COLO 205
skuteczna Hodowla komórek:
*przed użyciem linii komórkowych dostarczanych przez ECACC * należy zapoznać się z poniższymi ważnymi informacjami technicznymi. Informacje te są również dostępne w formacie PDF z naszego głównego menu, w sekcji “Obsługa klienta” (Kliknij tutaj).
Przechowywanie zamrożonych komórek
po otrzymaniu zamrożone ampułki należy niezwłocznie przenieść bezpośrednio do ciekłego azotu w fazie lotnej, chyba że mają być natychmiast użyte. Nie należy stosować zamrażarki o temperaturze -80°C jako alternatywy; spowoduje to utratę żywotności.
jak obsługiwać zamrożone komórki na paragonie
po otrzymaniu przesyłki mrożonych linii komórkowych dostarczanych przez ECACC ważne jest, aby użytkownik końcowy niezwłocznie zwrócił uwagę na przesyłkę. Przed wyjęciem ampułek z suchego lodu należy zasięgnąć porady technicznej dołączonej do linii komórkowych. Prawidłowa obsługa natychmiast po otrzymaniu ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego ustanowienia linii komórkowej w laboratorium użytkownika końcowego.
w momencie zamawiania linii komórkowej użytkownicy końcowi powinni również wziąć pod uwagę warunki hodowli dla nowej linii komórkowej i upewnić się, że odpowiednie medium będzie dostępne po przybyciu komórek.
Znaczenie liczenia komórek
wykonaj żywotną liczbę komórek podczas reanimacji i pobierania kultur komórkowych. Jedną z najczęstszych przyczyn braku ustalenia komórek w hodowli jest użycie nieprawidłowej żywotnej gęstości wysiewu komórek w czasie resuscytacji, tj. zbyt niskiej lub zbyt wysokiej gęstości wysiewu komórek. Można tego uniknąć, wykonując żywotną liczbę komórek i stosując się do zalecanej gęstości siewu.
dla konkretnej linii komórkowej, z którą pracujesz, przeczytaj informacje podane w zakładce “opis”na naszej stronie internetowej. Informacje te można również znaleźć w arkuszu danych linii komórkowej, który zostanie dostarczony jako wydruk z przesyłką linii komórkowej. Gęstość wysiewu jest pokazana w subkulturze rutynowych informacji. Podczas wysiewu komórek natychmiast po resuscytacji należy użyć środkowego do górnego końca podanego zakresu gęstości wysiewu.
resuscytacja zamrożonych komórek
ważne jest, aby ostrożnie obchodzić się z zamrożonymi ampułkami; nosić płaszcz laboratoryjny, pełną ochronną maskę na twarz i rękawice. W rzadkich przypadkach ampułki mogą eksplodować po rozgrzaniu z powodu ekspansji uwięzionego resztkowego ciekłego azotu.
1. W mikrobiologicznej szafce zabezpieczającej trzymać wokół nasadki zamrożonej ampułki chusteczkę nasączoną 70% alkoholem. Przekręć nasadkę o ćwierć obrotu, aby uwolnić resztki ciekłego azotu, które mogą zostać uwięzione. Dokręcić nasadkę. Szybko przenieść ampułkę do łaźni wodnej o temperaturze 37oC, aż pozostanie tylko jeden lub dwa małe kryształki lodu (1-2 minuty). Ważne jest szybkie rozmrażanie, aby zminimalizować uszkodzenia błon komórkowych.
uwaga: nie zanurzać ampułki całkowicie, ponieważ może to zwiększyć ryzyko zanieczyszczenia.
2. Przed otwarciem ampułkę przetrzeć chusteczką nasączoną 70% alkoholem.
3. Całą zawartość ampułki należy pipetować do sterylnej tubki (np. o pojemności 15 ml). Następnie powoli dodawaj 5 ml wstępnie rozgrzanego medium, które zostało już uzupełnione odpowiednimi składnikami. Określić żywotną gęstość komórek za pomocą trypan blue stain, hemocytometru i odwróconego mikroskopu do zliczania komórek lub równoważnej metody zliczania komórek. Przenieść odpowiednią objętość zawiesiny komórek, aby osiągnąć gęstość wysiewu komórek zalecaną przy wprowadzaniu danych linii komórkowej.
dla przylegających linii komórkowych: Dostosuj objętość medium i, jeśli to konieczne, Rozmiar kolby, aby osiągnąć gęstość wysiewu komórek zalecaną na arkuszu danych linii komórkowej. Etap wstępnego odwirowania w celu usunięcia krioprotektantu zwykle nie jest konieczny, ponieważ pierwsza zmiana nośnika usunie pozostałości krioprotektantu. Jeśli tak,to zostanie to określone w arkuszu danych. Jeżeli komórki mają być wykorzystane natychmiast (np. do testu opartego na komórkach), a nie subkulturacji, może być wskazane przeprowadzenie etapu wstępnego odwirowania w celu usunięcia krioprotektantu.
w przypadku linii komórkowych zawiesiny*: zaleca się etap wstępnego odwirowania w celu usunięcia krioprotektantu, tj. granulować komórki przez odwirowanie w dawce 150 x G przez 5 minut i ponownie odstawiać granulki komórek w świeżej pożywce, stosując odpowiednią objętość, aby uzyskać właściwą gęstość siewu.
1. Inkubować kolby w temperaturze i poziomie CO2 zalecanym na karcie danych. Jeżeli stosuje się inkubator zasilany CO2, kolba powinna mieć odpowietrzoną nasadkę umożliwiającą wymianę gazową.
hodowle Hybrydomy z zamrożonych
podczas odzyskiwania hodowli hybridoma z zamrożonych nie jest niczym niezwykłym, że wzrost początkowo jest wolniejszy niż oczekiwano i może wystąpić obserwowany spadek żywotności. Ustanowienie kultury aktywnie rozmnażającej się może potrwać do 2 tygodni.
podczas resuscytacji niezbędny jest etap wirowania w celu usunięcia krioprotektantu. Szybko rozmrozić zamrożoną ampułkę w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 1-2 minuty. Przenieść zawartość do probówki wirówki i powoli dodać 5-10 ml wstępnie rozgrzanych mediów wzrostu+. Usuń próbkę do liczenia. Odwirować w dawce 100 X G przez 2-3 minuty do granulowania komórek i nasion o stosunkowo dużej gęstości 5-7 x 105 komórek / ml. Umieścić kolbę hodowlaną na płasko i obserwować regularnie, aż widoczne będą żywe komórki proliferujące.
+często hodowle hybridoma mogą korzystać z resuspended z mediów uzupełnionych 20% FBS we wczesnym krytycznym etapie tworzenia kultury natychmiast po resuscytacji.
procedura zamrażania komórek
ECACC zaleca zamrożenie zapasów linii komórkowej wkrótce po otrzymaniu (między 2-4 x 106 komórek / ml) jako środek ostrożności.
poniższy przewodnik jest oferowany do przygotowania i kriokonserwacji linii komórkowych.
1. Zbieraj komórki w fazie loga wzrostu w taki sam sposób, jak w przypadku rutynowej subkultury. W przypadku przylegających linii komórkowych zbieraj możliwie blisko 80-90% zbiegu.
2. Standardową procedurą jest stosowanie 90% surowicy + 10% krioprotektantu dla wszystkich linii komórkowych, o ile nie określono inaczej w Karcie Danych. Odstawić 1 ml na każdą ampułkę. Większość linii komórkowych można zamrozić w odpowiednim pożywce hodowlanej uzupełnionej 20% surowicą i 10% krioprotektantem. Zwykle jest to DMSO, ale w niektórych przypadkach zaleca się glicerol. Jeśli DMSO nie jest odpowiednie, alternatywa zostanie określona w arkuszu danych linii komórki.
3. Komórki granulatu przez odwirowanie np. 150 x G przez 5 minut. Wymieszać granulki komórek w odpowiednim zamrażalniku, aby uzyskać końcowe stężenie komórek między 2-4 x 106 komórek / ml i pipetować 1 ml do każdej ampułki.
4. Zamrozić ogniwa z szybkością chłodzenia w zakresie 1-3oC/min przy użyciu programowalnej zamrażarki sterowanej szybkością lub odpowiedniej alternatywy1. Gdy temperatura osiągnie co najmniej -130oc, przenieść ampułkę do zbiornika magazynującego ciekły azot w fazie gazowej.
