プラスミドおよびその他のモバイル要素の共役転写のための遺伝子の制御

5.2広いホスト範囲のプラスミド

5.2.1ブドウ球菌プラスミド

いくつかのブドウ球菌プラスミドは、サイズが40-60kbであり、低頻度での転写（104-106固体表面の提供者ごとのtransconjugants）。 アミノグリコシド、トリメトプリムおよび第四級アンモニウム化合物への耐性をコードするpgo1(52kb)は、このようなプラスミドの転送領域の遺伝的組織の研究のためのモデルとして機能します。 共役転写領域はトランスポゾン変異誘発によって局在化した。 転写領域（ｔｒｓ）のＤＮＡ配列および転写組織は、機能的遺伝子（ＴＲＳＡ−ＴＲＳＮ）である可能性が高い１ ４ｋｂ領域上の１ ４個のｏｒｆを同定した。 trsA-trsMは一方の鎖上で同じ方向に転写されるのに対し、trsNは分岐的に転写され、そのプロモーターは部分的にtrsAと重複する。 Trs単独を含むクローンは独立して転送することはできず、trs内またはtrsに連続した候補oriTは見つかりませんでした。 Trsに13.5kbの5’に位置するnes(nicking enzyme of staphylococcus)と呼ばれる追加のorfは、抱合に必須である。 その予測されたアミノ酸配列は、既知のリラナーゼとの類似性を示す。 結合性または可動性プラスミドのＯＲＩＴと同一のＯＲＩＴ配列：ＲＳＦ１ ０ １ ０、ＰＴＦ−ＦＣ２、Ｒ１ １ ６ ２、ＰＳＣ１ ０ １およびＰＩＰ５ ０ １がｎｅｓに対して１ ０ ０ｂｐ５’である。 NesはoriTで一本鎖ニックを生成することができます。 Trsクラスターから遠く離れたoriTとnesの位置は、研究されたプラスミドでユニークであり、外来DNAの最近の挿入を反映している可能性があります。

TrsNは、その翻訳開始部位に領域5’に結合することにより、共役転写に不可欠な遺伝子の転写を抑制する。 精製されたTrsNはDNAに結合し、trsL、trsAおよびtrsNのプロモーターを含む断片を徐々に遅延させる。 TrsNの過剰はtrsL-lacZ転写融合におけるβ-ガラクトシダーゼ活性を減少させ、pgo1の共役頻度を減少させた。 逆に、過剰な標的ｔｒｓｌの存在下では、転写および共役頻度が増加した。 β-ガラクトシダーゼ活性はまた、TrsNのこのプロモーター断片への結合がないにもかかわらず、trsDに先行するプロモーターから転写されるtrsG、trsI、およびtrsK融合で減少した。 これは、まだ完全に解決していない複雑な転写パターンを示唆している。 nesはtrsN調節とは無関係であり、豊富なレベルの転写産物を産生するが、trs転写産物のほとんどはtrsNによる調節のために低い。

TrsNは遺伝子発現をオフにしたりオンにしたりするのではなく、調節しているように見えるので、製品は適切な時間とレベルで作られています。 これは，種々の複雑なフィードバックループの存在とｔｒｓｎ自体が調節されることを示唆している。 TrsNがtrs遺伝子産物に応答するかどうか、または共役機能を誘発または調節する細胞の外部にシグナルがあるかどうかは明らかではない。trsNがtrs遺伝子産物に応答するかどうか、または共役機能を誘発または調節する細胞の外部にシグナル

psk41からの転写領域の完全な塩基配列が最近報告された。 ｔｒａｈはリポタンパク質産物をコードし，そのｎ末端シグナル配列の最後の８残基は，phｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓのフェロモン誘導共役機構に関連するペプチドとアミノ酸配列類似性を共有し，このペプチドがフェロモンとして機能する可能性を示唆した。 TraHはプラスミドpad1を保有するEnterococcus faecalis細胞によってフェロモンとして認識されているので、psk41指向のDNA転送にも役割を果たす可能性があります。

5.2.2連鎖球菌プラスミド

連鎖球菌広範なホスト範囲共役プラスミドpip501(30.マクロライド、リンコサミド、ストレプトグラミン、クロラムフェニコールに対する耐性を付与する2kb）は、トランスポゾン変異誘発によって同定された共役能力に関与する二つの領域をコードしている。 領域Ａは、グラム陰性細菌のＯＲＩＴに類似する機能的ＯＲＩＴ部位と、このＯＲＩＴ部位のすぐ下流の６つの連続した開いた読み取りフレーム（ｏｒｆ１−６）とを含む。 orf1はグラム陰性プラスミドリラクサーゼタンパク質（RSF1010のMobA遺伝子とpTF-FC2のMobL遺伝子）との類似性を示したが、orfs2-6はユニークであった。 さらに、orfs3–6はtransの突然変異を補完することができたが、orf2はできなかった。 したがって、oriTとリラックスアーゼの類似性にもかかわらず、orfs2–6とその推定製品の一意性は、グラム陽性とグラム陰性菌の転送システムの間に基本的な違いがある可能性があることを示唆している。

6つの共役トランスポゾン

共役トランスポゾンは、トランスポゾン、プラスミド、バクテリオファージの機能を兼ね備えています。 彼らはから消費し、トランスポゾンのようなDNAに統合することができますが、よく研究されたTn5とTn10のそれとは異なるメカニズムによって: それらは共有結合的に閉鎖された円形中間体を介して転置し、DNAへの統合上の標的部位を複製しない。 共役移動は、共有結合的に閉じた移動中間体を介しても起こり、その点でそれらはプラスミドに似ている。 しかし、それらの切除と統合は、温帯バクテリオファージの切除と統合に似ており、エンコードされたインテグラーゼのいくつかは、ラムダインテグラーゼファミリーのメンバーに配列類似性を示しています。 それらはグラム陽性およびグラム陰性の両方の細菌に見出される。 主な種類は以下の通りです。

6.1Tn916

Tn916(18.5kb）は、E.faecalis（グラム陽性）においてもNeisseriaおよびKingellaなどのグラム陰性種においても見出され、これらの種間の移動が実証されている。 これは、肺炎連鎖球菌で見つかったTn5253（60kb）として、リボソーム保護タイプの抵抗性タンパク質をコードする同じTcr遺伝子、tetMを運びます。 Tn916の転送に不可欠な領域がマッピングされ、配列決定されています。 この領域の予測された生成物のいずれも、共役プラスミドの性pilusタンパク質と有意な配列類似性を有しておらず、遺伝子の数が少ないので、この転送シ 無傷のトランスポゾンがtransに存在するときに移動不可能なプラスミドを動員することができ、したがってoriTをコードする必要があり、小さなシス作用断片は、RP4またはF oriTsのいずれかに似た四つの配列を含んでいた。 転送領域の一つのorfは、Cole1のMbeE動員タンパク質に有意な類似性を示した。 したがって、一本鎖ＤＮＡは、抱合の間に移送され得る。

tn916の転写はテトラサイクリン10-100倍によって刺激される。 これは、抗生物質誘発性ストレス応答の間接的な結果である可能性がある。 しかし、intとxisはtetMの下流に位置するため、テトラサイクリンによるtetM転写の刺激はintとxisの読み取りスルーの増加をもたらし、これは転位頻度の増加をも 可能な調節遺伝子、traAは、tetMとint/xisの間に位置しています。 Ｔｒａａの上流のプロモーターからの構成的転写の低レベルがあり，Ｔｒａａはそれ自身の転写およびｘｉｓ-Ｔ ｎ転写ならびに共役遺伝子をアップレギュレートする転写活性化因子であることが示唆された。 このようにして、転移およびしたがって間接的に転移は、Tiプラスミドの転移遺伝子について観察されるように、二重制御下にあり得る。

6.2グラム陰性嫌気性菌の共役トランスポゾン

グラム陰性嫌気性菌、特にバクテロイデスにおいて、Tn916とは完全に無関係なトランスポゾンのグループが発見された。 彼らははるかに大きいです：65kbから150kb以上です。 Tn916のように、彼らは円形の転送中間体を持っています。 それらはリンクされていない統合された要素を消費し、動員することができる（セクション6.4を参照）。 それらのほとんどはＴｃｒ遺伝子ｔｅｔｑのリボソーム保護型を持ち，テトラサイクリンを感知し伝達機能を制御する複雑な調節系を持っている。 Tcr ERLとTcr Emr78539の2つのファミリーが知られています。

夫婦の移動に必要かつ十分であるバクテロイデスのトランスポゾンTcr Emrドットの領域は、18kbのセグメントにローカライズされています。 OriT領域はトランスポゾンの中央にあります。 Cisでプラスミドを動員する能力は、ニックがoriTに導入された後、一本鎖が相手孔を通って輸送されることを示唆している。 ＯＲＩＴは、抱合大腸菌プラスミドまたはＴ−ＤＮＡの末端のＯＲＩＴと配列類似性を有さない。 さらに、転写タンパク質をコードする遺伝子は、ＯＲＩＴ領域から少なくとも３ｋｂ離れて局在化される。 ＯＲＩＴに隣接するｏｒｆは、ｔｒａ遺伝子の発現を制御する調節タンパク質Ｒｔｅｃをコードする。

Tcr Emrドットを低レベルのテトラサイクリンに運ぶバクテロイデスドナーの短い暴露は、10 000倍の自己移動を刺激する。 この刺激はおそらく無毒なアナログのchlortetracyclineが移動を同様に刺激するので蛋白質の統合のtetracyclineの阻止によって引き起こされる圧力が原因ではないです。 テトラサイクリンは、ｔｅｔｑおよび調節遺伝子ｒｔｅａおよびｒｔｅｂを含むオペロンの２ ０倍の転写を刺激する（図２）。 6) . Ｒｔｅａは二つの成分調節系のセンサタンパク質とアミノ酸配列類似性を有するが，転写制御におけるその役割は確立されていない。

Ｒｔｅｂは二つの成分系の活性化蛋白質とアミノ酸配列類似性を有し，Ｒｔｅａで機能する可能性がある。 それは移動のために必要であり、rteC、下流の遺伝子を活動化させます。 それはまた、通常、転写遺伝子が発現されていることを防止する、まだ未確認のリプレッサーの効果に対抗するためのアンチレプレッサーとして作用する RteCは自己移動のために不可欠であるが、共同常駐プラスミドの動員のために必要ではありません。 このことは，ｒｔｅｃがリラックスソーム遺伝子の発現を制御するためのアンチレプレッサーとして作用すること，および／または共役トランスポゾンの切除および循環化に不可欠な遺伝子を示唆している。

この複雑なテトラサイクリン反応は、この抗生物質の最初の臨床使用以来の時間に進化している可能性は低いようです。 放線菌によって自然界で産生されるテトラサイクリンは、二つの生物が異なるニッチに住んでいるので、このシステムの進化に貢献する可能性は もう一つの可能性はテトラサイクリンが自然な誘導物質ではないが、実質の誘導物質である植物のフェノールの混合物に類似していることです。 バクテロイデスは固体表面上でのみ共役するので、植物の存在を感知することは、交配に適した表面の存在を示す可能性がある。

6.3腸内細菌科における最初の共役トランスポゾン

Ctnscr94は、大腸菌の染色体への二つの特定の付着部位でRecA非依存的な方法で統合する腸内細菌科の共役トランスポゾンである（≥100kb）。 結合部位の一つは、tRNApheの構造遺伝子であるpheV内で同定されている。 トランスポゾンはＰＴＳ依存性スクロース発酵経路をコードしている。 これは腸内細菌で同定された最初の共役トランスポゾンであると思われる。 以前は、プロテウス・レッティゲリで見つかった推定共役トランスポゾンR391の報告は1つしかなかったが、十分に文書化されていない。

6.4バクテロイデス共役トランスポゾンによるリンクされていない統合されたDNAセグメントの動員: NBUs

NBUsは、非複製Bacteroidesユニット（10-12kb）であり、動員遺伝子（mob）およびoriTを含む内部領域において高い相同性を共有する統合された要素である。 Ｎｂｕｓの切除と循環化は共役トランスポゾンによって提供されるＲｔｅｂによってトリガされる。 RteBの発現は低レベルのテトラサイクリンによって誘導されるため、共役トランスポゾンの存在およびテトラサイクリンへの曝露は、NBUsの切除および動員のために必要である。 NBUsは、oriTに結合し、ニッキングし、共役トランスポゾンによって提供される嵌合孔を介して一本鎖コピーの転送を開始することができる単一の動員タ ＮＢＵ１標的部位は、ｔｒｎａｌｅｕ遺伝子の３’末端に位置する。 NBU1のインテグラーゼ遺伝子、intn1は、構成的に発現される。 また、R751とRK2も同様である。 それらはBacteroidesからe.coliに移され、e.coliゲノムに非特異的に統合されることができます。

6.共役トランスポゾンに関する5つの結論

共役トランスポゾンは、バクテロイデスやグラム陽性球菌のような臨床的に重要な細菌における抗生物質耐性遺伝子の普及に貢献している。 Bacteroides共役トランスポゾンの多くの転送は、抗生物質の低濃度によって刺激されます。 したがって、抗生物質は耐性株を選択するだけでなく、耐性遺伝子の移入を刺激する。 したがって、致死下濃度での抗生物質の使用は、以前に考えられていたよりも居住微生物叢に大きな影響を及ぼす可能性がある。

7その他のシステム

制御メカニズムに関する分子の詳細はほとんどありませんが、さまざまな理由で他のシステムが注目に値します。 インチプラスミドは、少なくとも四つのサブグループからなるかなり不均一である：Inchi1、Inchi2、Inchi3およびIncHII。 遺伝学は、Inchi1プラスミドR27について最もよく理解されており、これは26-30℃の最適温度を有し、一般に腸内生物よりもはるかに低い温度の最適温度を有

Inci1プラスミドR64(S.typhimuriumからの122kbプラスミド)の転写領域は、これまでに特徴付けられた最大のものであり、54kbをカバーしている。 安定した遺伝遺伝子もセグメント内に見出されているので、この領域は単に連続した伝達関数ではない。 それはprimaseのような補助機能と同様、二つのpilusのタイプを符号化します。 作り出される厚いpiliは薄いpiliが合う組が提供者および受け手の動きが離れて原因で落ち易い液体のmatingsでだけ必要とされる間、すべての条件の下で Pil領域の完全な配列に基づいて、薄いpiliはIV型ファミリーに属し、より通常は真核細胞への病原性細菌の付着に関連することが提案されている。 薄いpilusのためのpilinをコードするpilVの遺伝子の多数の版があります。 異常な制御機構は、異なるpilV遺伝子のシーケンシャル発現を可能にする。 Shufflonと呼ばれるDNA再配列は、インテグラーゼファミリーの部位特異的リコンビナーゼによって作用される一連の19bpリピートによって促進される。 これらの部位での反転は、４つの異なるセグメントの全ての可能な組合せを可能にし、そのうちの３つは、それぞれの端から符号化された２つの代替Ｃ−ターミニ（Ａ／Ａ’、Ｂ／Ｂ’、Ｃ／Ｃ’）を有する。 第四のセグメントは、一つの可能なC末端だけをエンコードします。 異なったpilus蛋白質はこれらの再配列が特定のホストへの移動を制御するように異なったホスト種の侵入を可能にする。 R64は、薄い毛束およびプリマーゼ遺伝子の遺伝子を含む多くの転写関連機能の発現に必要な二つの推定ポリペプチド、TraBおよびTraCを介して正の調節を示 ＯＲＩＴ領域は、ｏｒｉｔと、ｏｒｉｔ領域のプロモーターから転写され、したがって、ＮｉｋａおよびＮｉｋｂによって組み立てられたリラックスソームによって自己調節される２つの遺伝子、ＮＩＫＡおよびＮＩＫＢからなる。

IncPプラスミドと同様に、IncNプラスミドは常に転写に熟練しているように見えます。 必要な遺伝子は、14のtra遺伝子を含む12kb領域にコードされています: リラソームアセンブリは三つ、Mpfは11であり、後者はIncP trb遺伝子、Ti virB遺伝子およびBordetella ptl遺伝子に類似している。 ホストに負担をかけずに転送能力は、korB-kikAオペロンとtraL-korA-traCDNEOFGオペロンの間に密接に間隔をあけたプロモーターのペアから発散オペロンとして組織されているtra領域の一部である二つのリプレッサー遺伝子、korAとkorBによって達成される。 これらの２つのプロモーターは、単一のＫｏｒａ／Ｋｏｒｂ結合部位によって調節される背中合わせの発散プロモーターとして組織される。 Ｔｒａｎの上流に単独で存在する第３のプロモーターもまた、単一のＫｏｒａ／Ｋｏｒｂ結合部位によって調節される。 したがって、夫婦の交配孔のための遺伝子の自家調節がある。 両方の遺伝子が機能的でない限り、調節は観察されず、両方のオペロンを調整する手段を提供するが、両方のタンパク質または一方だけがDNAに結合 Ｋｏｒｂはヒストン様調節蛋白質のＨＮ-Ｓファミリーと類似したポリペプチドの直接重複からなるようである。 IncWプラスミドによってコードされる関連システムの調節は広く研究されていないが、TrwA、三つのリラソームタンパク質の一つは、trwApの位置でもあるoriTの近くに結合することによって自己制御回路を提供することが知られている。 TrwAはIncPプラスミドのTraJタンパク質と配列類似性を示すが、Fのトレイタンパク質と同様のDNA結合モチーフを有する

小さな可動性プラスミドの数はまた、リラ 広い宿主範囲のＩｎｃｑプラスミドＲＳＦ１ ０ １ ０のｍｏｂ領域は、１． MobAとMobBの遺伝子は重複しており、MobCは反対方向に分岐してコードされています。 これらの遺伝子のプロモーターは、orit領域に緊密にクラスタ化されており、二つはmobABに向かって発射され、一つはmobCに向かって発射される。 Relaxosome蛋白質のoriTへの結合はautogenous規則を引き起こします。 ＭＯＢＡ Ｎ末端領域またはＭＯＢＣ中の変異体は、脱抑制を引き起こす。 MobBタンパク質はまた、リラックスソームに存在するプラスミドの割合と、プラスミドがこの状態に留まる時間の長さに影響を与え、したがって移動頻度の決定因子である。 Thiobacillus ferrooxidansからの12.4kbプラスミドpTF-FC2のmob領域は、Orit領域のプロモーターから転写された発散オペロンの組織とrelaxosomeタンパク質の配列類似性の両方の点で、IncPプラスミドのoriT領域に顕著な類似性を示している。 最近のデータは、mob遺伝子発現を制御する自家回路の存在を確認し、動員頻度を決定する際にホストタンパク質IHFの重要性を示しています。 一方、ColKやColAなどの他のコリシン産生プラスミドと非常に類似しているCole1のmbe領域は、自己調節の証拠を示さない。 oriTはmbe遺伝子の上流をマップし、rom遺伝子によって分離されているため、そのような回路が存在すると複雑な組織が形成されます。

8結論

転写システムは、DNAニッキング/複製システムと細胞融合システムの二つのタイプの機能の協力によって進化したという考えは、一般的にこれまでに研究されている例の調査によって支持されている。 転写遺伝子が単一のブロックではなく小さなクラスターに見られる場合、クラスター化された遺伝子は一般に共通の機能を有する。 機能的カセットによる遺伝子動員のシナリオは、遺伝子ブロックの本来の機能が共役伝達を促進することではなくても想定することができる。 Inci1プラスミドは、oriT/relaxosome遺伝子のための別々のブロックだけでなく、pilusの二つのタイプがあるので、これの良い例と思われます–細胞融合を促進するために必

すでに組み立てられたユニットとして明らかに取得された遺伝子の一つのブロックは、IncP、Ti、IncNおよびIncWに見られるが、百日咳菌のptlブロックおよびHelicobacter pyloriのcag遺伝子クラスターに関連するmpf機能である。 例えば、ＩｎｃｐプラスミドおよびＴｉプラスミドＴｒａ系におけるオペロンの開始に対するｖｉｒｂ１ １相同体の並置など、調節的または機能的意義を有する可能性のあるいくつかの遺伝子再編成が行われている。 調節は、trbAの添加だけでなく、KorB調節プロモーターの取得を通じてIncPプラスミドでこの領域の前面にタグ付けされています。 IncNシステムの場合、二つの調節遺伝子の一つ、korAは、オペロンの最初の二つの遺伝子の間に埋め込まれており、関連するオペロンには見られない。 調節遺伝子の動員または喪失は、より多くの関連系が配列決定されている場合に、よりよく理解され得る。

最も単純な調節システムは、伝達関数のブロック内の遺伝子が、伝達装置が合成されると遺伝子の発現を停止する自己調節のシステムである。 このようなシステムを持つプラスミドは、常に転送の準備ができているように見え、これまでに研究されたシステムは、そのホスト範囲が非常に広 おそらく、新しい宿主の絶え間ない利用可能性は、プラスミドに永続的に移動の準備ができている理由を提供する。 このような自己回路のアセンブリは、これらのタンパク質がrelaxosomeを形成するために組み立てるときにoriT領域のプロモーターから転写されたrelaxosomeタンパク質の遺伝子の場合には明らかに論理的である。 適切な数の機能的な線毛が存在するときに、線毛アセンブリに必要なmpf遺伝子を制御する自家回路がどのように感知できるかはあまり明確ではない。

次のレベルの調節は、遺伝子が通常オフになっているF様プラスミドによって示されるものです。 遺伝子がオンになる可能性は小さいので、長期間または移植に熟練した細菌の出現を確実にするために大規模な集団が必要です。 そのような細菌が受信者に遭遇した場合、転送が発生し、受信者はしばらくの間、転送に熟練したままである。 これにより、プラスミド陰性細菌の新しい集団全体に指数関数的に広がることが可能になる。 このような調節システムは、哺乳動物の腸内に生息する細菌に適しており、細菌が潜在的なレシピエントの大きな新しい集団に遭遇することはあ 腸の環境はAgrobacteriumで見つけられるそれに類似した細道によって信号を送ることを可能にするには多数の細菌種と余りにも豊富かもしれません。 転写プロセス自体による転写熟練状態の永続化は、適切なレシピエントの存在に応答して転写遺伝子発現を制御する良い方法のように思われる。 同じ末端を達成するための代替戦略は、潜在的な受信者が凝集物質の産生を刺激するフェロモンを産生するフェロモン応答性プラスミドによっ プラスミド自体は、実際には適切な受信者が存在する場合にのみ、転送遺伝子をオンに切り替えるように、それが応答するフェロモンの内部産生を

調査された他のシステムは、表現型と伝達頻度の密接な統合を示しています。 Tiプラスミドは、潜在的な受信者に、ドナー集団密度と栄養の可用性の両方に応答します。 共役トランスポゾンの移動は、それらが抵抗性を付与する抗生物質によって特異的に刺激される。 例えば、汚染物質や抗生物質の存在に対処するための規制システムが進化すると、遺伝子が選択された環境にこれらの転写プロセスの活性をリンクする遺伝子は、環境が正しいときには複製して拡散するが、誘導条件がないときには宿主への影響を最小限に抑えるため、利点がある傾向がある。

現在蓄積されている詳細な知識により、プラスミドの拡散を刺激または制限する可能性のある要因を理解することができます。 特定の種類の抗生物質療法は、混合コミュニティの他のメンバーへの抵抗の広がりを促進し、短期的な効果が感染を減らすことであっても、将来の潜在的な問題を残す可能性があります。 転写遺伝子の抑制を低下させる化合物のためのスクリーンを開発することは、プラスミド運搬を不利にする方法につながる可能性がある。 いくつかの極端な場合、例えば、Ｉｎｃｐプラスミドでは、過剰移入遺伝子発現は致死的であることが示されているので、このような薬剤はプラスミド陽性細菌 プラスミド媒介形質の現在の問題は、数年前に割引されていた抗菌戦略の検討につながる可能性があります。 私たちは、このレビューでカバーされている材料がそのような新しい概念を誘発するのに役立つことを願っています。

謝辞

M.Z.は、ウェルカム-トラスト(046356/Z)からのプロジェクト助成金によって支援されています。 著者らの研究室におけるIncPプラスミドに関する他の研究は、英国医学研究評議会、ウェルカムトラストおよびBBSRCによって支持されている。 私達は情報および有用な提案の供給のための多くの同僚の助けを認めます。