Ovládací genů pro conjugative přenos plazmidů nebo jiných mobilních elementů

5.2 Široké hostitelské spektrum plasmidy

5.2.1 Stafylokokových plazmidů

Některé Stafylokokových plazmidů jsou 40-60 kb ve velikosti a převod s nízkou frekvencí (104-106 transconjugants za dárce) na pevné povrchy . pGO1 (52 kb), který kóduje rezistenci na aminoglykosidy, trimethoprim a kvartérní amoniové sloučeniny slouží jako model pro studium genetických organizace převodu regionu, jako plazmidy . Konjugativní přenosová oblast byla lokalizována transpozonovou mutagenezí . Sekvence DNA a transkripční organizace přenosové oblasti (trs) identifikovaly 14 ORF v oblasti 14 kb, které jsou pravděpodobně funkčními geny (trsA-trsN). trsA–trsM se zapisují ve stejném směru na jeden pramen vzhledem k tomu, trsN je přepisována odchylně a jeho pořadatelem částečně překrývá trsA. Klon obsahující pouze trs nemůže být převeden samostatně a žádný kandidát oriT nebyl nalezen uvnitř nebo sousedící s trs. Pro konjugaci je nezbytný další orf, označený nes (nicking enzym staphylococcus), umístěný 13,5 kb 5′ až trs . Jeho predikovaná aminokyselinová sekvence vykazuje podobnost se známými relaxázami. 100 bp 5 ‘ až nes leží Orit sekvence identická s oriT konjugačních nebo mobilizovatelných plazmidů: RSF1010, pTF-FC2, R1162, pSC101 a pIP501. Nes může generovat jediný pramen nick na oriT. Umístění oriT a nes daleko od TRS clusteru je jedinečné ve studovaných plazmidech a může odrážet nedávné vložení cizí DNA.

TrsN potlačuje transkripci genů esenciálních pro conjugative přenos vazbou na regiony 5′ jejich překlad začátek stránky . Čistí TrsN váže DNA a postupně zpomaluje fragmenty obsahující promotory pro trsL, trsA a trsN. Přebytek TrsN snížil aktivitu β-galaktosidázy v transkripční fúzi trsL-lacZ a snížil frekvenci konjugace pGO1. Naopak frekvence transkripce a konjugace se zvýšila v přítomnosti nadměrného cílového trsL. β-Galaktosidázy také snížil v trsG, trsI, a trsK fúzí, které jsou přepisovány z promotoru předchozí trsD, přesto, že tam být žádná vazba TrsN na tento promotor fragment. To naznačuje komplexní transkripční vzorec, který se ještě plně nevyřešil. NES je nezávislý na regulaci trsN a produkuje hojné hladiny přepisů, zatímco většina transkriptů trs je nízká kvůli regulaci trsN.

zdá se, že TrsN spíše moduluje než vypíná a zapíná genovou expresi, takže produkty jsou vyráběny ve vhodném čase a úrovni. To naznačuje existenci různých složitých zpětnovazebních smyček a že trsN sám může být regulován. Není jasné, zda trsN reaguje na genové produkty trs nebo zda existují signály vně buňky, které spouštějí nebo modulují konjugační funkce.

byla nedávno hlášena kompletní nukleotidová sekvence přenosové oblasti z pSK41 . traH kóduje lipoprotein produkt, jehož poslední osm zbytky N-terminální signální sekvence sdílet sekvence aminokyselin podobnost s peptid asociovaný s feromony-indukované konjugace mechanismus Enterococcus faecalis, což svědčí o možné funkci tohoto peptidu jako feromon. TraH je uznávána jako feromon u Enterococcus faecalis přechovávání buněk na plazmidu pAD1 , tak to může také hrát roli v pSK41-directed DNA přenos.

5.2.2 streptokokové plazmidy

streptokokové široké spektrum hostitele konjugační plazmid pIP501 (30 .2 kb, což rezistence k makrolidovým, lincosamide a streptogramin stejně jako chloramfenikol) kóduje dvě regionů zapojených do konjugace odborné způsobilosti, které byly identifikovány transposon mutageneze . Region obsahuje funkční oriT stránky podobné k oriTs Gram-negativní bakterie a šest souvislé otevřené čtecí rámečky (orf1–6) bezprostředně navazujícím tohoto oriT stránky. orf1 ukázal podobnost Gram-negativní plasmidu relaxase proteiny (MobA gen RSF1010 a MobL gen pTF-FC2), ale orfs2–6 byly jedinečné. Navíc orfs3-6 byli schopni doplňovat mutace v trans, zatímco orf2 nemohl. Tak navzdory podobnosti v oriT a relaxase, jedinečnost orfs2–6 a jejich domnělé produkty naznačují, že mohou existovat zásadní rozdíly mezi systémy přenosu Gram-pozitivní a Gram-negativní bakterie.

6 konjugačních transpozonů

konjugační transpozony kombinují vlastnosti transpozonů, plazmidů a bakteriofágů . Mohou spotřební a začlenit se do DNA jako transpozony, i když jiným mechanismem od dobře-studoval Tn5 a Tn10: transponují se kovalentně uzavřenými kruhovými meziprodukty a neduplikují cílové místo při integraci do DNA. Konjugační přenos také probíhá prostřednictvím kovalentně uzavřeného přenosového meziproduktu, v tomto ohledu se podobají plazmidům . Jejich excize a integrace se však podobají excizi a integraci mírných bakteriofágů a některé kódované integrázy vykazují sekvenční podobnost s členy rodiny lambda integráz . Nacházejí se v grampozitivních i gramnegativních bakteriích. Hlavní typy jsou popsány níže.

6.1 Tn916

Tn916 (18 .5 kb) byl nalezen u E. faecalis (grampozitivní) i u gramnegativních druhů, jako je Neisseria a Kingella, a byl prokázán přenos mezi těmito druhy. Nese stejný gen Tcr, tetM, který kóduje typ proteinu rezistence na ochranu ribozomu, jako Tn5253 (60 kb), který se nachází u Streptococcus pneumoniae . Oblast nezbytná pro přenos tn916 byla zmapována a sekvenována . Nikdo z předpokládané produkty z této oblasti má významnou sekvenční podobnost k sex pilus proteiny conjugative plasmidy a protože počet genů je malý, tento převod může být systém jednodušší než F nebo RK2 a může postrádat sex pilus. Malé cis-působící fragment, který může mobilizovat nepřenosné plasmidu při neporušeném transposon je přítomen v trans, a proto by měla kódovat oriT, obsahoval čtyři sekvence připomínající buď RP4 nebo F oriTs. Jeden orf v oblasti přenosu vykazoval významnou podobnost s mobilizačním proteinem Mbee ColE1 . Tak jednovláknová DNA může být přenášena během konjugace.

přenos Tn916 je stimulován tetracyklinem 10-100krát . To by mohl být nepřímý výsledek stresové reakce vyvolané antibiotiky. Protože jsou však int a xis umístěny za tetM, stimulace transkripce tetracyklinem může vést ke zvýšenému čtení int a xis, což by mohlo vést ke zvýšené frekvenci transpozice. Možný regulační Gen, traA, se nachází mezi tetM a int / xis . To je navrhl, že tam je nízká úroveň konstitutivní transkripce z promotoru před traA a to TraA je transkripční aktivátor, který upreguluje své vlastní transkripce a xis-Tn transkripce, stejně jako konjugace geny. Tímto způsobem by transpozice a tedy nepřímý přenos mohly být pod dvojí kontrolou, jak bylo pozorováno u přenosových genů plazmidů Ti.

6.2 Conjugative transpozony Gram-negativní anaeroby

Gram-negativní anaeroby, zejména Bacteroides, skupina transpozony zcela nesouvisející s Tn916 byl nalezen . Jsou mnohem větší: 65 kb na více než 150 kb . Stejně jako Tn916 mají kruhový přenosový meziprodukt . Mohou spotřebovávat a mobilizovat nespojené integrované prvky (viz bod 6.4). Většina z nich nese typ ochrany ribozomu TCR genu tetQ a mají komplikovaný regulační systém, který snímá tetracyklin a řídí přenosové funkce. Jsou známy dvě rodiny: Tcr ERL a Tcr Emr 78539.

oblast Bacteroides transposon Tcr Emr DOT, která je nezbytná a dostatečná pro konjugální přenos, byla lokalizována do segmentu 18 kb . Oblast oriT je uprostřed transpozonu . Schopnost mobilizovat plazmid v cis naznačuje, že po zavedení nicku na oriT, jeden řetězec je transportován přes Páření pórů. OriT nemá sekvenční podobnost s ority konjugovaných plazmidů E. coli nebo konců T-DNA. Kromě toho jsou geny kódující přenosové proteiny lokalizovány nejméně 3 kb od oblasti oriT. Orf sousedící s oriT kóduje regulační protein RteC, který řídí expresi genů tra.

krátká expozice donoru Bacteroides nesoucího TCR Emr DOT nízkým hladinám tetracyklinu stimuluje vlastní přenos 10 000krát . Tato stimulace pravděpodobně není způsobena stresem způsobeným tetracyklinovou inhibicí syntézy proteinů, protože netoxický analogový chlortetracyklin stimuluje také přenos. Tetracyklin stimuluje 20-násobný přepis operon obsahující tetQ a regulační geny rteA a rteB (Obr. 6) . RteA má aminokyselinovou sekvenci podobnost se senzorovým proteinem dvousložkových regulačních systémů, ale její role v řízení přenosu není stanovena .

RteB má aminokyselinovou sekvenci podobnost s aktivačním proteinem dvousložkových systémů, a proto může fungovat s RteA. Je nezbytný pro přenos a aktivuje rteC, následný gen. Zdá se také jednat jako antirepressor proti efekt zatím neznámý repressor, které normálně brání přenosu genů z jsou vyjádřeny : přenos regionu Tcr Je TEČKA, klonovaných v nepřítomnosti obou rteABC a domnělého repressor, může přenášet constitutively. Rtec je nezbytný pro vlastní přenos, ale není nutný pro mobilizaci sourezidentních plazmidů. To naznačuje, že Rt funguje jako antirepressor ovládání výraz relaxosome geny, a/nebo geny nezbytné pro vyříznutí a circularisation z conjugative transposon .

zdá se nepravděpodobné, že by se tato komplexní tetracyklinová odpověď mohla vyvinout v době od prvního klinického použití tohoto antibiotika. Tetracyklin produkovaný v přírodě aktinomycety pravděpodobně nepřispívá k vývoji tohoto systému, protože oba organismy žijí v různých výklencích. Další možností je, že tetracyklin není přirozený induktor, ale připomíná rostlinné fenolické sloučeniny, což je skutečný induktor. Protože Bacteroidy konjugují pouze na pevných površích, snímání přítomnosti rostlin by mohlo signalizovat přítomnost vhodného povrchu pro páření .

6.3 První conjugative transposon v Enterobacteriaceae

CTnscr94 je velký (∼100 kb), conjugative transposon v Enterobacteriaceae, která integruje v RecA-nezávisle na dvou konkrétních přípojná místa do chromozomu E. coli. Jedno z vazebných míst bylo identifikováno v rámci PHEV, strukturálního genu pro tRNAphe. Transposon kóduje cestu fermentace sacharózy závislou na PTS. Zdá se, že je to první konjugativní transpozon identifikovaný u enterických bakterií. Dříve existovala pouze jedna zpráva o domnělém konjugativním transpozonu, R391, nalezený v Proteus rettgeri, ale nebyl dobře zdokumentován.

6.4 mobilizace nespojených, integrovaných segmentů DNA konjugativními transpozony Bacteroides: NBUs

NBUs, nereplikující Bacteroides jednotky (10-12 kb), jsou integrované prvky, které sdílejí vysokou homologii ve vnitřní oblasti obsahující mobilizační geny (mob) a oriT . Excize a cirkularizace NBUs jsou spouštěny RteB poskytovaným konjugativními transpozony . Exprese rteB je indukována nízkými hladinami tetracyklinu, takže přítomnost konjugativního transpozonu a expozice tetracyklinu jsou nezbytné pro excizi a mobilizaci NBUs. NBUs kódovat pouze jednu mobilizaci protein, který je schopen vazby na oriT, kradu, a zahájení přenosu jediného uvízlé kopírování prostřednictvím páření pórů poskytována conjugative transposon . Cílové místo NBU1 je umístěno na 3 ‘ konci genu tRNAleu . Integrázový Gen intN1 NBU1 je exprimován konstitutivně. NBU kruhové formy jsou mobilizovány také plazmidy IncP R751 a RK2 . Mohou být přeneseny z Bacteroidů na E. coli a nespecificky integrovány do genomu E .coli.

6.5 závěry o konjugačních transpozonech

konjugační transpozony přispívají k šíření genů rezistence vůči antibiotikům v klinicky důležitých bakteriích, jako jsou Bacteroides a grampozitivní koky. Přenos mnoha Konjugativních transpozonů Bacteroides je stimulován nízkými koncentracemi antibiotik. Antibiotika tedy nejen vybírají rezistentní kmeny, ale také stimulují přenos rezistentních genů. Použití antibiotik v subletální koncentraci tedy může mít větší účinek na rezidentní mikroflóru, než se dříve myslelo.

7 jiné systémy

řada dalších systémů je pozoruhodná z různých důvodů, i když o kontrolních mechanismech je k dispozici jen málo molekulárních podrobností. Palcové plazmidy jsou poměrně heterogenní a skládají se z nejméně čtyř podskupin: IncHI1, IncHI2, IncHI3 a IncHII. Genetika je nejlépe pochopit pro IncHI1 plasmidu R27, což je zajímavé, protože to má optimální teplota 26 až 30°C a může poskytnout informace relevantní pro plasmidy z půdního a vodního prostředí, které obecně mají mnohem nižší teplotní optima než střevní organismy .

přenos regionu IncI1 plasmidu R64 (122 kb plasmidu z. S. typhimurium) je největší charakterizovány k dnešnímu dni, zahrnující 54 kb. Tato oblast není jen souvislými přenosovými funkcemi, protože v segmentu byly také nalezeny stabilní dědičné geny . Kóduje dva typy pilus a pomocné funkce, jako je primase. Tlusté pili vyrobené jsou potřebné za všech podmínek, zatímco tenké pili jsou potřebné pouze v tekutých Páření, kde se pářící páry mohou rozpadat v důsledku pohybu dárce a příjemce. Na základě kompletní sekvence pil regionu, navrhuje se, aby tenké pili patří k typu IV rodiny, které jsou více obvykle spojené s uchycení patogenních bakterií na eukaryotické buňky . Existuje několik verzí genu pilV kódujícího pilin pro tenký pilus. Neobvyklý kontrolní mechanismus umožňuje sekvenční expresi různých genů pilV . Nazývá se shufflon, přeskupení DNA je podporováno řadou sedmi 19-bp opakování, na které působí místně specifická rekombináza rodiny integráz . Ta inverze na tyto stránky umožňují všechny možné kombinace čtyř různých segmentů, z nichž tři mají dvě alternativní C-termini odlišeny od každého konce (A/A’, B/B’, C/C’). Čtvrtý segment kóduje pouze jeden možný C-konec. Různé proteiny pilus umožňují invazi různých hostitelských druhů, takže tyto přeskupení řídí přenos do specifických hostitelů. R64 ukazuje pozitivní regulace přes dva domnělé polypeptidy, TraB a Komunikace, které jsou potřebné pro výraz číslo přenosu-související funkce, včetně genu pro tenké pilus a primase gen . Na oriT region se skládá z oriT a dva geny, nikA a nikB, které jsou přepisovány z promotoru v oriT regionu a jsou tedy autoregulated do relaxosome sestavené NikA a NikB .

stejně jako plasmidy IncP se zdá, že plasmidy IncN jsou vždy schopné přenosu. Požadované geny jsou kódovány v oblasti 12 kb, zahrnující 14 tra genů: tři pro sestavení relaxosomu a 11 Pro Mpf, druhý je podobný genům IncP trb, genům Ti virB a genům Bordetella ptl . Transfer znalostí bez nadměrné zatěžování hostitel je dosaženo tím, že dva repressor geny, korA a korB, které jsou součástí tra regionu, který je organizovaný jako divergentní operons z dvojice těsně u sebe promotéři mezi korB-kikA operon a traL-korA-traCDNEOFG operon. Tyto dva promotory jsou organizovány jako back to back odlišné promotory regulované jediným vazebným místem KorA/KorB. Třetí promotor stojící sám proti proudu traN je také regulován jediným vazebným místem KorA/KorB. Existuje tedy autogenní regulace genů pro pór konjugálního Páření. Žádná regulace není pozorována, pokud nejsou oba geny funkční, což poskytuje prostředek ke koordinaci obou operonů, ale není známo, zda se oba proteiny nebo jen jeden váží na DNA. Zdá se, že KorB sestává z přímé duplikace polypeptidu s podobností s rodinou HN-s regulačních proteinů podobných histonu . Nařízení týkající systém kódován IncW plasmidy není intenzivně studován, ale je známo, že TrwA, jeden ze tří relaxosome bílkovin, poskytuje autogenní řídicí obvod vazbou blízkosti oriT, který je také místo pro trwAp. TrwA zobrazuje sekvenční podobnost s Traje protein IncP plasmidy, ale má vazba na DNA motiv podobný tomu, který Zásobníku protein F.

řada malých mobilisable plasmidy také posílit princip autogenního ovládání geny pro relaxosome proteiny. Dav regionu široké hostitelské spektrum IncQ plasmidu RSF1010 je zahrnuta v 1,8-kb region a kóduje tři proteiny, které jsou potřebné pro plasmidu využít IncP přenos systému. Geny pro MobA a MobB se překrývají, zatímco MobC je kódován odlišně v opačném směru . Promotory těchto genů jsou pevně seskupeny v oblasti oriT, dva střílejí směrem k mobabu a jeden směrem k mobC. Vazba relaxosomových proteinů na oriT způsobuje autogenní regulaci. Mutanti v oblasti mobA N-terminal nebo v mobC způsobují derepresi. Na MobB protein také ovlivňuje podíl plasmidu, který existuje v relaxosome a délka času, který plasmidu zůstává v tomto stavu, a proto je determinant z převodu frekvence . Dav oblasti 12.4-kb plazmid pTF-FC2 z Thiobacillus ferrooxidans vykazuje pozoruhodné podobnosti s oriT oblasti IncP plasmidy, jak z hlediska organizace odlišné operons přepsal z organizací oriT regionu a také pořadí podobnosti relaxosome proteiny . Nedávné údaje potvrdily existenci autogenních obvodů řídících expresi genu mob a prokázaly význam hostitelského proteinu IHF při určování frekvence mobilizace . Na druhé straně oblast MBE ColE1, která je velmi podobná jiným plazmidům produkujícím kolicin, jako je ColK a ColA, nevykazuje žádné známky AUTOREGULACE . oriT mapuje proti proudu genů mbe, oddělený od něj genem rom, a tak existence takových obvodů by vytvořila složitou organizaci.

8 Závěry

myšlenka, že systémy přenosu se vyvinul díky spolupráci dva typy funkcí: DNA kradu/replikace systémy a buněčná fúze systémů je obecně podporován průzkum příklady, které byly studovány doposud. Tam, kde se přenosové geny nacházejí spíše v malých shlucích než v jednom bloku, mají seskupené geny obecně společnou funkci. Scénář náboru genů funkční kazetou lze předpokládat, i když původní funkcí genového bloku nebyla podpora konjugačního přenosu. Na IncI1 plasmidu zdá dobrým příkladem, protože tam jsou oddělené bloky pro oriT/relaxosome geny, stejně jako dva typy pilus – takové, které je potřebné k podpoře buněčné fúze a druhu, který poskytuje prostředky pro tahání bakterie spolu, když jsou plovoucí zdarma v planktonních pozastavení.

Jeden blok z genů, který byl jednoznačně získal, jak již sestavené jednotky je mpf funkce nalezené v IncP, Ti, IncN a IncW, ale vztahující se k ptl blok B. pertussis a caga genů, Helicobacter pylori. Tam byly některé genové přestavby, které mohou mít regulační nebo funkční význam, například juxtapozice virB11 homolog na začátku operace v IncP plasmidy a Ti plasmidu Tra systému. Regulace byla označena na přední straně této oblasti v Plasmidech IncP přidáním trbA a získáním promotoru regulovaného KorB. V případě systému IncN je jeden ze dvou regulačních genů, korA, vložen mezi první dva geny operonu a nenachází se v příbuzných operonech. Nábor nebo ztráta regulačních genů může být lépe pochopena, když byl sekvenován větší počet souvisejících systémů.

nejjednodušší systém regulace našel je, že autogenního nařízení, v němž geny v rámci bloků přenosové funkce vypnout expresi genů, jakmile je přenos přístroje je syntetizován. Plazmidy s takovými systémy se zdají být neustále připraveny k přenosu a dosud studované systémy mají tendenci být ve svém hostitelském rozsahu poměrně široké. Snad neustálá dostupnost nových hostitelů poskytuje plazmidu důvod být neustále připraven k přenosu. Shromáždění takových autogenní obvodů je jasně logické v případě genů pro relaxosome bílkoviny přepsanou z organizací oriT regionu, když se tyto proteiny shromáždí tvořit relaxosome. Je méně jasné, jak může autogenní obvod ovládající mpf geny potřebné pro sestavení pilusu vycítit, když je přítomen odpovídající počet funkčních pili.

další úroveň regulace je ta, která se projevuje plazmidy podobnými F, ve kterých jsou geny normálně vypnuty. Šance na zapnutí genů je malá, takže je nutná buď dlouhá doba, nebo velká populace, aby se zajistil výskyt bakterií schopných přenosu. Pokud se taková bakterie setká s příjemcem, dojde k přenosu a příjemce zůstává po určitou dobu zdatný v přenosu. To umožňuje exponenciální šíření v nové populaci plasmid-negativních bakterií. Takový systém regulace může být vhodný pro bakterie žijící ve střevě savců, kde se bakterie jen příležitostně setkávají s velkými novými populacemi potenciálních příjemců. Prostředí střeva může být příliš bohaté na množství druhů bakterií, aby umožnilo signalizaci cestou podobnou té, která se nachází v Agrobacterium. Přetrvávání převod zdatní stavu procesu převodu samotné se jeví jako dobrý způsob, jak kontrolovat přenos genové exprese v reakci na přítomnost vhodných příjemců. Alternativní strategii pro dosažení stejného cíle představují plazmidy reagující na feromon, ve kterých potenciální příjemci produkují feromon, který stimuluje produkci agregační látky. Samotný plazmid ve skutečnosti vypíná vnitřní produkci feromonu, na který reaguje, takže zapíná přenosové geny, pouze pokud jsou přítomni vhodní příjemci.

ostatní zkoumané systémy vykazují úzkou integraci fenotypu a přenosové frekvence. Ti plazmidy reagují jak na potenciální příjemce, na hustotu populace dárců, tak na dostupnost živin. Přenos konjugativních transpozonů je specificky stimulován antibiotiky, kterým propůjčují rezistenci. Jakmile regulační systém se vyvinul, aby se vypořádat s, například, přítomnost znečišťující látky nebo antibiotika, geny, které spojují činnost těchto převod procesů do prostředí, kde geny jsou vybrány budou mít tendenci mít výhodu, protože se budou přes replikovat a šířit, když životní prostředí je doprava, ale bude minimalizován jejich vliv na své hostitele, když navození podmínek chybí.

podrobné znalosti, které se nyní hromadí, nám umožňují ocenit, jaké faktory pravděpodobně stimulují nebo omezují šíření plazmidu. Některé typy antibiotické terapie mohou podporovat šíření rezistence na další členy smíšené komunity a zanechat potenciální problém pro budoucnost, i když krátkodobým účinkem je snížení infekce. Vývoj obrazovek pro sloučeniny, které vedou k derepresi přenosových genů, by mohl vést ke způsobům, jak znevýhodnit transport plazmidu. V některých extrémních případech, například IncP plasmidy, přebytek přenos genové exprese ukázala být smrtící, takže tyto látky by mohly mít dramatický efekt na přežití plazmid-pozitivní bakterie. Aktuální problémy s plasmid nese rysy může vést k zvážení antibakteriální strategie, které by byly zlevněné lety. Doufáme, že materiál obsažený v tomto přehledu může pomoci vyvolat takové nové koncepty.

poděkování

M. Z. je podpořeno grantem projektu od Wellcome Trust (046356 / Z). Další práce na Plasmidech IncP v laboratoři autorů byly podporovány Britskou radou pro lékařský výzkum, Wellcome Trust a BBSRC. Uznáváme pomoc mnoha kolegů při poskytování informací a užitečných návrhů.