síndrome Cri-Du-Chat: A análise de perfil clínico e Microarray cromossómico em seis doentes

Abstrato

síndrome Cri-du-chat é uma doença cromossómica causada pela eliminação do braço curto do cromossoma 5. A gravidade da doença, os níveis de atraso intelectual e de desenvolvimento, e o prognóstico do paciente têm sido relacionados com o tamanho e posição da deleção. Com o objetivo de estabelecer correlações genótipo-fenótipo, aplicamos array-CGH para avaliar seis pacientes portadores de deleções citogeneticamente detectadas do braço curto do cromossomo 5 que foram seguidos em um serviço comunitário de genética. Os perfis citogenéticos e clínicos dos doentes foram reavaliados. Uma revisão de banco de dados foi realizada para prever genes adicionais e elementos regulatórios responsáveis pelos traços fenotípicos e comportamentais característicos desta desordem. A análise Array-CGH permitiu delinear as deleções terminais, que variaram em tamanho de aproximadamente 11,2 Mb a 28.6 Mb, com pontos de paragem de 5p15. 2 a 5p13. Um dup(8)(p23) (3, 5 Mb) adicional, considerado como uma variação benigna do número de cópias, também foi observado em um paciente. O valor do coeficiente de correlação calculado indicou a presença de uma relação fraca entre atraso de desenvolvimento e tamanho de exclusão. Antecedentes genéticos, história familiar, factores epigenéticos, polimorfismos quantitativos de Locus e factores ambientais podem também afectar o fenótipo do doente e devem ser tidos em conta nas correlações genótipo-fenótipo.

1. Introdução a síndrome Cri-du-chat (CDCS) (OMIM123450) foi identificada pela primeira vez em 1963, quando foi descrita uma série de três doentes com supressões do braço curto do cromossoma 5 . Os fenotipos relatados incluíam choro agudo, monótono, semelhante a um gato durante os primeiros anos de vida, fornecendo o nome da síndrome, além de dismorfismos Faciais típicos, deficiência intelectual e atraso no desenvolvimento. As supressões de 5p causativas desta síndrome têm uma incidência de 1 em 50 mil nascimentos vivos e podem ser terminais (78%), intersticiais (9%), ou causados por translocações desequilibradas (5%). Em aproximadamente 80 por cento dos casos, estas supressões São eventos de novo .

uma região crítica localizada entre 5p15. 2 e 5p15 .3 que é responsável pelo fenótipo de deleção 5p foi definida por Niebuhr. A eliminação de 5p15.2 foi relatada como sendo responsável pelo dismorfismo observado e incapacidade intelectual nestes pacientes, e a região proximal de 5p15.3 tem sido associado com o grito” gato ” e atraso de fala . Estudos moleculares confirmaram a importância destas regiões para os sinais patognomônicos e permitiram o refinamento dos genes específicos que afetam individualmente diferentes componentes do fenótipo clássico .

Wu et al. analisei genes candidatos para o grito de gato na região crítica cri-du-chat através de PCR quantitativa. Foram analisados os pontos de ruptura distal de duas supressões intersticiais em dois pacientes com CDCS clinicamente distintos; um paciente exibiu o grito de gato, e o outro não. Os resultados revelaram um gene candidato, FLJ25076 / UBC-E2, mapeando entre os pontos de paragem que abrangem 5p15.3-5p15.2. Este segmento tem 640 kb de comprimento, e codifica uma enzima do Tipo E2, conjugada com ubiquitina, expressa em tecidos torácicos e do couro cabeludo.

outros genes que foram mapeados para a região crítica CDCS incluem o gene SEMAFORINA F (SEMAF), abrangendo pelo menos 10% da região cromossômica deletada , e o gene delta-catenina (CTNND2), que codifica proteínas neuronais específicas potencialmente envolvidas no desenvolvimento cerebral. Estes genes estão associados à deficiência intelectual. O CTNND2 foi encontrado para regular a morfogênese da coluna e sinapse e para funcionar nos neurônios hipocampos durante o desenvolvimento, e pode contribuir para alterações funcionais nos circuitos neurais .

In the present investigation, we applied array-CGH to analyze a small but very heterogeneous group of six CDCS patients diagnosticed using conventional cytogenetic techniques. Este estudo levanta novas questões sobre as correlações fenótipo-genótipo desta síndrome. Apresenta-se uma revisão das funções dos genes/loci localizados na região 5p.

2. Materiais e métodos

2.1. Selecção de amostras

este foi um estudo longitudinal colaborativo realizado em 6 doentes com CDC. A maioria dos pacientes foi acompanhada nos últimos 20 anos em um serviço público comunitário de genética em colaboração com a Rede Brasileira de referência e informação para a síndrome de Microdeletion (RedeBRIM). Os pacientes 2, 3, 4 e 5 foram diagnosticados durante o primeiro ano de vida, o paciente 1 foi diagnosticado com a idade de 5 anos, e o paciente mais velho (o paciente 6) foi diagnosticado com a idade de 16 anos.

os doentes foram regularmente reavaliados ao longo de vários anos. As avaliações de desenvolvimento psicomotor foram baseadas em observações pessoais, desempenho escolar e informação dos pais. Habilidades e habilidades diárias, como linguagem, interações sociais, concentração/atenção, impulsividade, controle motor, percepção, aprendizagem e memória, foram registradas. De acordo com estes achados e uma adaptação da escala desenvolvida por Zhang et al. , o grau de Incapacidade intelectual em cada paciente foi determinado em uma escala numérica que varia de 0 (não afetado) a 7 (profundamente afetado). O coeficiente de correlação de Pearson () entre o tamanho da deleção e o grau de deficiência intelectual (ID) foi determinado para cada paciente.

2.2. Foi realizada uma análise citogenética

Kariotipagem em spreads de metafase preparados a partir de amostras de sangue periférico. A análise cromossômica foi realizada após a band GTG em uma resolução de 550 bandas. Pelo menos 150 células de cada paciente foram analisadas.

2.3. Hibridização por fluorescência In Situ (FISH)

para todos os doentes, a deleção foi confirmada utilizando uma sonda comercial de dupla cor para a região CDCS (Cytocell, Reino Unido). A sonda CTNND2 para 5p15. 2 (espectro vermelho) contém uma sequência homóloga para o d5s2883 locus e cobre ~159 kb deste locus. A sonda FLJ2507 para 5p15.3 (espectro verde) contém sequências homólogas para o D5S1637E e D5S2678 loci e cobre ambos os loci (~194 kb). A sonda NSD1 para 5q35 (Região de Sotos) foi usada como um controle (espectro verde). Pelo menos 30 células por hibridação foram analisadas.

2.4. Array-CGH

the deletions were mapped by whole-genome array-CGH using a 60-mer oligonucleotide-based microarray with a theoretical resolution of 40 kb (K, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA). A rotulagem e hibridação foram realizadas seguindo os protocolos fornecidos por Agilent, 2011. As matrizes foram analisadas usando um scanner de microarray (G2600D) e um software de extração de Recursos (versão 9.5.1) (ambos da Agilent Technologies). Análises de imagem foram realizadas usando Agilent Genomic Workbench Lite Edition 6.5.0.18 com o algoritmo estatístico ADM-2 em um limiar de sensibilidade de 6.0.

2.5. Consentimento

participação no estudo foi voluntária, e o estudo foi realizado de acordo com os padrões éticos da Declaração de Helsinque de 1964. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Universitário Edgar Santos, Bahia (Protocolo 104/012). O consentimento informado por escrito foi obtido dos pais dos pacientes.

3. Resultados e Discussão

Entre os pacientes, três (3, 5, e 6) eram do sexo masculino, com idades variando de 6 a 38 anos, e três (1, 2, e 4) eram do sexo feminino, com idades variando de 7 a 20 anos (Figura 1). Os principais resultados clínicos para os doentes são apresentados na Tabela 1. Os seus pesos à nascença foram 2 DP abaixo da média, com excepção dos doentes 2 (3.700 g) e 5 (3. 410 g). Hipertonia substituiu hipotonia nos doentes com mais de 15 anos, excluindo o doente 1. O paciente 6, que tinha 38 anos na época deste estudo, começou a ter cabelos grisalhos aos 20 anos de idade; além disso, a escoliose foi diagnosticada durante a adolescência. O paciente 3, que tinha 15 anos de idade, tinha cabelos grisalhos e um grau moderado de escoliose.

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Figura 1

características Faciais dos seis pacientes com 5p exclusão. (a)–(c)) doente 1, aos 20 anos de idade ; Paciente 2, com 7 anos de idade; e paciente 3, com 15 anos de idade . (d)–(f) doente 4, aos 15 anos ; doente 5, aos 6 anos ; e doente 8, aos 38 anos . em anos na época do filme.

os aspectos cognitivos, a linguagem, a mobilidade, a destreza e o grau de autonomia nas actividades diárias foram avaliados (Quadro 2). Quanto ao uso da linguagem expressiva, os pacientes 1, 4 e 5 podiam formular sentenças, mas o paciente 5 tinha um vocabulário limitado para a sua idade. Os outros pacientes só emitiram sons. Três dos pacientes (1, 4 e 5) caminharam com equilíbrio e destreza e mostraram algumas habilidades motoras finas. O paciente 3 exibiu uma característica caminhada desajeitada como resultado da hipertonia, e o paciente 2 (7 anos de idade) caminhou com suporte e sem equilíbrio e teve dificuldade de pé, preferindo arrastar-se. O paciente 6 tinha hipertonia grave e raramente caminhava. Apenas os doentes 1 e 4, cuja insuficiência intelectual era moderada, apresentaram controlo do esfíncter. No que diz respeito à autonomia, os pacientes 1, 2, 4 e 5 foram capazes de se alimentar.

Todos os pacientes tinham uma personalidade amigável, mas dificuldade em aceitar limites, e rajadas de nervosismo quando irritado foram relatados durante, pelo menos, alguns períodos de sua vida. Pacientes 1, 4 e 5 mostraram uma excelente capacidade de interagir com seus pares, com boa compreensão e a capacidade de se expressar, incluindo expressando-se através da fala. Eles também foram capazes de realizar atividades diárias, como vestir, pentear o cabelo, e comer. Eles não podiam ler ou escrever, embora a paciente 1 tivesse aprendido a escrever seu nome. Pacientes 2, 3 e 6 apresentaram os problemas comportamentais mais significativos, incluindo hiperatividade, movimentos repetitivos, irritabilidade, apego a objetos, auto-mutilação (colocar uma mão na garganta ou mordendo ou arranhando-se), e dificuldade em interagir com colegas. Seus níveis de deficiência intelectual (ID), refletindo seus fenótipos comportamentais, variaram de 3,5 a 7,0 (Tabela 2).

todos os doentes apresentavam uma deleção 5P detectável citogeneticamente. A análise dos peixes revelou que os indivíduos não possuíam translocação ou mosaicismo. Os perfis array-CGH revelaram supressões sobrepostas de 5p15. 33-p13 nos 6 doentes (Figura 2). Além disso, foi detectado um dup8p23, 3-p23, 2 de 3,5 Mb no doente 4.

Figura 2

Genes 5p15.33-13 com haploinsufficiency efeitos (com base nos On-line Mendelianas de Herança no Homem). As barras horizontais verdes mostram as extensões das supressões.

uma revisão dos genes e outros loci mapeados para a região deletada foi realizada usando bases de dados de genoma humano, como a herança mendeliana on-line no homem (OMIM®) e Encode®. Uma variedade de elementos de DNA, incluindo genes/loci, elementos que atuam nos níveis de proteína e RNA, e elementos regulatórios, estavam presentes nas regiões sobrepostas 5P-deletadas nos seis pacientes. A extensão das supressões variou de ~11,260 Mb no paciente 1 a 28,680 Mb no paciente 6 (Figura 2, Tabela 3). Foi observada perda do menor número de genes (73 genes/loci) no doente 1. Nos outros doentes, perderam-se os genes 86 (doente 2), 89 (doente 3), 90 (doente 4) e 98 (doentes 5 e 6).

os doentes com CCD são tradicionalmente diagnosticados com base em manifestações clínicas e análises convencionais de cromossomas e / ou peixes. A análise citogenética por banding GTG em combinação com uma avaliação clínica detalhada foi suficiente para diagnosticar os pacientes aqui apresentados. No entanto, muitos estudos demonstraram a importância da delimitação dos pontos críticos e a extensão da região deletada para a caracterização clínica e determinação das correlações prognósticas e genótipo-fenótipo . Técnicas moleculares refinadas, tais como array-CGH, são necessárias para uma análise mais precisa dos pontos de ruptura, confirmação de regiões críticas e a avaliação de novas alterações .

CDC é causada por rearranjos cromossômicos levando à eliminação de todo o braço curto do cromossomo 5 ou uma eliminação que abrange o segmento 5p15.3 (5-40 Mb) . Embora seja um distúrbio genômico bem definido, indivíduos com esta síndrome mostram variabilidade fenotípica e citogenética. A heterogeneidade genotípica observada nos doentes neste estudo foi investigada com sucesso através do uso da técnica array-CGH, que permitiu a identificação de pontos de paragem distintos. Além disso, o tamanho da deleção está associado com a apresentação clínica, com deleções menores levando a fenótipos mais leves, como observado no paciente 1, que exibiu dismorfismo facial leve e deficiência intelectual leve. Em particular, os indivíduos com uma exclusão de 5p15. 1 ou que exibem o mosaicismo são menos afetados .

Haploinsuficiency of contiguous candidate genes in the critical region is the most likely cause of the classic CDCS spectrum . Gu et al. estudou uma síndrome de deleção familiar de 5P resultante de um rearranjo cromossómico raro, materno e complexo e identificou três supressões intersticiais dentro de 5p15. 33-p13. 3 numa filha não afectada. A mais clinicamente relevante destas supressões intersticiais foi uma deleção de 5p15.31-p15.33 que abrangeu aproximadamente 2.89 Mb e abrigado 11 genes conhecidos, incluindo LOC340094, ADAMTS16, KIAA0947, FLJ33360, MED10, UBE2QL1, LOC255167, NSUN2, SRD5A1, PAPD7, e MIR4278. Apenas alguns destes genes foram totalmente caracterizados no que diz respeito às suas funções e associações de doenças. Tais microdeleções podem representar variantes não patogênicas benignas do número de cópias ou resultar em manifestações clínicas menores e despercebidas.

vários genes na região 5p, tais como SEMA5A, CTNND2 e TERT, são de particular interesse porque seus produtos desempenham papéis principais durante o desenvolvimento embrionário e neuronal . Estes três genes estavam faltando em nossos pacientes, e sua ausência pode não explicar o menor comprometimento cognitivo observado no paciente 1. Estes genes provavelmente representam apenas uma parte do fenótipo de deleção 5p, e a perda concomitante de outros genes nesta região certamente desempenha um papel importante nas características clínicas dos doentes. A presença de ambas as cópias do CTNND2 no paciente com a menor deleção cri-du-chat pode explicar o menor comprometimento cognitivo em comparação com os outros pacientes . Foram também notificadas pequenas supressões exónicas de CTNND2 em indivíduos com baixo QI normal e problemas de aprendizagem, com ou sem características autistas ou atraso no desenvolvimento .

o uso de array-CGH também nos permitiu detectar uma duplicação de 3,5 Mb do cromossoma 8 no paciente 4, além da eliminação terminal 5p. Vários estudos sugeriram que duplicações de 8p23.3 podem ser consideradas variantes eucarromáticas sem efeitos fenotípicos . Uma duplicação da região, foi detectado anteriormente usando PEIXES em um oligoasthenozoospermic o homem e o seu normal, mãe e irmão, e em sete outros indivíduos, foram apresentadas evidências de que a duplicação é uma variante normal e envolve o mesmo 2.5 Mb segmento que duplicado no paciente no estudo atual . Uma limitação do presente estudo foi a nossa incapacidade de distinguir entre desequilíbrios genómicos de novo e hereditários devido à indisponibilidade de células em suspensão ou ADN dos pais. Assim, não podemos excluir a possível presença de uma translocação desequilibrada envolvendo o cromossoma 8p23. 3.

no presente estudo, descrevemos uma série de seis doentes com CDC em diferentes fases de desenvolvimento. Este estudo longitudinal destes doentes indicou que algumas características da deleção de 5P mudam com a idade. As faces redondas tornam-se longas e estreitas com o avanço da idade. O típico grito de gato presente no nascimento em todos os pacientes foi associado com atraso de linguagem subseqüente e dificuldade na aquisição de linguagem. Com exceção do paciente 1, que fala inteligivelmente, deficiência de aprendizagem grave foi observada em todos os outros pacientes. Este fenótipo mais suave pode ter sido devido à menor exclusão da região crítica 5p neste paciente. Os pacientes 2, 3 e 5 foram inicialmente hipotônicos e mais tarde tornaram-se hipertônicos, com dificuldade em andar. Todos os pacientes mostraram incapacidade de prosperar e baixa estatura. Escoliose e defeitos músculo-esqueléticos foram patentes no paciente 6, que é o mais antigo da série e mostrou sinais de envelhecimento prematuro, cabelos grisalhos, e hábitos sociais pré-adquiridos. Este foi o paciente mais severamente afetado, e ele tinha recebido pouca intervenção precoce e tinha uma vida social limitada.

os doentes com supressões maiores com concentrações críticas nas regiões proximais de 5p14 e 5p13 tendem a ter uma disfunção cognitiva mais significativa. Aqueles que têm deleções menores com breakpoints em 5p15.3 apresentam problemas menos significativos, como mostrado no paciente 1, que exibiram dismorfismos faciais mais leves e um baixo grau de deficiência intelectual. Em particular, os indivíduos com uma supressão 5p15. 1 ou que exibem o mosaicismo são menos afetados . Zhang et al. realizaram um estudo de três famílias multigeneracionais que transportam deleções terminais 5p de diferentes tamanhos (variando de 4,79 a 13,52 Mb) transmitidas de forma autossómica dominante e observaram que esta deleção familiar é uma apresentação rara que exibe variabilidade fenotípica intra e interamiliar.

o gene que codifica a transcriptase reversa telomerase (hTERT) está localizado em 5p15.33, e a sua eliminação pode contribuir para as alterações fenotípicas observadas em crianças com CDC . Os adultos com esta síndrome apresentam uma face longa e estreita, um estrabismo divergente, um lábio inferior completo, malocclusão dentária, arcos supraorbitais proeminentes e cabelos prematuramente grisalhos . Hipotonia é substituída por hipertonia com idade avançada, o que pode ser relacionado com o desenvolvimento de escoliose . Outras características tornam-se mais aparentes com a idade, como a microcefalia. As posições e a aparência das orelhas também podem mudar com a idade .

estudos anteriores demonstraram que os doentes com deleção de 5p13. 3 apresentam perturbações músculo-esqueléticas mais graves . O paciente 1 (20 anos) não apresentou hipertonia, e este fenótipo mais suave foi associado com o pequeno tamanho de sua deleção. Embora todos os nossos pacientes tenham apresentado deficiência intelectual, eles exibiram grande variabilidade no desenvolvimento psicomotor e cognitivo. De acordo com Cerruti Mainardi et al. , todas as crianças com 5P monossomia podem aprender a andar, e alguns podem se alimentar a partir dos 4 anos de idade. As habilidades motoras brutas estão presentes em aproximadamente 92% dessas crianças, e habilidades motoras finas, como o uso de um lápis, estão presentes em aproximadamente 65% .

a compreensão da linguagem melhorou consideravelmente em todos os doentes ao longo das observações. Estes resultados indicam que a aprendizagem deve ser encorajada diariamente para estes doentes, incluindo a utilização da linguagem gestual como meio de comunicação. Cornish e Pigram (1996) verificaram que 25% dos pacientes com CDCS são capazes de usar a fala para comunicar e que 55% empregam métodos não verbais. Marignier et al. relataram uma menina com CDCS (supressão de 12,85 Mb) com apraxia de fala durante a infância e sem déficit intelectual. Estes autores concluíram que os sinais de deficiência intelectual podem ser sobrepostos devido às suas associações com deficiência linguística e gestual.Foram notificados comportamentos estereotipados

em doentes com deleção de 5p, que apresentaram diferentes graus destes comportamentos ao longo dos estudos. Esses comportamentos incluem movimentos repetitivos, hiperatividade, auto-mutilação, agressividade, teimosia, irritabilidade, alegria súbita excessiva, apego e movimentos repetitivos envolvendo objetos .

no presente estudo, alguns comportamentos maladaptivos levaram a uma associação com a perturbação do espectro autista, como observado no doente 3. Na verdade, este paciente está sendo tratado na Associação de pais e amigos de crianças excecionais (APAE) e tem mostrado progresso no que diz respeito à atenção e estabelecimento de laços afetivos. Uma análise recente do genoma identificou uma variante genética em 5p14. 1 (rs4307059) que está associada ao risco de desordem do espectro do autismo e com fenótipos do espectro da comunicação social na população em geral . Além disso, outro estudo da Associação genoma-wide revelou outras regiões polimórficas em 5p associadas com o desenvolvimento cognitivo, déficit de atenção, transtorno de hiperatividade e comportamento do tipo autismo .

a hiperactividade ocorre mais frequentemente em doentes mais jovens (aproximadamente 67% das crianças entre os 10 e os 15 anos) , e pode diminuir com a maturidade e a intervenção terapêutica . Da mesma forma, outros problemas comportamentais podem ser minimizados através de tratamento precoce e adequado.

Zhang et al. avaliaram as características clínicas de uma grande coorte de doentes com CDC com tamanhos de deleção variáveis e tipos de aberrações cromossómicas. Estes autores têm sugerido que a presença de deleções em três regiões de 5p (MRI a MRIII) têm efeitos diferentes na ocorrência de deficiência intelectual. Comparamos os achados para cinco pacientes desta investigação (pacientes 1 a 5) com dados semelhantes para pacientes previamente relatados . O doente 6 foi excluído desta análise devido à ausência de pontos de paragem semelhantes aos dos doentes notificados no estudo por Zhang et al. . Com base nos resultados para os doentes 4 e 5, que se encontram fora do espectro fenotípico descrito por Zhang et al. , é evidente que outras variáveis podem afectar os fenótipos destes doentes (Tabela 4).

embora a deleção de 5p seja uma síndrome clínica e geneticamente bem descrita, a variabilidade fenotípica observada entre os pacientes sugere que fatores modificadores adicionais, incluindo fatores genéticos e ambientais, podem afetar as manifestações clínicas dos pacientes . Além disso, embora as apresentações clínicas associadas com o causador de anomalias detectadas nos pacientes em nosso estudo foram cuidadosamente avaliadas, é possível que as próximas exames físicos detalhados poderia ter resultado na identificação de sutis alterações fenotípicas que não foram evidentes em pacientes atual estágio de desenvolvimento.

as razões para estes achados paradoxais permanecem pouco claras, mas novas abordagens envolvendo estudos de associação em todo o genoma e previsões baseadas em Bioinformática de genes e elementos regulatórios e até mesmo eventos epigenéticos podem permitir uma melhor elucidação das correlações genótipo-fenótipo em CDC.

4. Conclusões

os obstáculos associados à determinação das correlações genótipo-fenótipo na avaliação de traços complexos, tais como dismorfismos e desenvolvimento cognitivo e psicomotor, indicam que o contexto genético/epigenético e os fatores ambientais devem ser considerados para todas as variáveis. A haploinsuficiência dos genes CDCS pode resultar em alterações de desenvolvimento em tecidos específicos, e a investigação dos perfis de expressão dos genes candidatos nos tecidos fetais pode ser útil. Outras pesquisas sobre os perfis de expressão destes genes podem revelar aqueles que estão envolvidos no desenvolvimento do fenótipo cri-du-chat e melhorar as correlações genótipo-fenótipo.

pontos adicionais

recursos da Internet são os seguintes: Enciclopédia de elementos do DNA, http://genome.ucsc.edu/ENCODE/(20 de dezembro de 2015), e herança mendeliana Online no homem (OMIM), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/ (20 de dezembro de 2015).Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

reconhecimentos

os autores gostariam de agradecer Suely Damasceno pela colheita de sangue, Marise Barbosa por contactar os pacientes, e as famílias pela sua amável Colaboração em todas as fases deste estudo. Este trabalho foi apoiado pela Rede Brasileira de Referência e Informação em Microdeletion Síndromes (RedeBRIM) (CNPq, Brasil, Conceder 402012/2010-0 e Conceder 476783/2013-5) e a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS, Brasil, Conceder 13/2028-6). Mariluce Riegel é parcialmente financiada pela CNPq Grant no. 305454/2014-5.