utveckling av Chitosan nanopartiklar som ett stabilt läkemedelsleveranssystem för Protein / siRNA

Abstrakt

Chitosan nanopartiklar (CS NPs) uppvisar goda fysikalisk-kemiska egenskaper som läkemedelsleveranssystem. Syftet med denna studie är att bestämma moduleringen av preparativa parametrar på de fysiska egenskaperna och kolloidal stabilitet CS NPs. CS NPs tillverkades genom jonisk interaktion med dextransulfat (DS) före bestämning av deras lagringsstabilitet. De minsta CS NPS av nm med en ytladdning av mV producerades när CS och DS blandades vid pH 4 och med ett DS : CS-massförhållande på 0,5 : 1. En infångningseffektivitet på 98% uppnåddes när BSA/siRNA laddades in i nanopartiklarna. Resultaten visade också att partikelstorlek och ytladdning av CS NPs ändrades något upp till 2 veckor när de lagrades vid 4 msk C. större partikelstorlek och ytladdning erhölls med ökad koncentration av DS. Sammanfattningsvis var NP: er tillräckligt stabila när de hölls vid 4 msk C och kunde bära och skydda protein.

1. Introduktion

endogena peptider, protein och oligonukleotider är bland de viktigaste läkemedlen som lockar mycket uppmärksamhet på grund av deras stora potentialer vid behandling av kroniska sjukdomar . Emellertid har den extrema in vivo-miljön i människokroppen alltid begränsat de terapeutiska tillämpningarna av dessa ämnen . Polymera nanopartiklar har väckt mycket uppmärksamhet som leveranssystem på grund av deras förmåga att övervinna de fysiologiska barriärerna och skydda och rikta in de laddade ämnena till specifika celler . Naturligt förekommande polymerer såsom chitosan (CS) har studerats för att bilda nanopartiklar . CS är en biologiskt nedbrytbar polysackarid, och den härrör från deacetylering av kitin . Bortsett från dess biokompatibilitet bidrar de låga toxicitets -, hemostatiska och bakteriostatiska egenskaperna också till dess olika tillämpningar inom farmaceutiskt område . Flera anjoner har undersökts för att tvärbinda CS som natriumsulfat och dextransulfat (DS) . DS kan modifiera protein-och siRNA-infångningseffektivitet (EE) utan användning av härdningsmedel och kontrollera hastigheten för läkemedelsfrisättning på grund av dess höga laddningstäthet . Förutom DS är ett billigt material , producerar det mekaniskt mer stabila nanopartiklar jämfört med pentasodiumtripolyfosfat (TPP) .

flera studier hade rapporterat de unika egenskaperna hos chitosan nanopartiklar (CS NPs) med DS. Moduleringen av preparativa parametrar på deras fysiska egenskaper är emellertid fortfarande inte fullständigt undersökt, till exempel påverkan av DS steriskt hinder på den elektrostatiska attraktionen mellan CS och BSA . Vidare är determinanten av ett framgångsrikt läkemedelsleveranssystem beroende av dess fysiska egenskaper och stabilitet. Därför var målen för föreliggande studie att modulera preparativa parametrar för att erhålla nanosiserade partiklar av CS NPs och för att bestämma deras kolloidala stabilitet vid olika lagringstemperaturer och i olika suspenderande medier.

2. Material och metoder

2.1. Material

kitosan med låg molekylvikt (70 kDa med graden av deacetylering 75% -85%), ättiksyraglacial, fosfatbuffrad saltlösning (PBS), bovint serumalbumin (BSA, 46 kDa) och Bradford-reagens köptes från Sigma-Aldrich Inc., USA. Dubbelsträngad siRNA (känsla: 5′-GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUU-3′, antisense: 3′-UACAUAACCGGACAUAAUCUU-5′) köptes från Thermoscientific Dharmacon, USA. Dextransulfat (DS) köptes från Fisher Scientific, Storbritannien. Proteinstege (High range), Laemmli-provbuffert, 10x tris/glycin/natriumdodecylsulfatbuffert, ammoniumpersulfat, tetrametylendiamin (TEMED), 2% bis-lösning och 40% akrylamidlösning köptes från Bio-Rad, USA. Tris-HCl-buffert erhölls från Invitrogen, USA. Alla andra kemikalier som användes var av analytisk kvalitet.

2.2. Beredning av Blank och BSA-laddad CS NPs

CS och DS-lösning löstes i 1% v/v ättiksyra respektive destillerat vatten. pH för CS-lösningen justerades till pH 4 genom tillsats av 1 M NaOH eller 1 M HCl. DS-lösning (0,05%, 0,1%, 0.15%, 0.2% och 0.25% w/v) tillsattes droppvis i CS-lösning (0.1% w/v) under magnetisk omrörning (WiseStir Digital Multipoint magnetisk omrörare MS-MP8, DAIHAN Scientific, Korea) vid 250 rpm för 15 min för att bilda nanopartiklar. Alla prover gjordes i tre exemplar. De resulterande nanopartiklarna tvättades och skördades genom ultracentrifugering (Optima L-100 XP Ultracentrifuge med en rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) två gånger vid 12 500 rpm för 15 min vid 10 kcal C. För BSA-förening till CS NPs löstes BSA i CS-lösning (0,1% w/v, pH 4) för att producera en slutlig koncentration av 1 mg/mL. BSA-laddade CS NPs framställdes sedan med ovanstående metod. För siRNA-förening i CS NPs tillsattes 3 oc siRNA (15 oc/oc) i avjoniserat vatten till DS-lösningen (0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, och 0,25% w/v) innan du tillsätter denna droppvis till CS-lösning (0,1% w/v).

2.3. Elektroforetisk Mobilitetsstudie

elektroforetiska mobilitetsmätningar () av CS NPs utfördes med en Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK) och mättes mot väntetid. Varje prov analyserades i tre exemplar.

2.4. Nanopartiklar karakterisering

partikelstorlek, ytladdning och polydispersitetsindex (PDI) av nyberedd CS NPs mättes med användning av en Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK), baserat på Fotonkorrelationsspektroskopi (PCS) tekniker. Inga utspädningar utfördes under analysen. Varje prov analyserades i tre exemplar. Mätningarna gjordes vid 25 msk C.

2,5. Morfologisk analys

morfologisk karakterisering av lossad CS NPs, BSA / siRNA laddad CS NPs (DS: CS viktförhållande 0,5: 1, 1 : 1) utfördes med användning av transmissionselektronmikroskopi (TEM), Tecnai Spirit, FEI, Eindhoven (Nederländerna).

2.6. BSA / siRNA Infångningseffektivitet

BSA / siRNA-laddade CS NPs separerades från lösningen genom ultracentrifugering (Optima L-100 XP Ultracentrifuge med en rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) vid 14000 rpm under 30 min. Supernatanter som utvunnits från centrifugering dekanterades. BSA-innehåll i supernatanten analyserades med en UV-Vis-spektrofotometer vid 595 nm (U. V-1601; Shimadzu, Japan) med Bradford-proteinanalysen enligt tillverkarens instruktion. siRNA-innehållet i supernatanten analyserades med en UV-Vis-spektrofotometer vid 260 nm. Prover bereddes och mättes i tre exemplar. BSA / siRNA entrapment efficiency (EE) beräknades med följande ekvation:

2.7. Stabilitet av CS NPs

nyberedd CS NPs (Tillverkad av 0,05% och 0,1% w/v av DS och CS-lösning, resp.) centrifugerades vid 12 500 rpm i 15 minuter före lagring. Efter ultracentrifugering resuspenderades de erhållna pelletsna i antingen destillerat vatten (uppmätt pH på 6,6) eller PBS pH 7,4. Partikelstorleken och ytladdningen mättes vid förutbestämda lagringstidsperioder (0, 1, 2, 3, 5, 8, och 14 dagar), och vid antingen omgivningstemperatur eller 4 msk C.

2,8. In Vitro-Läkemedelsfrisättningsstudie

frisättningen av BSA / siRNA bestämdes från CS NPs med den högsta EE (DS : CS-förhållandet 1 : 1, EE = 98% 0,2 och , resp.). BSA / siRNA laddade CS NPs suspenderades i Tris-HCl buffertlösning (pH 7,4, 4 mL) och placerades på en magnetisk omrörare med en omrörningshastighet av 100 rpm vid 37 C (MS MP8 Wise rör Wertheim, Tyskland) för 48 h vid 37 C. C. vid förutbestämda tidsintervall (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 20, 24, och 48 h) centrifugerades proverna vid 14 000 rpm i 30 min vid 10 kcal C. Därefter dekanterades supernatanten och ersattes med en ekvivalent volym färsk buffertlösning. Mängden frisatt BSA / siRNA i supernatanten analyserades med en UV-Vis-spektrofotometer (U. V-1601; Shimadzu, Japan) vid en våglängd av 280 respektive 260 nm.

2.9. BSA-integritet

integriteten hos BSA som släpptes från CS NPs bestämdes av SDS-PAGE (12% upplösning och 10% staplingsgel) med Mini-Protein System (Bio-Rad, USA). BSA-prover blandades med Laemmli – provbuffert i 1: 1-förhållande och upphettades vid 95 kcal C i 5 minuter. Prover (15 occl) laddades in i brunnarna och gelen kördes med användning av en mini-proteinsystem Tetracell vid en konstant spänning på 150 V för 90 min med en löpande buffert innehållande 25 mM Tris, 192 mM glycin och 0,1% SDS vid pH 8,3. Provbanden färgades i 40 minuter med 0,1% Coomassie blue-lösning innehållande 40% ättiksyra och 10% metanol, följt av färgning över natten med en lösning av 40% ättiksyra och 10% metanol.

2.10. Statistisk analys

Alla data presenterades som genomsnittlig standardavvikelse för Taiwan (SD). Statistisk analys (ANOVA-testet och Tukeys posthoc-analys) utfördes med hjälp av det statistiska paketet för Social (SPSS) programversion 15. Ett värde < 0,05 visade signifikant skillnad mellan medelvärdet av testade grupper.

3. Resultat

3.1. Partikelstorlek och ytladdning

Figur 1(A) visar resultaten av elektrisk rörlighet () mot väntetid. Från grafen kunde det observeras att den återstående platån och konstant efter 30 min. Detta visar att bildandet av stabilt elektriskt dubbelskikt (e.d.l.) inte var omedelbart men krävde några ögonblick. Effekterna mellan CS-koncentration och DS-slutkoncentrationer på storleken på CS NPs presenteras i Figur 1 b. Det observerades att de flesta CS NPs med storleken mindre än 500 nm erhölls vid en låg CS-koncentration (0,1% w/v). DS-koncentrationen påverkade också storleken på nanopartiklar (). En ökande trend i partikelstorlek kunde observeras med ökande DS-koncentrationen från 0,05 till 0,25% w / v. i allmänhet DS-koncentration av 0.05% w/V (låg koncentration) producerade nanopartiklar med partikelstorlek mindre än 500 nm. I motsats till detta erhölls stora nanopartiklar (>1000 nm) när koncentrationen av båda polymererna ökades till 0,25% eller högre. Baserat på resultaten valdes DS-koncentrationer från 0,05 till 0,20% w/v för följande studier. Vidare ledde en ökning av DS : CS-viktförhållandet (högre densitet av negativa laddningar från DS närvarande i systemet) till en ökning av partikelstorleken men en minskning av partikelytans laddning (Tabell 1 (ovan)). Eftersom CS-vikten överskred massan av DS erhölls ett positivt värde på +56,2 1,5 MV. Partikelytans laddning minskade dock till-mV när mer negativt laddade DS tillsattes. Det minskade kontinuerligt när DS: CS – viktförhållandet hade nått 2,5: 1. Detta förväntades bero på ett överskott av DS-molekyler ackumulerade på ytan av nanopartiklar.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 1

elektroforetisk rörlighet som en funktion av tiden (a) och effekten av de slutliga koncentrationerna av CS och DS på partikelstorleken hos nanopartiklar (b),.

Tabell 1 (nedan) visar att DS 0.2% w/v hade den största partikelstorleken efter att ha laddats med BSA. Partikelstorleken var nm. Partikelstorlek för DS vid koncentration av 0,1 och 0.15% w / v var också större än de tomma (). Å andra sidan observerades högre positiva värden på ytladdning för BSA-laddade nanopartiklar jämfört med de tomma. Detta observerades för alla DS-koncentrationer. Dessutom kan högre EE-värden uppnås genom att öka DS: CS – viktförhållandet över 0,5: 1. EE av nanoparticles på DS: CS väger förhållandet av 1: 1, 1,5: 1 och 2: 1 var%, % och %, respektive. Den högsta EE erhölls vid ett DS: CS viktförhållande 1: 1 (Tabell 1 (nedan)).

Tabell 2 visar att DS 0.2% W / v hade den största partikelstorleken(900 60 nm) efter att ha laddats med siRNA. siRNA laddade CS NPs vid olika DS-koncentrationer (0,05, 0,1, 0,15 och 0,2% w/v) visade mindre partikelstorlek. EE av nanopartiklar vid DS: CS viktförhållande av 0.5 : 1, 1 : 1, 1.5 : 1, och 2: 1 var %,%, % respektive%.

3.2. Morfologi

bilderna av CS NPs erhölls med TEM (Figur 2). Figurerna 2 (A) och 2 (b) visar att lossad CS NPs uppvisade en sfärisk struktur. Bilderna visade att nanopartiklar genererade från siRNA(figurerna 2(e) och 2 (f)) visade oregelbunden morfologi; emellertid visade BSA-laddade nanopartiklar långsträckta morfologier(figurerna 2(c) och 2 (d)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figur 2

TEM bilder av CS NPs. a) och b) lossad CS NPs vid 0,5 : 1 och 1: 1, c) och d) BSA laddad CS NPs vid 0,5 : 1 och 1 : 1, och (e) och (f) siRNA laddade CS NPs vid 0,5 : 1 respektive 1 : 1. Alla bilder togs med 60 KX förstoring.

3.3. Lagringsstabilitet hos CS NPs

båda nanopartiklarna tillverkade av 0,05 och 0,10% w / v DS ökades i storlek över tiden som visas i Figur 3(A) när de lagras vid omgivande temperatur. En signifikant ökning av partikelstorleken observerades efter dag 14 av lagring speciellt för 0,05% w/v DS. Detta ansågs bero på bildandet av aggregat. Detta resultat bekräftades med resultaten av ytladdning som visade en minskning av ytladdning till nästan neutral. I kontrast, när de lagrades på 4 ACC C, deras partikel storleksanpassar och ytbehandlar laddning som var oförändrad upp till 14 dagar för nanoparticles som göras från 0,10% w / v DS. En liten förändring observerades för 0,05% w / v DS(figurerna 4(A) och 4 (b)). Å andra sidan, när dessa nanopartiklar suspenderades i PBS pH 7.4, aggregerades alla formuleringar till större storlekar på mer än 1 kg med PDI-värden mer än 0.5. Deras partikelytaladdningar var också nästan neutrala, allt från + 0.2 till +2,5 mV.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 3

(a) partikelstorlek och (b) ytladdning av CS NPs framställd vid 0,05 och 0,01% w/v DS-lösning och lagrad vid 25 C. C. nanopartiklar suspenderades i destillerat vatten (pH i intervallet 6-7),.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 4

(a) partikelstorlek och (b) ytladdning av CS NPs framställd vid 0,05 och 0,10% w/v och lagrad vid 4 C. C. nanopartiklar suspenderades i destillerat vatten (pH i intervallet 6-7),.

3.4. BSA in Vitro-frisättning och integritet

Figur 5(A) illustrerar att frisättningen av BSA kan delas in i två steg baserat på frisättningshastigheten. I det första steget släpptes BSA snabbt från CS NPs och visade en burstfrisättning under de första 6 h. Detta resulterade i en 45% kumulativ frisättning av BSA i 5. I det andra steget frisattes BSA långsamt från 6 h upp till 48 h, vilket resulterade i en kumulativ BSA-frisättning på mer än 60%. Integriteten hos BSA som släpptes från CS NPS utvärderades av SDS-PAGE och visas i Figur 5(b). De observerade banden bekräftade att BSA som hade uthärdat lastnings-och frisättningsprocesserna vid 37 ccbg efter dag 1 och 2 inte skilde sig från den för nyberedda BSA-standarder. Därför kan man dra slutsatsen att BSA förblev i sin ursprungliga form i CS NPs under experimentella förhållanden.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 5

(a) släppprofilen för BSA laddade CS NPs vid DS : CS-förhållandet 1 : 1 vid pH 7.4, . (b) SDS-SIDANALYS av BSA släppt från CS NPs: (M) SDS-SIDASTANDARDER (BIO-RAD); (a) BSA-standard 1 mg/mL; (B) BSA-standard 0,2 mg/mL; (C) blank; (D) lossad CS NPs; (E) och (F) BSA släppt från CS NPs (DS : CS-förhållande 1 : 1) vid Dag 1 och 2.

3.5. Sirna in Vitro-frisättning

Figur 6 illustrerar att frisättningen av siRNA kan delas in i två steg baserat på frisättningshastigheten. I det första steget släpptes siRNA snabbt från CS NPs och visade en burstfrisättning under de första 6 h. Detta resulterade i en kumulativ frisättning av siRNA på 58% av 5. I det andra steget frisattes siRNA långsamt från 6 h upp till 48 h, vilket resulterade i en kumulativ BSA-frisättning på mer än 85%.

Figur 6

släppprofilen för siRNA laddade CS NPs vid DS: CS-förhållandet 1: 1 vid pH 7.4,.

4. Diskussioner

metoden som används för att producera CS NPs i föreliggande studie är en mild process, och det möjliggör kontroll av partikelstorleken genom att variera vissa parametrar, till exempel koncentration av tillsatta salter, viskositet, kvantitet nonsolvent och molekylvikt av polymer. Denna studie startades med undersökningen för att få information om elektriskt tillstånd av joniserbara grupper av CS NPs genom att bestämma stabiliseringstiden för e.d.l. Detta steg är viktigt för att få tillförlitliga och reproducerbara resultat. De erhållna uppgifterna antydde att bildandet av stabil e. d. l. under beredningen av nanopartiklar krävdes några ögonblick efter att omrörningen stoppats. Dessa ögonblick behövdes för att elektrolyterna skulle tränga in mot partikelkärnan. Således, väntetid på 40 min behövdes innan CS NPs kunde mätas exakt. Detta resultat liknade CS-tripolyphosphate (CS-TPP) NPs som föreslog samma väntetid .

en studie utfördes också för att bestämma påverkan av polymerkoncentration på partikelbildning. Studien syftade till att fastställa intervallet av polyelektrolytkoncentration för att producera nanopartiklar med önskad storlek. För att studera effekterna av de varierande koncentrationerna av CS och DS på bildandet av nanopartiklar bereddes CS och DS-lösning av 0,1, 0,25 och 0,5% w/v. Variabla volymer av DS-lösning (1, 2, 3, 4, 5, 5.8, och 10 mL) blandades med 5 mL av varje CS-koncentration (0,1–0,5% w/v). Den slutliga koncentrationen av CS och DS beräknades och storlekar av prover kategoriserades antingen som 100-500, 501-1000 eller mer än 1000 nm. Det visade sig att partikelstorleken påverkades av DS-koncentrationen. Detta resultat bekräftades med resultaten från CS-TPP NPs . I allmänhet begränsas den önskade storleken av nanopartiklar mellan 100 och 1000 nm. Tidigare studier har dock visat att de laddade nanopartiklarna normalt skulle producera en större storlek än de tomma. Storleken på under 500 nm är därför gynnsam.

vidare avslöjade resultaten att endast DS-koncentration av 0.05% w/v kunde producera nanopartiklar med partikelstorlek mindre än 500 nm som visas i Tabell 1. Det förväntades som när båda polymererna var i låga koncentrationer resulterade tillsatsen av DS till CS i små koacervatkärnor. I motsats till detta tenderade stora koacervater som översteg 1000 nm i storlek att bildas när båda polymerernas koncentration ökade till 0,25% eller högre. Chitosans förmåga att spontant bilda koacervat beror på interaktionen mellan motsatt laddade polyelektrolyter för att bilda ett polyelektrolytkomplex med reducerad löslighet. Blandningen av hög koncentration av DS med CS är därför mer sannolikt att påverka intrasslingen av CS-kedjorna och lösligheten hos det resulterande komplexet. Som ett resultat kommer en hög grad av komplexbildning och koacervat att produceras . Den minskade viskositeten vid en lägre koncentration av CS resulterade också i bättre löslighet. Detta möjliggjorde en mer effektiv växelverkan mellan den katjoniska CS och motsatt laddade joner, och sålunda producerades en mindre partikelstorlek . Dessutom resulterade en ökning och överskott i den molära massan av den använda polyanionen i större partiklar eftersom mycket neutraliserade komplex bildades och de tenderade att flockas . I denna studie var partikelytans laddning av nanopartikulatsystemet beroende av viktförhållandet mellan DS och CS. Partikel ytladdning befanns ökas när förhållandet minskade. Detta förhållande kan vara användbart i att erhålla den önskade partikelytan laddningstäthet för att underlätta vidhäftning och transportegenskaper hos nanopartiklarna.

i föreliggande studie uppnåddes införlivandet av BSA i CS NPs genom att helt enkelt blanda den sura CS-lösningen innehållande upplösta BSA-molekyler med DS-lösningen vid rumstemperatur utan tillsats av stabilisator. BSA används ofta som ett modellprotein eftersom det omfattar den allmänna egenskapen hos andra proteiner och det är biokompatibelt för människor. Det visade sig att CS NPs var relativt större i storlek efter lastning med BSA. Partikelstorleken förväntades öka när BSA framgångsrikt laddades in i nanopartiklar. Denna trend kan möjligen bero på molekylvikten och storleken på de tillsatta BSA-molekylerna. Dessa stora partikelstorlekar kan begränsa deras användning vid leverans av protein. Nanopartiklar på 150-300 nm finns främst i levern och mjälten . Dessutom, enligt vissa rapporter, är det” ideala ” storlekskravet för nanopartiklar som utvecklats för cancerbehandling mellan 70 och 200 nm . Även om nanopartiklar inte bör vara större än 150 nm för att korsa endotelbarriären, rapporterar litteraturen alltid penetrationen av partiklar som är större än gränserna för fenestrationer. Faktum är att fenestration och kärl kan genomgå modifiering under olika patologiska förhållanden .

till exempel kommer tumörtillväxt att inducera utvecklingen av neovaskulatur som kännetecknas av diskontinuerligt endotel med stora fenestrationer på 200-780 nm . Dessutom observerades att partikelytans laddning av BSA-laddad nanopartikel var högre än de tomma. Detta kan bero på den katjoniska egenskapen som BSA har när den är närvarande i surt tillstånd. De positiva laddningarna från CS-och BSA-molekyler har därför bidragit till ett högre värde av partikelytans laddning för de laddade nanopartiklarna.

positivt laddade katjoniska polymerer kan effektivt binda till och skydda nukleinsyror såsom DNA , oligonukleotider och siRNA . I denna studie uppnåddes införlivandet av siRNA i CS NPs genom att helt enkelt blanda den sura CS-lösningen med DS-lösningen innehållande siRNA vid rumstemperatur. Det visade sig att partikelstorleken hos CS NPs var relativt mindre i storlek efter laddning med siRNA. Den mindre storleken på CS NPs laddad med siRNA kan bero på neutralisering av negativa laddningar av nukleinsyra av katjonisk polymer vilket resulterar i kondenserade mindre storlek nanopartiklar. SiRNA-laddade CS NPs visade också högre zeta-potential än tomma CS NPs, efter samma trend som BSA-laddade CS NPs.

helst bör ett framgångsrikt leveranssystem ha en hög grad av associerande läkemedel. SiRNA-laddade CS NPs visade högre infångningseffektivitet (< 90%) för alla DS: CS-viktförhållanden. Infångningseffektiviteten hos nanopartiklar vid DS: CS viktförhållande på 1: 1, 1,5 : 1 och 2 : 1 var högre än viktförhållandet 0,5: 1. Detta fenomen berodde troligen på högre andel DS som presenterades i nanopartiklarna. När mer DS läggs till skulle det underlätta mer BSA att fångas in i nanopartiklar. Detta kan förklaras av det faktum att BSA är en zwitterionisk molekyl. Vid pH-värdet för formuleringsmediet 3,5-4,0 kan lösligheten hos BSA ökas kraftigt på grund av ökade positiva laddningar som innehas av den . Således skulle BSA kunna elektrostatiskt fästa och stabilt ladda in i nanopartiklarna. I sur lösning kan BSA ha positiv laddning och konkurrera med CS för att interagera med DS elektrostatiskt. Detta resultat bekräftades med de ökade positiva ytladdningarna för BSA-laddade CS NPS jämfört med lossade. Dessutom finns det multi-Joniska platser på BSA, och denna funktion kan underlätta införlivandet av BSA i nanopartiklar. Detta resultat skiljer sig från upptäckten med CS-TPP NPs .

i studien var den elektrostatiska interaktionen närvarande mellan BSA och CS, istället för BSA och TPP. Det föreslogs också att BSA skulle lösas upp i en lösning med pH högre än dess isoelektriska punkt för att BSA skulle ha negativ laddning och interagera med de positivt laddade CS-molekylerna. Detta fynd visade därför att elektrostatisk interaktion är den viktigaste bidragande faktorn för att främja införlivandet av BSA i nanopartiklar antingen via CS-protein interaktion eller DS-protein interaktion.

TEM tillåter nanoskala visualisering av enskilda nanopartiklar och ger information av både storlek och morfologi. Partikelmorfologin är en viktig faktor för kolloidal och kemisk stabilitet såväl som bioaktiviteten hos nanopartiklar. siRNA-laddade CS NPS visade oregelbunden morfologi; emellertid visade BSA-laddade CS NPs långsträckt morfologi. Detta kan bero på större storlek av BSA som kan trassla in sig eller fungera som en sköld till CS, vilket begränsar den totala exponeringen av CS inom strukturen.

STABILITETSPROFIL för CS NPs vid lagring är också viktigt. Denna information kan ge en bild om stabiliteten hos nanopartiklar under olika medier och temperatur. Stabiliteten hos nanopartiklar undersöktes genom att bedöma deras variation i medelpartikelstorlek och ytladdning över tiden. I början var nanopartiklarna resuspended i destillerat vatten vid pH 6.6 som filtrerades av 0.2 occurm filter för att avlägsna möjliga föroreningar närvarande i vatten. För denna studie testades endast nanopartiklar gjorda av 0,05 och 0,10% w/v av DS. Andra DS-koncentrationer bestämdes inte på grund av ökad partikelstorlek efter centrifugering. Partikelstorleken var upp till nm och nm för 0,15% respektive 0,20% w/v DS. Ökningen av partikelstorlek kan bero på att CS NPs själva eroderar och förlorar sin sfäriska form i en vattenhaltig miljö, och följaktligen skulle partikelns genomsnittliga diameter stiga som svar på denna erosion . Vidare minskade partikelytans avgifter för nanopartiklarna från båda koncentrationerna över tiden. Man misstänkte att CS kan brytas ned i vattenhaltiga medier även om det saknas lysozymer. Resultaten visade att CS NPs var mer stabila när de lagrades vid 4 C, eftersom deras partikelstorlek och ytladdning var oförändrad eller något ändrad upp till 14 dagar. Resultaten föreslog också att CS NPs inte bör lagras vid omgivande temperatur eftersom de är benägna att försämras. Resultaten föreslog därför att CS NPs lagrade vid rumstemperatur är mer benägna att försämras än de som lagrades i sval miljö. Det berodde förmodligen på den svala miljön som kan sakta ner nanopartiklarnas kinetiska rörelse. Således kan nanopartiklarna bibehålla sin sfäriska form och erosion skulle vara mindre sannolikt att uppstå. Dessutom observerades att dessa nanopartiklar aggregerades i PBS vid pH 7.4. Detta kan tillskriva lägre partikel ytladdning av nanopartiklar i PBS, nära neutral. Partikel ytladdning som sjönk till noll kan indikera att CS NPs hade genomgått laddningsavbrott av fosfatgrupper av PBS. Den neutrala laddade statusen för dessa nanopartiklar kan orsaka förlust av intra – och intermolekylära krafter, viktigt för att upprätthålla nanopartiklarna individuellt. Som ett resultat kan dessa oladdade nanopartiklar börja aggregera och destabilisera det kolloidala systemet. Till skillnad från PBS kan destillerat vatten ge många vätejoner för att bilda vätebindningar som kan hjälpa till att bryta aggregering av nanopartiklar genom att interagera med joniserbara grupper av CS NPs.

in vitro-frisättningsstudien av BSA och siRNA från CS NPs utfördes i Tris-HCL-buffert. Frisläppandet av BSA och siRNA kan delas in i två steg baserat på frisättningshastigheten. I det första steget släpptes läkemedlet snabbt från CS NPs. Frisättningen av BSA och siRNA i detta skede kan innebära diffusion av BSA/siRNA bunden vid partikelytan. I det andra steget släpptes BSA/siRNA långsamt på grund av svullnad eller nedbrytning av polymeren. Den återstående BSA / siRNA i CS NPs skulle inte helt släppas förrän partiklarna var fullständigt eroderade eller lösta i frisättningsmedium. Detta kan ha bero på interaktionen mellan den återstående BSA/siRNA och den fria aminogruppen på CS-segmenten . Dessutom har det syntetiserade systemet som tidigare har beskrivits som att kunna formuleras under milda förhållanden säkerställt att stabiliteten hos proteinerna laddade i CS NPs var intakt enligt SDS-PAGE.

5. Slutsatser

Sammanfattningsvis visar denna studie att CS-och DS-koncentration samt pH var parametrarna som styr partikelstorlek och ytladdning av CS NPs. Nanopartiklar mindre än 500 nm kunde erhållas vid DS: CS viktförhållande på 0,5: 1 vid pH 4. I fallet med BSA-infångning har nanopartiklar med högre DS: CS-viktförhållanden haft högre infångningseffektivitet på mer än 88%. Den högsta procentuella uppnådda infångningseffektiviteten var vid 0,10% w / v DS (ds : CS-förhållandet 1: 1). CS NPs laddade med siRNA visade emellertid hög infångningseffektivitet (>90%) för alla DS : CS-förhållanden. Lagringstemperatur och suspenderande medium befanns vara de faktorer som kan påverka stabiliteten hos CS NPs. CS NPs var labila och tenderar att destabilisera vid omgivningstemperatur men håller tillbaka detta labila beteende när sval miljö (2-4 2CB C) tillhandahölls. Dessutom hade CS NPs bättre stabilitet i destillerat vatten än i PBS vilket kan bero på vätebindningar som bildades mellan vattenmolekyler och joniserbara grupper av CS NPs.

intressekonflikt

författarna förklarar att det inte finns någon personlig eller ekonomisk intressekonflikt i den aktuella forskningen.

bekräftelse

författarna erkänner tacksamt “Dana Lonjakan Penerbitan” från Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM-DLP-2011-001) för finansiering och stöd för det aktuella forskningsprojektet.