o desenvolvimento de nanopartículas Quitosanas como um sistema estável de distribuição de drogas para proteínas/siRNA

Abstract

nanopartículas Quitosanas (CS NPs) apresentam boas propriedades físico-químicas como Sistemas de distribuição de drogas. O objectivo deste estudo é determinar a modulação dos parâmetros preparatórios sobre as características físicas e a estabilidade coloidal dos PCs. Os PCs foram fabricados por interacção iónica com o sulfato de dextrano (DS) antes da determinação da sua estabilidade de armazenagem. O menor CS NPs de nm com uma carga superficial de mV foi produzido quando CS e DS foram misturados a pH 4 e com uma razão de massa DS : CS de 0,5 : 1. Uma eficiência de aprisionamento de 98% foi alcançada quando a BSA/siRNA foi carregada nas nanopartículas. Os resultados também mostraram que o tamanho das partículas e a carga superficial de CS NPs foram ligeiramente alterados até 2 semanas quando armazenados a 4°C. foi obtida uma maior dimensão das partículas e carga superficial com o aumento da concentração de DS. Em conclusão, os PN eram suficientemente estáveis quando mantidos a 4°C e capazes de transportar e proteger proteínas.

1. Introdução

peptídeos endógenos, proteínas e oligonucleótidos estão entre as principais drogas que atraem muita atenção por causa de seus grandes potenciais no tratamento de doenças crônicas . No entanto, o ambiente in vivo extremo do corpo humano sempre limitou as aplicações terapêuticas destas substâncias . Nanopartículas poliméricas têm atraído muita atenção como Sistemas de entrega devido à sua capacidade de superar as barreiras fisiológicas e proteger e direcionar as substâncias carregadas para células específicas . Polímeros naturais como o quitosano (CS) foram estudados para formar nanopartículas . CS é um polissacárido biodegradável, e é derivado da desacetilação da quitina . Além de sua biocompatibilidade, as propriedades de baixa toxicidade, hemostática e bacteriostática também contribuem para suas várias aplicações no campo farmacêutico . Vários aniões foram investigados para interligar CS como sulfato de sódio e sulfato de dextrano (DS) . A DS é capaz de modificar a eficiência do entalamento de proteínas e siRNA (EE) sem o uso de agentes de endurecimento e controlar a taxa de liberação de drogas devido à sua alta densidade de carga . Além de DS é um material barato, produz nanopartículas mecanicamente mais estáveis em comparação com o Tripolifosfato pentassódico (TPP) .Vários estudos relataram as características únicas das nanopartículas quitosanas (CS NPs) usando DS. No entanto, a modulação dos parâmetros preparatórios sobre as suas características físicas ainda não é totalmente investigada, por exemplo, a influência do obstáculo estérico DS na atracção electrostática entre CS e BSA . Além disso, o determinante de um sistema de distribuição de droga bem sucedido depende das suas características físicas e da sua estabilidade. Portanto, os objetivos do presente estudo foram modular parâmetros preparatórios para obter partículas nanosizadas de CS NPs e determinar a sua estabilidade coloidal a diferentes temperaturas de armazenamento e em vários meios de suspensão.

2. Materiais e métodos

2.1. Materiais

quitosano de baixo peso molecular( 70 kDa com o grau de desacetilação 75% -85%), ácido acético glacial, tampão fosfato salino (PBS), albumina sérica bovina (BSA, 46 kDa), e reagente Bradford foi comprado da Sigma-Aldrich Inc., AMERICA. SiRNA de cadeia dupla (sentido: 5′ – GAUUAUUGUUCCGUUAUUAUU-3′, antisense: 3′ – UACAUAACCGACAUAAUCUU-5′) foi comprado de Dharmacon Termocientífico, EUA. O sulfato de dextrano (DS) foi comprado da Fisher Scientific, Reino Unido. A proteine ladder( High range), laemmli sample buffer, 10x tris/glycine/sodium dodecilsulfate buffer, ammonium persulfate, tetrametilenodiamine (TEMED), 2% bis solution, and 40% acrilamide solution were purchased from Bio-Rad, USA. O tampão Tris-HCl foi obtido a partir de Invitrogen, EUA. Todos os outros produtos químicos utilizados eram de Qualidade Analítica.

2.2. A preparação da solução CS NPS em branco e carregada com BSA

CS e DS foi dissolvida em ácido acético a 1% v/v e água destilada, respectivamente. o pH da solução CS foi ajustado para pH 4 adicionando 1 M NaOH ou 1 M HCl. Solução de DS (0, 05%, 0, 1%, 0.15%, 0,2% e 0,25% (m/v) foram adicionados gota a gota na solução CS (0,1% (M/v) sob agitação magnética (WiseStir Digital multiponto magnético MS-MP8, DAIHAN Scientific, Coreia) a 250 rpm durante 15 minutos para formar nanopartículas. Todas as amostras foram feitas em triplicado. A resultante das nanopartículas foram lavadas e colhidos por ultracentrifugation (Optima L-100 XP Ultracentrífuga com um rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, EUA), duas vezes, às 12 500 rpm por 15 min a 10°C. Para a BSA associação em CS NPs, a BSA foi dissolvido em CS solução de (0,1% w/v, pH 4) para produzir uma concentração final de 1 mg/mL. Os CS NPs carregados com BSA foram então preparados pelo método acima descrito. Para siRNA associação em CS NPs, 3 µL de siRNA (15 µg/µL) em água deionizada, foi adicionado à solução DS (0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, e 0,25% p/v), antes de adicionar esta gota a gota para CS solução de (0,1% w/v).

2.3. O estudo de mobilidade electroforética

medições de mobilidade electroforética () de CS NPs foi realizado com um Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Reino Unido) e foi medido contra o tempo de espera. Cada amostra foi analisada em triplicado.

2.4. Nanopartículas caracterizadas

granulometria, carga superficial e índice de polidispersibilidade (PDI) de CS NPs recém-preparados foram medidas usando um Nano ZS Zetasizador (Malvern Instruments, UK), baseado nas técnicas de espectroscopia de correlação de fótons (PCS). Não foram realizadas diluições durante a análise. Cada amostra foi analisada em triplicado. As medições foram feitas a 25 ° C.

2.5. Análise morfológica

caracterização morfológica de CS NPS sem carga, CS BSA / siRNA carregado CS NPs (DS: CS razão de peso de 0,5: 1, 1 : 1) foi realizada utilizando microscopia eletrônica de transmissão (met), Espírito Tecnai, FEI, Eindhoven (Países Baixos).

2.6. A eficiência de aprisionamento BSA / siRNA

os NPs carregados BSA / siRNA foram separados da solução por ultracentrifugação (Optima L-100 XP Ultracentrifuge com um rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, EUA) a 14000 rpm durante 30 minutos. Os sobrenadantes recuperados da centrifugação foram decantados. O teor de BSA no sobrenadante foi analisado por um espectrofotómetro UV-Vis a 595 nm (U. V-1601; Shimadzu, Japão) utilizando o ensaio de proteína de Bradford de acordo com as instruções do fabricante. o teor de siRNA no sobrenadante foi analisado por um espectrofotómetro UV-Vis a 260 nm. As amostras foram preparadas e medidas em triplicado. A eficiência de entalamento BSA/siRNA (EE) foi calculada utilizando a seguinte equação:

2.7. Estabilidade dos CS NPs

CS NPs recém-preparados (fabricados a partir de 0,05% e 0,1% P/v de DS e de solução CS, resp.) foram centrifugados a 12 500 rpm durante 15 minutos antes de serem armazenados. Após ultracentrifugação, os pellets obtidos foram ressuspendidos em água destilada (pH medido de 6, 6) ou PBS pH 7, 4. O tamanho das partículas e a carga da superfície foram medidos em durações de tempo de armazenamento pré-determinadas.(0, 1, 2, 3, 5, 8, e 14 dias) e à temperatura ambiente ou a 4°C.

2.8. Estudo in Vitro de Libertação de fármacos

a libertação de BSA/siRNA foi determinada a partir de CS NPs com a maior EE (DS : CS rácio 1 : 1, EE = 98% ± 0 , 2 e, resp.). O CS NPs carregado com BSA/siRNA foi suspenso numa solução tampão Tris-HCl (pH 7.4, 4 mL) e colocado num agitador magnético com uma velocidade de agitação de 100 rpm a 37°C (MS MP8 Wise Stir Wertheim, Alemanha) durante 48 h a 37°C. A intervalos de tempo predeterminados (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 20, 24, e 48 h), as amostras foram centrifugadas a 14 000 rpm durante 30 minutos a 10°C. depois, o sobrenadante foi decantado e substituído por um volume equivalente de solução-tampão fresca. A quantidade de BSA/siRNA libertada no sobrenadante foi analisada por um espectrofotómetro UV-Vis (U. V-1601; Shimadzu, Japão) com um comprimento de onda de 280 e 260 nm, respectivamente.

2.9. Integridade da BSA

a integridade da BSA libertada da CS NPs foi determinada pela SDS-PAGE (12% resolvendo e 10% empilhando gel) usando o sistema Mini-proteico (Bio-Rad, EUA). As amostras de BSA foram misturadas com o tampão de amostras de Laemmli numa proporção de 1 : 1 e aquecidas a 95°C durante 5 minutos. As amostras (15 µL) foram carregadas nos poços e o gel foi executado utilizando uma célula Tetra-sistema de Mini-proteínas a uma tensão constante de 150 V durante 90 minutos, com um tampão de funcionamento contendo Tris de 25 mM, 192 mM de glicina e 0,1% de SDS a pH 8.3. As bandas de amostragem foram manchadas durante 40 minutos com uma solução Azul de Coomassie a 0,1% contendo 40% de ácido acético e 10% de metanol, seguida de coloração durante a noite com uma solução de ácido acético a 40% e de metanol a 10%.

2.10. Análise estatística

todos os dados foram apresentados como média ± desvio-padrão (DP). A análise estatística (teste ANOVA e a análise póstoc de Tukey) foi realizada utilizando o pacote estatístico para a versão 15 do Programa Social (SPSS). Um valor < 0, 05 mostrou uma diferença significativa entre a média dos grupos testados.

3. Resultados

3.1. Granulometria e carga superficial

Figura 1 (A) demonstra os resultados da mobilidade eléctrica () em relação ao tempo de espera. A partir do gráfico, pôde-se observar que o planalto permaneceu e constante após 30 minutos. Isto demonstra que a formação de camada dupla elétrica estável (E. D. L.) não foi instantânea, mas exigiu alguns momentos. Os efeitos entre a concentração de CS e as concentrações finais de DS na dimensão de CS NPs são apresentados na Figura 1(b). Observou-se que a maior parte dos PCs de dimensão inferior a 500 nm foram obtidos a uma baixa concentração CS (0,1% p/v). A concentração de DS também influenciou a dimensão das nanopartículas (). Observou-se uma tendência crescente na dimensão das partículas, com o aumento da concentração de DS de 0,05% para 0,25% p/v. em geral, a concentração de DS de 0.05% (M / v) (baixa concentração) produziram nanopartículas de granulometria inferior a 500 nm. Ao contrário, foram obtidas nanopartículas grandes (>1000 nm) quando a concentração de ambos os polímeros foi aumentada para 0, 25% ou mais. Com base nos resultados, foram seleccionadas concentrações de DS de 0, 05 a 0, 20% (M/v) para os seguintes estudos. Além disso, um aumento do rácio de peso DS : CS (maior densidade de cargas negativas de DS presentes no sistema) levou a um aumento da dimensão das partículas, mas a uma diminuição da carga da superfície das partículas [Quadro 1 (acima)]. Como o peso CS excedeu a massa de DS, Obteve-se um valor positivo de +56,2 ± 1,5 mV. No entanto, a carga da superfície de partículas diminuiu para − mV quando mais carregados negativamente DS foram adicionados. Estava continuamente a diminuir quando a relação de peso DS: CS tinha atingido 2,5: 1. Isto era esperado para ser devido a um excesso de moléculas DS acumuladas na superfície das nanopartículas.

(a)

b)

(a)
b)

Figura 1

a mobilidade Eletroforética como uma função do tempo (a) e o efeito das concentrações finais de CS e DS em partículas de tamanho das nanopartículas (b), .

a Tabela 1 (abaixo) mostra que DS 0.2% w/v possuía o maior tamanho de partículas depois de ser carregado com BSA. O tamanho das partículas era nm. Granulometria das partículas para DS numa concentração de 0,1 e 0.15% w / v também era maior do que os vazios (). Por outro lado, foram observados valores positivos mais elevados de carga superficial para as nanopartículas carregadas de BSA em comparação com as vazias. Isto foi observado para todas as concentrações de DS. Além disso, os valores de EE mais elevados poderiam ser alcançados aumentando a relação de peso DS : CS acima de 0,5 : 1. O EE de nanopartículas em DS : CS rácio de peso de 1 : 1, 1.5 : 1 e 2 : 1 foi de%, % E%, Respectivamente. O EE mais elevado foi obtido com um rácio de peso DS : CS 1: 1 [Quadro 1 (infra)].

a Tabela 2 mostra que DS 0.2% p / v possuíam o maior tamanho de partículas (900 ± 60 nm) depois de serem carregados com siRNA. o siRNA carregou CS NPs em diferentes concentrações DS (0,05, 0,1, 0.15 e 0,2% p/v), mostrando Tamanho de partículas menor. A EE de nanopartículas em DS: CS rácio de peso de 0.5 : 1, 1 : 1, 1.5 : 1, e 2: 1 foi %,%,%, e%, respectivamente.

3.2. Morfologia

as imagens dos PCs foram obtidas por met (Figura 2). As figuras 2 (a) e 2(b) mostram que os PNS sem carga CS exibiam uma estrutura esférica. As imagens demonstraram que as nanopartículas geradas pelo siRNA [Figuras 2 (e) e 2(f)] apresentavam morfologia irregular; no entanto, as nanopartículas carregadas pelo BSA apresentavam morfologias alongadas [Figuras 2(c) e 2 (d)].

(a)

b)

(c)

d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figura 2

TEM imagens de CS NPs. (a) e (b) CS NPS descarregados a 0.5: 1 e 1: 1, (C) e (d) CS NPS carregados BSA a 0.5: 1 e 1 : 1, e e) E f) siRNA carregou CS NPs em 0.5 : 1 e 1 : 1, respectivamente. Todas as imagens foram tiradas com ampliação de 60 kX.

3.3. Estabilidade de armazenamento de CS NPs

ambas as nanopartículas feitas a partir de 0,05 e 0,10% w / V DS foram aumentadas em tamanho ao longo do tempo, como mostrado na Figura 3(a) quando armazenadas à temperatura ambiente. Foi observado um aumento significativo do tamanho das partículas após o dia 14 de armazenamento, especialmente para 0,05% P/v DS. Isto foi pensado para ser devido à formação de agregados. Este achado corroborou com os resultados da carga superficial que mostrou uma diminuição na carga superficial para quase neutro. Em contraste, quando foram armazenados a 4 ° C, O tamanho das partículas e a carga superficial permaneceram inalterados até 14 dias para as nanopartículas feitas a partir de 0,10% P/V DS. Foi observada uma ligeira alteração para 0,05% P / V DS [Figuras 4 A) e 4 b)]. Por outro lado, quando estas nanopartículas foram suspensas em PBS pH 7.4, todas as formulações foram agregadas a tamanhos maiores de mais de 1 µm com valores de PDI superiores a 0,5. Suas cargas de superfície de partículas também eram quase neutras, variando de +0.2 a + 2,5 mV.

(a)

b)

(a)
b)

Figura 3

(a) tamanho de Partícula e (b) a carga de superfície do CS NPs preparado no 0,05 e 0,01% (m/v) DS solução e armazenadas a 25°C. as Nanopartículas foram suspensos em água destilada (pH na faixa de 6 a 7), .

(a)

b)

(a)
b)

Figura 4

(a) tamanho de Partícula e (b) a carga de superfície do CS NPs preparado no 0,05 e 0,10% (m/v) e armazenadas a 4°C. as Nanopartículas foram suspensos em água destilada (pH na faixa de 6 a 7), .

3.4. BSA libertação e integridade in Vitro

Figura 5 (a) ilustra que a libertação de BSA pode ser dividida em duas fases com base na taxa de libertação. Na primeira fase, o BSA foi rapidamente liberado do CS NPs e mostrou um lançamento de ruptura no primeiro 6 h. Isso resultou em uma liberação cumulativa de 45% ± 5 do BSA. Na segunda fase, o BSA foi lentamente liberado de 6 h até 48 h, resultando em uma liberação cumulativa de BSA de mais de 60%. A integridade da BSA liberada da CS NPS foi avaliada pela SDS-PAGE e é mostrada pela Figura 5(b). As bandas observadas confirmaram que a BSA que tinha suportado os processos de carga e libertação a 37°C após os dias 1 e 2 não eram diferentes dos padrões recém-preparados da BSA. Por conseguinte, pode concluir-se que a BSA permaneceu na sua forma nativa nos PCs nas condições experimentais.

(a)

b)

(a)
b)

Figura 5

(a) O perfil de liberação de BSA carregado CS NPs em DS : CS proporção de 1 : 1 em pH 7.4, . (b) SDS-PAGE análise de BSA lançado a partir de CS NPs (M) SDS-PAGE padrões (BIO-RAD); (A) padrão de BSA a 1 mg/mL; (B) BSA padrão de 0,2 mg/mL; (C) branco; (D) descarregado CS NPs; (E) e (F) BSA lançado a partir de CS NPs (DS : CS proporção de 1 : 1) nos dias 1 e 2.

3.5. siRNA libertação In Vitro

Figura 6 ilustra que a libertação de siRNA pode ser dividida em duas fases com base na taxa de libertação. Na primeira fase, o siRNA foi rapidamente liberado do CS NPs e mostrou um lançamento rápido nas primeiras 6 horas. Isto resultou em uma libertação cumulativa de 58% ± 5 de siRNA. Na segunda fase, siRNA foi lentamente liberado de 6 h até 48 h, resultando em uma liberação cumulativa de BSA de mais de 85%.

Figura 6

the release profile of siRNA loaded CS NPs at DS: CS ratio of 1: 1 at pH 7.4, .

4. Discussões

o método utilizado para produzir CS NPs no presente estudo é um processo suave, e permite o controlo da dimensão das partículas através da variação de determinados parâmetros, por exemplo, concentração de sais adicionados, viscosidade, quantidade de não solventes e peso molecular do polímero. Este estudo foi iniciado com a pesquisa para obter informações sobre o estado elétrico dos grupos ionizáveis de CS NPs, determinando o tempo de estabilização de E. D. L. Esta etapa é importante para obter resultados confiáveis e reprodutíveis. Os dados obtidos sugerem que a formação de E. D. L. estável durante a preparação das nanopartículas, foram necessários alguns momentos após a paragem da agitação. Estes momentos foram necessários para que os electrólitos penetrassem no núcleo das partículas. Assim, era necessário um tempo de espera de 40 minutos antes de os CS NPs poderem ser medidos com precisão. Esta constatação foi semelhante à do CS-Tripolifosfato (CS-TPP) NPs, que sugeriu o mesmo tempo de espera .

foi também realizado um estudo para determinar a influência da concentração do polímero na formação de partículas. O estudo visava estabelecer a gama de concentrações de polielectrolitos para produzir nanopartículas com o tamanho desejado. Para estudar os efeitos da variação das concentrações de CS e DS na formação de nanopartículas, foram preparadas soluções de CS e DS de 0,1, 0,25 e 0,5% p/v. Volumes variáveis da solução de DS(1, 2, 3, 4, 5, 5.8, foram misturados com 5 mL de cada concentração CS (0, 1–0, 5% p/v). A concentração final de CS e DS foi calculada, e os tamanhos das amostras foram categorizados como 100-500, 501-1000, ou mais de 1000 nm. Verificou-se que o tamanho das partículas foi afectado pela concentração de DS. Esta descoberta corroborou com os resultados do CS-TPP NPs . Em geral, o tamanho desejado das nanopartículas confinou entre 100 e 1000 nm. No entanto, estudos anteriores mostraram que as nanopartículas carregadas normalmente produziriam um tamanho maior do que as vazias. O tamanho inferior a 500 nm é, portanto, favorável.

além disso, os resultados revelaram que apenas a concentração de DS de 0,05% (m/v) foi capaz de produzir nanopartículas de dimensão inferior a 500 nm, como demonstrado no quadro 1. Esperava-se como quando ambos os polímeros estavam em baixas concentrações, a adição de DS ao CS resultou em pequenos núcleos coacervados. Ao contrário disso, os grandes coacervados com dimensões superiores a 1000 nm tenderam a formar-se quando a concentração de ambos os polímeros aumentou para 0,25% ou mais. A capacidade do quitosan de formar espontaneamente coacervato é devida à interacção de polielectrolitos carregados de forma oposta para formar um complexo de polielectrolitos com solubilidade reduzida. A mistura de elevada concentração de DS com CS é, por conseguinte, mais susceptível de afectar o entrelaçamento das cadeias CS e a solubilidade do complexo resultante. Como resultado, um alto grau de complexação e coacervato será produzido . A diminuição da viscosidade a uma menor concentração de CS também resultou em maior solubilidade. Isto permitiu uma interação mais eficiente entre o CS catiônico e íons carregados opostos, e assim um tamanho de partícula menor foi produzido . Além disso, um aumento e excesso na massa molar do polianião usado resultou em partículas maiores porque complexos altamente neutralizados foram formados e eles tenderam a flocular . Neste estudo, a carga da superfície de partículas do sistema nanoparticular dependia da razão de peso de DS e CS. Descobriu-se que a carga da superfície de partículas era aumentada à medida que a razão diminuía. Esta relação pode ser útil na obtenção da densidade de carga superficial de partículas desejada para facilitar a aderência e as propriedades de transporte das nanopartículas.

no presente estudo, a incorporação de ASC na CS NPs foi conseguida simplesmente misturando a solução ácida CS contendo moléculas de ASC dissolvidas com a solução DS à temperatura ambiente sem adição de estabilizador. A BSA é frequentemente utilizada como uma proteína modelo porque abrange a característica geral de outras proteínas e é biocompatível para os seres humanos. Verificou-se que a CS NPs era comparativamente maior em tamanho após o carregamento com a BSA. Esperava-se que o tamanho das partículas aumentasse quando a BSA estava a ser carregada com sucesso em nanopartículas. Esta tendência pode ser possivelmente devido ao peso molecular e tamanho das moléculas de ASC adicionadas. Estes grandes tamanhos de partículas podem limitar o seu uso na entrega de proteínas. Nanopartículas de 150-300 nm são encontradas principalmente no fígado e no baço . Além disso, de acordo com alguns relatórios, a exigência de tamanho “ideal” para nanopartículas desenvolvidas para o tratamento do câncer está entre 70 e 200 nm . Embora as nanopartículas não devam ser superiores a 150 nm para atravessar a barreira endotelial, a literatura sempre relata a penetração de partículas maiores do que os limites das fenestrações. Na verdade, a fenestração e a vasculatura podem sofrer modificações sob várias condições patológicas .Por exemplo, o crescimento tumoral induzirá o desenvolvimento da neovasculatura caracterizada por endotélio descontínuo com grandes fenestrações de 200-780 nm . Além disso, observou-se que a carga da superfície de partículas da nanopartícula carregada pela BSA era maior do que as vazias. Isto pode ser devido à característica catiônica possuída pela BSA quando presente em condição ácida. As cargas positivas das moléculas CS e BSA contribuíram, portanto, para um valor mais elevado da carga superficial de partículas para as nanopartículas carregadas.

polímeros catiónicos carregados positivamente podem ligar-se e proteger ácidos nucleicos como o ADN, oligonucleótidos e siRNA . Neste estudo, a incorporação de siRNA em CS NPs foi conseguida simplesmente misturando a solução ácida CS com a solução DS contendo siRNA à temperatura ambiente. Verificou-se que o tamanho das partículas de CS NPs era comparativamente menor após o carregamento com siRNA. O tamanho menor de CS NPs carregado com siRNA pode ser devido à neutralização de cargas negativas de ácido nucleico por polímero catiônico resultando em nanopartículas de menor tamanho condensadas. O CS NPS carregado com siRNA também mostrou maior potencial zeta do que o CS NPS vazio, seguindo a mesma tendência que o CS NPS carregado com BSA.Idealmente, um sistema de distribuição bem sucedido deve ter um elevado grau de associação de medicamentos. O siRNA carregado CS NPs mostrou maior eficiência de entalamento (<90%) para todos os DS : razões de peso CS. A eficiência de entalamento das nanopartículas em DS : CS rácio de peso de 1: 1, 1.5 : 1, and 2 : 1 was higher than the weight ratio of 0.5 : 1. Este fenómeno deveu-se muito provavelmente a uma maior proporção de DS apresentados nas nanopartículas. Como mais DS adicionados, facilitaria mais BSA a ser preso em nanopartículas. Isto pode ser explicado pelo fato de que BSA é uma molécula zwitteriônica. No pH do meio de formulação de 3.5-4.0, a solubilidade do BSA pode ser altamente aumentada devido ao aumento de cargas positivas que ele possui . Assim, a BSA seria capaz de ligar eletrostaticamente e carregar estavelmente nas nanopartículas. Em solução ácida, BSA poderia possuir carga positiva e competir com CS para interagir com DS eletrostaticamente. Esta conclusão foi corroborada pelo aumento das cargas de superfície positivas dos CN carregados por BSA em comparação com os não carregados. Além disso, existem sítios multi-iónicos na BSA, o que poderia facilitar a incorporação da BSA nas nanopartículas. Este achado difere do achado com os NPs CS-TPP .

no estudo, a interacção electrostática esteve presente entre ASC e CS, em vez de ASC e TPP. Foi também sugerido que a BSA deve dissolver-se numa solução com pH superior ao seu ponto isoelétrico, a fim de que a BSA possua carga negativa e interaja com as moléculas CS carregadas positivamente. Este resultado demonstrou, portanto, que a interacção electrostática é o principal factor que contribui para promover a incorporação de BSA nas nanopartículas, quer através da interacção CS-proteína quer através da interacção DS-proteína.

TEM permite a visualização nano-escala de nanopartículas individuais e fornece informações de tamanho e morfologia. A morfologia das partículas é um fator importante para a estabilidade coloidal e química, bem como para a bioatividade das nanopartículas. os NPs carregados com siRNA mostraram morfologia irregular; contudo, os CS NPS carregados com BSA mostraram morfologia alongada. Isto pode dever-se a uma maior dimensão da BSA que pode enredar ou agir como um escudo para a CS, limitando assim a exposição global da CS dentro da estrutura.

o perfil de estabilidade do CS NPs após armazenamento também é importante. Esta informação poderia fornecer uma visão sobre a estabilidade das nanopartículas sob diferentes meios e temperatura. A estabilidade das nanopartículas foi investigada através da avaliação da sua variação no tamanho médio das partículas e na carga superficial ao longo do tempo. No início, as nanopartículas foram ressuspendidas em água destilada a pH 6.6, que foi filtrada por um filtro de 0,2 µm para remover possíveis contaminantes presentes na água. Para este estudo, apenas foram testadas nanopartículas feitas a partir de 0,05 e 0,10% P/v de DS. Outras concentrações de DS não foram determinadas devido ao aumento da dimensão das partículas após centrifugação. O tamanho das partículas foi de até nm e nm para 0,15% e 0,20% W/v DS, respectivamente. O incremento do tamanho das partículas pode ser devido ao próprio CS NPs corroer e perder sua forma esférica em um ambiente aquoso, e consequentemente o diâmetro médio da partícula aumentaria como resposta a esta erosão . Além disso, as taxas de superfície das partículas para as nanopartículas produzidas a partir de ambas as concentrações diminuíram ao longo do tempo. Suspeitava-se que o CS pode ser degradado em meio aquoso, embora na ausência de lisozimas. Os resultados mostraram que a CS NPs era mais estável quando armazenada a 4°C, uma vez que o tamanho das partículas e a carga superficial se mantiveram inalterados ou foram ligeiramente alterados até 14 dias. Os resultados também sugeriram que os PCs não devem ser armazenados à temperatura ambiente, uma vez que são propensos à degradação. Os resultados sugeriram, por conseguinte, que os PCs armazenados à temperatura ambiente são mais propensos à degradação do que os armazenados em ambiente fresco. Provavelmente devido ao ambiente frio que pode retardar o movimento cinético das nanopartículas. Assim, as nanopartículas poderiam manter a sua forma esférica e a erosão seria menos provável de ocorrer. Além disso, observou-se que estas nanopartículas foram agregadas em PBS a um pH 7.4. Isto pode atribuir-se à menor carga da superfície de partículas de nanopartículas em PBS, próximo do ponto neutro. A carga de superfície de partículas que caiu para zero pode indicar que os CS NPs foram sujeitos a uma anulação de carga por grupos de fosfatos de PBS. O status de carga neutra dessas nanopartículas pode causar a perda de forças intra e intermoleculares, importante para manter as nanopartículas individualmente. Como resultado, estas nanopartículas sem carga podem começar a agregar e desestabilizar o sistema coloidal. Em contraste com PBS, água destilada pode fornecer vários íons de hidrogênio para formar ligações de hidrogênio que podem ajudar na agregação de nanopartículas interagindo com grupos ionizáveis de CS NPs.

o estudo de libertação in vitro de BSA e siRNA de CS NPs foi realizado em tampão Tris-HCL. A liberação de BSA e siRNA pode ser dividida em duas fases com base na taxa de liberação. Na primeira fase, a droga foi rapidamente libertada da CS NPs. A libertação de BSA e siRNA nesta fase pode envolver a difusão de ligação BSA/siRNA na superfície da partícula. Na segunda fase, BSA / siRNA foi liberado lentamente devido a inchaço ou degradação do polímero. A BSA/siRNA restante em CS NPs não seria completamente libertada até que as partículas fossem completamente erodidas ou dissolvidas em meio de libertação. Isto pode ter sido devido à interação entre o restante grupo BSA/siRNA e amino livre nos segmentos CS . Além disso, o sistema sintetizado que foi anteriormente descrito como sendo capaz de ser formulado em condições suaves assegurou que a estabilidade das proteínas carregadas em CS NPs estava intacta, determinada pela SDS-PAGE.

5. Conclusões

em resumo, este estudo mostra que a concentração de CS e DS, bem como o pH, foram os parâmetros que controlam a dimensão das partículas e a carga superficial de CS NPs. Nanopartículas inferiores a 500 nm podem ser obtidas a uma relação de peso DS : CS de 0,5: 1 a pH 4. No caso de uma armadilha BSA, as nanopartículas com rácios de peso DS mais elevados : os rácios de peso CS possuíam eficiências de entalamento mais elevadas de mais de 88%. A percentagem mais elevada de eficiência de entalamento alcançada foi de 0,10% P/V DS (rácio DS : CS de 1 : 1). No entanto, os PCs carregados com siRNA mostraram elevada eficiência de entalamento (>90%) para todos os rácios DS : CS. Verificou-se que a temperatura de armazenamento e o meio de suspensão são os factores que podem influenciar a estabilidade da CS NPs. CS NPs eram láteis e tendem a desestabilizar à temperatura ambiente, mas retêm este comportamento labial quando o ambiente frio (2-4°C) foi fornecido. Além disso, CS NPs tinha melhor estabilidade em água destilada do que em PBS, o que pode ser devido a ligações de hidrogênio que se formaram entre moléculas de água e grupos ionizáveis de CS NPs.

conflito de interesses

os autores declaram que não há conflito de interesses pessoais ou financeiros na pesquisa atual.

reconhecimento

os autores reconhecem gratamente A “Dana Lonjakan Penerbitan” da Universiti Kebangsaan Malásia (UKM-DLP-2011-001) para financiamento e apoio ao Projeto de pesquisa atual.