecha może ułatwić włączenie BSA do nanocząstek. To odkrycie różni się od odkrycia z CS – TPP NPs.

w badaniu stwierdzono oddziaływanie elektrostatyczne pomiędzy BSA i CS, zamiast BSA i TPP. Zasugerowano również, że BSA powinien rozpuścić się w roztworze o pH wyższym niż jego punkt izoelektryczny, aby BSA posiadał ładunek ujemny i wchodził w interakcje z dodatnio naładowanymi cząsteczkami CS. Odkrycie to wykazało zatem, że oddziaływanie elektrostatyczne jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do promowania włączenia BSA do nanocząstek poprzez interakcję CS-białko lub DS-białko.

tem umożliwia nanoskalową wizualizację poszczególnych nanocząstek i dostarcza informacji zarówno o wielkości, jak i morfologii. Morfologia cząstek jest ważnym czynnikiem dla stabilności koloidalnej i chemicznej, a także bioaktywności nanocząstek. siRNA załadowany CS NPs wykazywał nieregularną morfologię; jednak BSA załadowany CS NPS wykazywał wydłużoną morfologię. Może to być spowodowane większym rozmiarem BSA, który może splątać się lub działać jak osłona dla CS, ograniczając w ten sposób całkowitą ekspozycję CS w strukturze.

ważny jest również Profil stabilności CS NPs podczas przechowywania. Informacje te mogą dostarczyć informacji na temat stabilności nanocząstek w różnych mediach i temperaturze. Stabilność nanocząstek badano oceniając ich zmienność średniej wielkości cząstek i ładunku powierzchniowego w czasie. Początkowo nanocząstki zawieszono w wodzie destylowanej o pH 6,6, która była filtrowana przez filtr 0,2 µm w celu usunięcia ewentualnych zanieczyszczeń obecnych w wodzie. Do tego badania przetestowano tylko nanocząstki wykonane z 0,05 i 0,10% wagowych DS. Inne stężenia DS nie zostały określone z powodu zwiększonego rozmiaru cząstek po odwirowaniu. Wielkość cząstek wynosiła odpowiednio do nm i nm dla 0,15% i 0,20% w/v DS. Przyrost wielkości cząstek może być spowodowany przez same CS NPs erozją i utratą sferycznego kształtu w środowisku wodnym, a w konsekwencji średnia średnica cząstek wzrośnie w odpowiedzi na tę erozję . Ponadto, ładunki powierzchniowe cząstek nanocząstek wytworzonych z obu stężeń malały z czasem. Podejrzewano, że CS może ulegać degradacji w środowisku wodnym, mimo braku lizozymów. Wyniki wykazały, że CS NPs były bardziej stabilne, gdy były przechowywane w temperaturze 4°C, ponieważ ich wielkość cząstek i ładunek powierzchniowy były niezmienione lub nieznacznie zmienione do 14 dni. Wyniki sugerują również, że CS NPs nie powinny być przechowywane w temperaturze otoczenia, ponieważ są one podatne na degradację. Wyniki sugerują zatem, że CS NPs przechowywane w temperaturze pokojowej są bardziej podatne na degradację niż te, które były przechowywane w chłodnym środowisku. Prawdopodobnie było to spowodowane chłodnym środowiskiem, które może spowolnić ruch kinetyczny nanocząstek. W ten sposób nanocząstki mogłyby zachować swój kulisty kształt, a erozja byłaby mniej prawdopodobna. Ponadto zaobserwowano, że te nanocząstki zostały zagregowane w PBS przy pH 7,4. Może to przypisać niższy ładunek powierzchniowy nanocząstek w PBS, zbliżony do neutralnego. Ładunek powierzchniowy cząstek, który spadł do zera, może wskazywać, że CS NPs został anulowany przez grupy fosforanowe PBS. Neutralny stan naładowania tych nanocząstek może powodować utratę sił wewnątrz-i międzycząsteczkowych, ważnych dla utrzymania nanocząstek indywidualnie. W rezultacie te niezaładowane nanocząstki mogą zacząć się agregować i destabilizować układ koloidalny. W przeciwieństwie do PBS, woda destylowana może dostarczać liczne jony wodorowe do tworzenia wiązań wodorowych, które mogą pomóc w zerwaniu agregacji nanocząstek poprzez interakcję z jonizowalnymi grupami CS NPs.

badanie in vitro uwalniania BSA i siRNA z CS NPs przeprowadzono w buforze tris-HCL. Uwalnianie BSA i siRNA można podzielić na dwa etapy w zależności od szybkości uwalniania. W pierwszym etapie lek został szybko uwolniony z CS NPs. Uwalnianie BSA i siRNA na tym etapie może obejmować dyfuzję BSA / siRNA związanego na powierzchni cząstek. W drugim etapie BSA / siRNA uwalniano powoli z powodu pęcznienia lub degradacji polimeru. Pozostałe BSA / siRNA w CS NPs nie zostaną całkowicie uwolnione, dopóki cząstki nie zostaną całkowicie erozji lub rozpuszczone w środowisku uwalniającym. Mogło to być spowodowane interakcją pomiędzy pozostałymi BSA / siRNA a wolną grupą aminową w segmentach CS . Ponadto zsyntetyzowany system, który został wcześniej opisany jako zdolny do formułowania w łagodnych warunkach, zapewnił, że stabilność białek załadowanych do CS NPs była nienaruszona, jak określono w SDS-PAGE.

5. Wnioski

podsumowując, badanie to pokazuje, że stężenie CS i DS, a także pH były parametrami kontrolującymi wielkość cząstek i ładunek powierzchniowy CS NPs. Nanocząstki mniejsze niż 500 nm można otrzymać w stosunku wagowym ds: CS 0,5: 1 przy pH 4. W przypadku uwięzienia BSA, nanocząstki o wyższych proporcjach wagowych ds: CS mają wyższą wydajność uwięzienia przekraczającą 88%. Najwyższy odsetek osiągniętej skuteczności uwięzienia wynosił 0,10% w / v DS (stosunek ds : CS 1 : 1). Jednak CS NPS załadowane siRNA wykazały wysoką skuteczność uwięzienia (>90%) dla wszystkich proporcji DS: CS. Stwierdzono, że temperatura przechowywania i nośnik zawieszający mogą mieć wpływ na stabilność CS NPs. CS NPs były niestabilne i mają tendencję do destabilizacji w temperaturze otoczenia, ale powstrzymują to labilne zachowanie, gdy zimne środowisko (2-4°C) został dostarczony. Ponadto CS NPs miał lepszą stabilność w wodzie destylowanej niż w PBS, co może być spowodowane wiązaniami wodorowymi tworzącymi się między cząsteczkami wody a jonizowalnymi grupami CS NPs.

konflikt interesów

autorzy oświadczają, że w obecnych badaniach nie ma osobistego ani finansowego konfliktu interesów.

uznanie

autorzy z wdzięcznością uznają “Dana Lonjakan Penerbitan” z Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM-DLP-2011-001) za finansowanie i wspieranie obecnego projektu badawczego.