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성공적인 문화의 세포:
*읽어 보시기 바랍 중요한 기술적 정보는 다음과 같이 취급하기 전에 ECACC-공급 세포 라인을*. 이 정보는 메인 메뉴의’고객 지원'(여기를 클릭하십시오)에서 확인할 수 있습니다.
냉동 세포 저장
수령시 냉동 앰플은 즉시 사용하지 않는 한 지체없이 기체 상 액체 질소로 직접 옮겨야합니다. 이 경우 생존력을 상실하게 됩니다.
영수증에 냉동 셀을 처리하는 방법
냉동된 에코캐시 공급 셀 라인의 선적을 받으면 최종 사용자가 지체 없이 선적을 주의하는 것이 중요합니다. 드라이 아이스에서 앰플을 제거하기 전에 셀 라인에 수반되는 기술적 조언을 상담해야합니다. 수령 즉시 올바른 취급은 최종 사용자의 실험실에서 세포주를 성공적으로 확립하는 데 중요합니다.
세포주가 주문될 때,최종 사용자는 또한 새로운 세포주를 위한 문화 조건을 고려하고 세포가 도착할 때 적합한 매체가 유효할 것이라는 점을 확인해야 합니다.
셀 카운팅의 중요성
세포 배양을 소생시키고 수확 할 때 생존 가능한 세포 수를 수행하십시오. 배양에서 세포를 확립하지 못하는 가장 일반적인 이유 중 하나는 소생술 당시 잘못된 생존 가능한 세포 파종 밀도를 사용하는 것,즉 파종 세포가 너무 낮거나 너무 높다는 것입니다. 이는 실행 가능한 셀 수를 수행하고 권장 시드 밀도를 따라 피할 수 있습니다.
당신이 사용하고 있는 특정한 세포주를 위해,우리의 웹사이트 페이지에’묘사’탭의 밑에 제공된 정보를 읽으십시오. 이 정보는 셀 라인 데이터 시트에서도 찾을 수 있으며,이 정보는 셀 라인 발송물과 함께 하드 카피로 제공됩니다. 시드 밀도는 하위 문화 루틴 정보에 표시됩니다. 시드 세포가 즉시 소생술을 게시 할 때 주어진 시드 밀도 범위의 중간에서 상단을 사용하십시오.
냉동 세포의 소생술
냉동 앰플을 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다.실험실 코트,완전 보호 얼굴 마스크 및 장갑을 착용하십시오. 드문 경우에 앰풀은 갇힌 잔류 액체 질소의 팽창으로 인해 온난화에 폭발 할 수 있습니다.
1. 미생물 안전 캐비닛에서 냉동 앰플 캡 주위에 70%알코올에 적신 티슈를 잡습니다. 덫을 놓을 수 있는 어떤 잔여 액체 질소든지 풀어 놓기 위하여 모자를 내무반 회전 도십시오. 캡을 다시 조입니다. 하나 또는 두 개의 작은 얼음 결정이 남을 때까지(1-2 분)앰풀을 37 도 물 목욕으로 신속하게 옮깁니다. 세포막에 어떤 손상든지 극소화하기 위하여 급속하게 해빙하는 것이 중요합니다.
참고:오염 위험이 증가 할 수 있으므로 앰풀을 완전히 담그지 마십시오.
2. 개봉 전 70%알코올에 적신 티슈로 앰플을 닦아냅니다.
3. 앰풀의 전체 내용물을 멸균 튜브(예:15 밀리람베르트 용량)에 피펫합니다. 다음글 천천히 추가 5 미리리터 미리 예열 매체 이미 보충 된 적절한 성분. 트리 판 블루 얼룩,혈구계 및 역 현미경을 사용하여 생존 가능한 세포 밀도를 결정하여 세포 또는 이와 동등한 세포 계산 방법을 계산합니다. 세포주 데이터 입력에 권장되는 세포 시드 밀도를 달성하기 위해 세포 현탁액의 적절한 부피를 전송한다.
부착 가능한 셀 라인의 경우:매체의 부피를 조정하고 필요한 경우 플라스크 크기를 조정하여 셀 라인 데이터 시트에 권장되는 셀 시드 밀도를 달성하십시오. 냉동 보호제를 제거하기 위한 사전-원심분리 단계는 제 1 매체 변경이 잔류 냉동 보호제를 제거하므로 통상적으로 필요하지 않다. 이 경우,이 데이터 시트에 지정됩니다. 세포가 하위 배양되지 않고(예를 들어,세포 기반 분석을 위해)즉시 사용되어야하는 경우,냉동 보호제를 제거하기 위해 사전 원심 분리 단계를 수행하는 것이 바람직 할 수 있습니다.
현탁액 세포주*의 경우:냉동 보호제를 제거하기위한 사전 원심 분리 단계가 권장됩니다. 5 분 동안 150 엑스 그램에서 원심 분리에 의해 세포를 펠릿하고 올바른 시드 밀도를 달성하기 위해 적절한 부피를 사용하여 신선한 매질에 세포 펠렛을 다시 주입한다.
1. 데이터 시트에 권장되는 온도와 이산화탄소 수준에서 플라스크를 배양하십시오. 이산화탄소에 의하여 먹인 부화기가 이용되면 플라스크에는 기체 교환을 허용하는 배출한 모자가 있어야 합니다.
냉동 된 하이브리도마 배양
냉동에서 하이브리도마 배양을 회수할 때,초기에 성장이 예상보다 느려지는 것은 드문 일이 아니며 생존력이 감소하는 것이 관찰될 수 있다. 적극적으로 증식하는 문화를 수립하는 데 최대 2 주가 걸릴 수 있습니다.
소생술에서는 냉동 보호제를 제거하기 위한 원심분리 단계가 필수적입니다. 냉동 앰플을 물 욕조에서 37 분 동안 급속하게 해동하십시오. 전송 내용 원심 분리기 튜브 천천히 추가 5-10 미리리터 사전 따뜻하게 성장 미디어+. 계산을 위해 샘플을 제거하십시오. 2-3 분 동안 100 엑스 그램에서 원심 분리하여 5-7 엑스 105 셀/밀리리터의 비교적 높은 밀도로 세포를 펠렛 화하고 씨를 뿌린다. 배양 플라스크를 평평하게 놓고 생존 가능한 증식 세포가 보일 때까지 정기적으로 관찰하십시오.
+종종 잡종 배양은 소생술을 즉시 게시하는 문화 설립의 초기 중요한 단계에서 20%의 매체로 보충 된 매체로 다시 삽입되는 이점을 얻을 수 있습니다.
세포 동결 절차
예방조치로서 귀하의 세포주(들)를 수령한 직후(2-4 엑스 106 세포/밀리리터 사이)동결시킬 것을 권장합니다.
다음 가이드는 세포주의 준비 및 냉동 보존을 위해 제공됩니다.
1. 일상적인 하위 문화에 사용되는 것과 동일한 방식으로 성장 로그 단계에서 세포를 수확. 접착 성 세포주의 경우 가능한 한 80-90%의 합류에 가깝게 수확하십시오.
2. 표준 절차는 데이터 시트에 달리 명시되지 않는 한 모든 세포주에 대해 90%혈청+10%냉동 보호제를 사용하는 것입니다. 각 앰플에 대해 1 밀리리터를 허용하십시오. 대부분의 세포주는 20%혈청 및 10%냉동 보호제가 보충 된 적절한 배양 배지에서 동결 될 수 있습니다. 이것은 일반적으로 디엠소소이지만 특정 경우에 글리세롤을 권장합니다. 만약 디엠소소가 적합하지 않다면,셀주 데이터시트에 다른 방법이 지정될 것이다.
3. 원심분리에 의한 펠릿 세포(예:5 분 동안 150 엑스 그램). 세포 펠렛을 적절한 동결 배지에 다시 주입하여 각 앰플에 2~4 엑스 106 셀/밀리람베르트 및 피펫 1 밀리람베르트 사이의 최종 세포 농도를 부여한다.
4. 프로그래밍 가능한 속도 제어 냉동기 또는 적절한 대안을 사용하여 1~3 초/분 사이의 냉각 속도로 셀을 동결하십시오. 온도가 적어도 130 도에 도달하면 앰플을 가스 상 액체 질소 저장 용기로 옮깁니다.
