CMV-promotormutanter med minskad benägenhet för produktivitetsförlust i CHO-celler

för att övervaka effekterna av metyleringsbenägna CpG-platser från förstärkaren, den proximala och kärnpromotorregionen valde vi att undersöka inte bara C-179 utan också cytosinerna vid positionerna -508 (C-508) och -41 (C-41). Ingen av de valda CPG-platserna överlappar med kända transkriptionsfaktorbindningsställen i Cricetidae-arter. För att bibehålla det totala GC-innehållet utförde vi C till G-transversioner (Fig. 1a). Förutom C-41 är C-13 det andra cytosinet i kärnpromotorområdet som verkar vara ofta metylerat. Eftersom mutation av C – 13 till G skulle skapa en ny CPG-plats föredrog vi att undersöka C-41G. de muterade promotorvarianterna förkortades med en tre bokstavskod, t.ex. variant GCC har guanin istället för cytosin vid position -508, medan cytosinbaserna vid -179 och -41 bevaras. CCC är den omuterade kontrollen hCMV-MIE (Fig. 1a). Muterade eller infödda promotorer infördes i olika plasmider och placerades uppströms om olika reportergener.

för att se om mutationerna påverkar promotorns styrka utförde vi två oberoende experiment genom att transient transfektera reporterplasmider som uttrycker utsöndrat embryonalt alkaliskt fosfatas (SEAP) i CHO-K1-celler och undersökte uttrycket av SEAP fem dagar efter transfektion. Den omuterade promotorn användes som referens (Fig. 1b). Uttrycket av SEAP från GGG -, GCG-och CGC-promotorer var konsekvent cirka 20% lägre än från den omuterade promotorn, med mindre variation mellan replikatexperimenten. I allmänhet visade C till G-mutationerna en tendens till blygsamt reducerad promotorstyrka som emellertid tycktes vara acceptabel.

Därefter frågade vi om hCMV-MIE promotorvarianter påverkar uttrycksstabiliteten hos permanent transfekterade CHO-celler under långvarig odling. För detta ändamål valde vi en eGFP-reporter som möjliggör cytometrisk analys av reporter-genuttryck på encellsnivå. eGFP reporter plasmider transfekterades i CHO-K1-celler och tre till fyra oberoende pooler av permanent transfekterade celler valdes med metotrexat (MTX). Dessa odlades under tre månader i närvaro av selektionsmedel MTX. Trettiofyra och åttiosju dagar efter transfektion mättes eGFP-uttryck med cytometri (två pooler förlorades mellan dag 34 och 87 på grund av kontaminering). De geometriska medlen för fluorescensintensiteten på 10 000 händelser per mätning beräknades för varje cellpool och plottades för båda tidpunkterna (Fig. 1c). Trettiofyra dagar efter transfektion var det liten skillnad mellan konstruktionerna. Endast en CGC-pool visade förhöjda uttrycksnivåer. Åttiosju dagar efter transfektion visade två av fyra pooler transfekterade med CGC och två av tre pooler transfekterade med CCG tydligt högre eGFP-värden än alla andra pooler, transfekterade antingen med den omuterade kontrollen eller de återstående promotorvarianterna. Dessa observationer föreslog en stabiliserande effekt av de enskilda C-41g-eller C-179g-mutationerna på eGFP-uttryck. För att konsolidera detta resultat upprepade vi experimentet med både promotorvarianter och med ett större antal pooler. Vi genererade tio pooler med CCG respektive CCC och åtta pooler med CGC (två pooler förlorades på grund av förorening). Cellerna odlades som tidigare och analyserades med flödescytometri från dag 42 till dag 69 efter transfektion (Fig. 1D och kompletterande Fig. S1 online). Efter 42 dagar ökade eGFP-uttrycket kraftigt i fyra CCG-pooler jämfört med CCC-kontrollpoolerna, medan två CGC-pooler visade en måttlig ökning av eGFP-uttryck (Fig. 1D, vänster panel). Efter 69 dagar visade tre CCG-pooler fortfarande höga nivåer av eGFP, medan eGFP-uttrycket för CGC-poolerna hade sjunkit till CCC-kontrollnivåer (Fig. 1D, höger panel). Skillnaderna mellan grupperna testades vid varje tidpunkt med det icke-parametriska stål-dwass-testet. Alfa-nivån sattes till 0,05. En signifikant skillnad observerades mellan CCG och CCC dag 56 efter transfektion (p = 0,0305; se kompletterande Fig. S1 online). Sammantaget resultaten av Fig. 1c, d föreslog att båda mutationerna C-41G och C-179g kan fördröja förlusten av hCMV-MIE-driven rekombinant genuttryck.

mutationer C-41g och C-179g hämmar fullständigt DNA-metylering på respektive ställe eftersom guanin inte kan metyleras. Vi undrade om dessa mutationer också påverkade metyleringsnivåer vid andra CpG-platser inom hCMV-MIE. Därför mätte vi metyleringsnivåerna för alla CpG-platser i de enskilda hCMV-MIE-varianterna genom bisulfitomvandling i kombination med nästa generations sekvensering. För detta ändamål extraherade vi genomiskt DNA från cellpoolerna i det andra experimentet 42 och 69 dagar efter transfektion och behandlade det med bisulfit för att skilja mellan metylerat och icke-metylerat cytosin. hCMV-MIE DNA förstärktes och sekvenserades med Illumina MiSeq-systemet (Fig. 1e). C-179 metylerades starkast inom alla pooler transfekterade med antingen CCC eller CCG, vilket bekräftade tidigare observationer med den omuterade hCMV-MIE12. Dessutom observerade vi ett distinkt metyleringsmönster som var mycket lika med alla pooler men skilde sig i Total intensitet. I synnerhet var unmutated C – 508 och C-41 konsekvent bland de vanligaste metylerade ställena. Mutationen av C – 41 i promotorvariant CCG, särskilt mutationen av C-179 i variant CGC, verkar enhetligt minska metyleringen av alla CpG-platser snarare än att ändra metyleringsmönstret. När vi beräknade de genomsnittliga metyleringsnivåerna över alla CpG-platser för varje pool upptäckte vi lägre total metylering med de muterade promotorvarianterna (se kompletterande Fig. S2 online). Skillnaden var mest uttalad med variant CGC men nådde inte statistisk signifikans med stål-dwass-testet (Xiaomi = 0.05). I genomsnitt ökade metyleringen med tiden med alla konstruktioner.

förutom epigenetisk promotor-tystnad är förlust av transgenkopior en viktig orsak till produktionsinstabilitet i rekombinanta celler20. För att uppskatta det relativa bidraget mätte vi plasmidkopianummer med qPCR 42 och 69 dagar efter transfektion. Genomsnittliga plasmidkopian siffror minskade med tiden, utan uppenbar skillnad mellan konstruktionerna (se kompletterande Fig. S2 online). Intressant nog skiftades fördelningen av kopianummer mot lägre värden i CGC-gruppen. Men när vi testade statistisk signifikans med Steel-Dwass-testet visade sig skillnaderna mellan konstruktionerna inte vara signifikanta (2,05 = 0,05).

pooler av permanent transfekterade celler är mycket heterogena blandningar av kloner som skiljer sig åt i transgenuttryck och tillväxthastighet. Högproduktiva kloner tenderar att ha en lägre tillväxttakt21. Därför växer lågproducerande celler, av vilka många är närvarande i kulturen efter transfektion, nästan oundvikligen över de höga producenterna förr eller senare. För att minimera denna bias undersökte vi mutationerna C-179g och C-41G i klonala cellinjer. Eftersom vi syftade till att bedöma effekterna på produktionen av en potentiell kommersiell produkt bytte vi till ett IgG-IL2-fusionsprotein som reporter. Således infördes promotorvarianter innehållande båda mutationerna antingen ensamma (CGC eller CCG) eller i kombination (CGG) uppströms den lätta kedjan och den tunga kedjagenen för en IgG-IL2-uttrycksplasmid.

Uttrycksplasmider som bär antingen CCG, CGC, CGG eller den omuterade hCMV-MIE transfekterades till CHO-K1-celler och stabilt transfekterade kloner isolerades i 384-brunnsplattor. Trettio klonala cellinjer per konstruktion valdes slumpmässigt och expanderades till sex-brunnsplattor. Efter att cellinjerna hade visat stabil tillväxt studerade vi deras produktivitet i ungefär två månader, från dag 68 till dag 134 efter transfektion. Vissa cellinjer förlorades på grund av kontaminering eller minskad livskraft, men 23 till 29 kloner per konstruktion undersöktes under hela tidsperioden.

under hela studien bestämde vi IGG-IL2-koncentrationer i cellodlings supernatanter och produktivitet per cell och dag (specifik produktivitet qP). I början (dag 68) och slutet (dag 134) av studien visade cellinjer transfekterade med CGC signifikant högre titrar än kontrolltransfektanterna (XXL = 0,05; Fig. 2a). Cellinjer med anmärkningsvärt höga titrar observerades också bland CGG-transfektanterna på dag 68 och bland CCG-och CGG-transfektanterna på dag 134. När vi jämförde specifika produktiviteter mellan cellinjer transfekterade med olika konstruktioner gjorde vi liknande observationer (Fig. 2b). För att kompensera för osäkerheten i cellräkning, vi genomsnitt de specifika produktiviteterna qP av två passager i början (dag 68-71 och 83-86 efter transfektion representerar de tidigaste tillgängliga datapunkterna) och tre passager i slutet av långsiktig odling (dag 124-127, dag 127-131 och dag 131-134 efter transfektion). Signifikanta skillnader mellan cellinjer transfekterade med CGC eller CCC observerades vid slutet av långvarig odling (0,05).

hCMV – Mie-varianterna CGC och CCG stabiliserar produktionen av rekombinant protein i klonala CHO-cellinjer.

(a) IGG-IL2-titrar av CHO-kloner 68 dagar (vänster panel) och 134 dagar (höger panel) efter transfektion. (b) specifik produktivitet qP av CHO kloner i början (vänster panel) och slutet (höger panel) av långsiktig odling. Tidiga qP-värden beräknades genom att medelvärdet av qP-värdena för två tidiga passager representerar de två tidigaste datapunkterna (dagar 68-71 och dagar 83-86 efter transfektion). Sena qP-värden beräknades genom att i genomsnitt beräkna de tre sista passagerna (dagar 124-127, dagar127–131 och dagar 131-134 efter transfektion) (c) procentuell förändring av specifika produktiviteter QP under långvarig odling baserat på data som visas i (b) med (vänster panel) och utan (höger panel) en outlier identifierad genom jackknife-analys. Endast kloner som producerar detekterbara nivåer av produkten på dag 68 beaktades. (a–c) promotorvarianternas identitet och antalet (N) oberoende cellpooler anges under x-axeln. Lådans övre och nedre ändar representerar den första och den tredje kvartilen i varje grupp. Ändarna på morrhåren representerar de lägsta och högsta värdena fortfarande inom 1,5-faldig interkvartilintervall. Den grå linjen anger det totala medelvärdet av Y-variabeln i diagrammet. Signifikanta skillnader (0,05 = 0,05) mellan grupperna enligt stål-Dwass-testet indikeras av p-värdena.

högre titrar och specifika produktiviteter hos cellinjer som bär G-179 eller G-41 föreslog en stabiliserande effekt av dessa mutationer på hCMV-MIE-driven genuttryck. För att dokumentera denna effekt beräknade vi den procentuella förändringen av qP under långvarig odling för varje enskild cellinje som det mest lämpliga måttet på dess produktionsstabilitet (Fig. 2c). Naturligtvis var detta endast möjligt med cellinjer som fortfarande producerar IGG-IL2 på dag 68 efter transfektion. En kontrolltransfektant ökade sin specifika produktivitet med 500% och identifierades som en outlier genom jackknife outlier-analys (Fig. 2C, vänster tomt). Därför utesluts denna cellinje från ytterligare analys (Fig. 2C, rätt tomt). Cellinjer transfekterade med antingen CGC eller CCG var signifikant stabilare än kontrollcellinjer transfekterade med CCC (0,05). Överraskande skilde sig den dubbla mutanten CGG inte från kontrollen.