Control de genes para transferencia conjugativa de plásmidos y otros elementos móviles

5.2 Plásmidos de amplio rango de hospedadores

5.2.1 plásmidos estafilocócicos

Algunos plásmidos estafilocócicos tienen un tamaño de 40-60 kb y transferencia con baja frecuencia (104-106 transconjugantes por donante) en superficies sólidas . pGO1 (52 kb), que codifica la resistencia a aminoglucósidos, trimetoprima y compuestos de amonio cuaternario, sirve como modelo para el estudio de la organización genética de la región de transferencia de dichos plásmidos . La conjugación de transferencia región fue localizado por mutagénesis de transposones . La secuencia de ADN y la organización transcripcional de la región de transferencia (trs) identificaron 14 orf en una región de 14 kb que probablemente sean genes funcionales (trsA-trsN). trsA-trsM se transcriben en la misma dirección en una cadena, mientras que trsN se transcribe de manera divergente y su promotor se superpone parcialmente a trsA. Un clon que contiene trs por sí solo no se puede transferir de forma independiente y no se encontró ningún oriT candidato dentro o contiguo a trs. Una orf adicional, designada nes (enzima de detección de estafilococos), ubicada de 13.5 kb 5′ a trs, es esencial para la conjugación . Su secuencia de aminoácidos predicha muestra similitud con las relaxasas conocidas. 100 pb 5′ a nes se encuentra una secuencia oriT idéntica al oriT de plásmidos conjugativos o movibles: RSF1010, pTF-FC2, R1162, pSC101 y pIP501. Nes puede generar un nick de una sola cadena en oriT. La ubicación de oriT y en lejos del cúmulo de trs es única en los plásmidos estudiados y puede reflejar la inserción reciente de ADN extraño.

TrsN reprime la transcripción de genes esenciales para la transferencia conjugativa al unirse a las regiones 5′ a sus sitios de inicio de traducción . El TrsN purificado se une al ADN y retrasa progresivamente los fragmentos que contienen promotores de trsL, trsA y trsN. El exceso de TrsN disminuyó la actividad de la β-galactosidasa en una fusión transcripcional de trsL-LacZ y disminuyó la frecuencia de conjugación de pGO1. Por el contrario, la frecuencia de transcripción y conjugación aumentó en presencia de un exceso de trsL objetivo. la actividad de la β-galactosidasa también disminuyó en las fusiones de trsG, trsI y trsK que se transcriben del promotor anterior a trsD, a pesar de que no hay unión de TrsN a este fragmento promotor. Esto sugiere un patrón de transcripción complejo que aún no se ha resuelto por completo. nes es independiente de la regulación de trsN y produce abundantes niveles de transcripciones, mientras que la mayoría de las transcripciones de trs son bajas debido a la regulación de trsN.

TrsN parece modular en lugar de apagar y encender la expresión génica, por lo que los productos se fabrican en el momento y el nivel adecuados. Esto sugiere la existencia de varios bucles de retroalimentación complejos y que el propio trsN puede ser regulado. No está claro si la trsN responde a los productos del gen trs o si hay señales externas a la célula que desencadenan o modulan las funciones conjugativas.

Se informó recientemente de la secuencia completa de nucleótidos de la región de transferencia de pSK41 . traH codifica un producto de lipoproteínas, cuyos últimos ocho residuos de la secuencia de señal N-terminal comparten similitud de secuencia de aminoácidos con péptidos asociados con el mecanismo de conjugación inducido por feromonas de Enterococcus faecalis, lo que sugiere una posible función de este péptido como feromona. La TraH es reconocida como feromona por las células de Enterococcus faecalis que albergan el plásmido pAD1, por lo que también puede desempeñar un papel en la transferencia de ADN dirigida por pSK41.

5.2.2 Plásmidos estreptocócicos

Plásmido conjugativo de amplio rango de hospedadores estreptocócicos pIP501 (30.2 kb, que confiere resistencia al macrólido, lincosamida y estreptogramina, así como al cloranfenicol) codifica dos regiones involucradas en la capacidad de conjugación que fueron identificadas por mutagénesis de transposón . La región A contiene un sitio oriT funcional similar a oriTs de bacterias gramnegativas y seis marcos de lectura abiertos contiguos (orf1-6) inmediatamente aguas abajo de este sitio oriT. orf1 mostró similitud con las proteínas de la relaxasa del plásmido gramnegativo (gen MobA de RSF1010 y gen MobL de pTF-FC2), pero orfs2–6 fueron únicos. Además, orfs3-6 fue capaz de complementar mutaciones en trans, mientras que orf2 no pudo. Por lo tanto, a pesar de las similitudes en oriT y relaxase, la singularidad de orfs2–6 y sus productos putativos sugieren que puede haber diferencias fundamentales entre los sistemas de transferencia de bacterias Gram positivas y Gram negativas.

6 Transposones conjugativos

Los transposones conjugativos combinan características de transposones, plásmidos y bacteriófagos . Pueden extraerse e integrarse en el ADN como transposones, aunque por un mecanismo diferente al de las bien estudiadas Tn5 y Tn10: se transponen a través de intermedios circulares cerrados covalentemente y no duplican el sitio objetivo al integrarse en el ADN. La transferencia conjugativa también ocurre a través de un intermediario de transferencia covalentemente cerrado, en cuyo sentido se asemejan a plásmidos . Sin embargo, su escisión e integración se asemeja a la escisión e integración de bacteriófagos templados y algunas de las integrasas codificadas muestran similitud de secuencias con miembros de la familia de la integrasa lambda . Se encuentran en bacterias Gram positivas y Gram negativas. Los principales tipos se describen a continuación.

6,1 Tn916

Tn916 (18.5 kb) se encontró en E. faecalis (Gram-positivo) así como en especies Gram-negativas como Neisseria y Kingella, y se ha demostrado la transferencia entre estas especies. Lleva el mismo gen Tcr, tetM, que codifica un tipo de proteína de resistencia de protección de ribosomas, como Tn5253 (60 kb), que se encuentra en Streptococcus pneumoniae . Se ha cartografiado y secuenciado la región esencial para la transferencia de Tn916 . Ninguno de los productos predichos de esta región tiene una similitud de secuencia significativa con las proteínas pilus sexuales de plásmidos conjugativos y, dado que el número de genes es pequeño, este sistema de transferencia puede ser más simple que el de F o RK2 y puede carecer de un pilus sexual. Un pequeño fragmento de acción cis que puede movilizar un plásmido intransferible cuando un transposón intacto está presente en trans, y por lo tanto debería codificar oriT, contenía cuatro secuencias similares a RP4 o F oriTs. Una orf en la región de transferencia mostró una similitud significativa con la proteína de movilización de MbeE de ColE1 . Por lo tanto, el ADN monocatenario puede transferirse durante la conjugación.

La transferencia de Tn916 es estimulada por la tetraciclina 10-100 veces . Esto podría ser el resultado indirecto de la respuesta al estrés inducida por antibióticos. Sin embargo, debido a que int y xis se encuentran aguas abajo de tetM, la estimulación de la transcripción de tetM por tetraciclina puede resultar en un aumento de la lectura de int y xis y esto podría resultar en un aumento de la frecuencia de transposición. Un posible gen regulador, el traA, se encuentra entre tetM e int / xis . Se sugiere que hay un bajo nivel de transcripción constitutiva del promotor aguas arriba de traA y que TraA es un activador transcripcional que regula su propia transcripción y transcripción xis-Tn, así como genes de conjugación. De esta manera, la transposición y, por lo tanto, la transferencia indirecta podrían estar bajo doble control, como se observa para los genes de transferencia de plásmidos Ti.

6.2 Transposones conjugativos de anaerobios gramnegativos

En anaerobios gramnegativos, especialmente Bacteroides, se encontró un grupo de transposones completamente no relacionados con Tn916 . Son mucho más grandes: de 65 kb a más de 150 kb . Como Tn916 tienen un intermedio de transferencia circular . Pueden extraer y movilizar elementos integrados no vinculados (véase la sección 6.4). La mayoría de ellos llevan un tipo de protección ribosómica del gen Tcr tetQ y poseen un complicado sistema regulador que detecta la tetraciclina y controla las funciones de transferencia. Se conocen dos familias: Tcr ERL y Tcr Emr 78539.

La región del punto Tcr Emr del transposón de Bacteroides que es necesaria y suficiente para la transferencia conyugal se ha localizado a un segmento de 18 kb . La región oriT se encuentra en el medio del transposón . La capacidad de movilizar un plásmido en cis sugiere que después de que se ha introducido una muesca en oriT, una sola hebra se transporta a través del poro de apareamiento. El oriT no tiene similitud de secuencia con oriTs de plásmidos de E. coli conyugales o los extremos del ADN-T. Además, los genes que codifican proteínas de transferencia están localizados al menos a 3 kb de la región oriT. El orf adyacente al oriT codifica una proteína reguladora RteC, que controla la expresión de los genes tra.

La exposición corta de donantes de Bacteroides portadores de Tcr Emr DOT a niveles bajos de tetraciclina estimula la auto-transferencia en 10 000 veces . Esta estimulación probablemente no se deba al estrés causado por la inhibición de la síntesis de proteínas por la tetraciclina, ya que la clortetraciclina analógica no tóxica también estimula la transferencia. La tetraciclina estimula la transcripción de 20 veces del operón que contiene tetQ y los genes reguladores rteA y rteB (Fig. 6) . RteA tiene similitud de secuencia de aminoácidos con la proteína del sensor de los sistemas reguladores de dos componentes, pero su papel en el control de la transferencia no está establecido .Figura

RteB tiene similitud de secuencia de aminoácidos con la proteína activadora de dos sistemas componentes y, por lo tanto, puede funcionar con RteA. Es esencial para la transferencia, y activa rteC, un gen aguas abajo . También parece actuar como antirepresor para contrarrestar el efecto de un represor aún no identificado, que normalmente impide que los genes de transferencia se expresen: la región de transferencia del PUNTO Em Tcr, clonada en ausencia de rteABC y del represor putativo, puede transferirse constitutivamente. La RteC es esencial para la transferencia automática, pero no es necesaria para la movilización de plásmidos co-residentes. Esto sugiere que la RteC actúa como un antirepresor para controlar la expresión de genes relaxosómicos y / o genes esenciales para la escisión y la circularización del transposón conjugativo .

Parece poco probable que esta respuesta compleja a la tetraciclina haya evolucionado en el tiempo transcurrido desde el primer uso clínico de este antibiótico. Es poco probable que la tetraciclina producida en la naturaleza por actinomicetos contribuya a la evolución de este sistema porque los dos organismos viven en nichos diferentes. Otra posibilidad es que la tetraciclina no sea el inductor natural, sino que se asemeje a un compuesto fenólico vegetal que es el inductor real. Debido a que los bacteroides se conjugan solo en superficies sólidas, la detección de la presencia de plantas podría indicar la presencia de una superficie adecuada para el apareamiento .

6.3 El primer transposón conjugativo en Enterobacteriaceae

CTnscr94 es un transposón conjugativo grande (∼100 kb) en Enterobacteriaceae que se integra de forma independiente de RecA en dos sitios de unión específicos en el cromosoma de E. coli. Uno de los sitios de unión se ha identificado dentro del pheV, el gen estructural del TRNAFE. El transposón codifica una vía de fermentación de sacarosa dependiente de PTS. Parece ser el primer transposón conjugativo identificado en bacterias entéricas. Anteriormente solo hubo un reporte de un transposón conjugativo putativo, R391, encontrado en Proteus rettgeri, pero no ha sido bien documentado.

6.4 Movilización de segmentos de ADN integrados no vinculados mediante transposones conjugativos de Bacteroides: NBUs

NBUs, unidades bacteroides no replicantes (10-12 kb), son elementos integrados que comparten una alta homología en una región interna que contiene genes de movilización (mob) y oriT . La escisión y la circularización de los BUSN se desencadenan por RteB proporcionado por transposones conjugativos . La expresión de rteB es inducida por niveles bajos de tetraciclina, por lo que la presencia de un transposón conjugativo y la exposición a la tetraciclina son necesarias para la escisión y movilización de NBUs. NBUs codifica solo una proteína de movilización única que es capaz de unirse al oriT, cortar e iniciar la transferencia de una sola copia de cadena a través de un poro de apareamiento proporcionado por el transposón conjugativo . El sitio objetivo de NBU1 se encuentra en el extremo 3′ de un gen tRNAleu . El gen de la integrasa, intN1, de NBU1 se expresa constitutivamente. Las formas circulares NBU se movilizan también por plásmidos IncP R751 y RK2 . Pueden transferirse de Bacteroides a E. coli y no integrarse específicamente en el genoma de E. coli .

6.5 Conclusiones sobre los transposones conjugativos

Los transposones conjugativos contribuyen a la propagación de genes de resistencia a los antibióticos en bacterias clínicamente importantes como Bacteroides y cocos grampositivos. La transferencia de muchos de los transposones conjugativos de Bacteroides es estimulada por bajas concentraciones de antibióticos. Por lo tanto, los antibióticos no solo seleccionan cepas resistentes, sino que también estimulan la transferencia de genes de resistencia. Por lo tanto, el uso de antibióticos a concentración subletal puede tener un mayor efecto sobre la microflora residente de lo que se había pensado anteriormente.

7 Otros sistemas

Varios otros sistemas son notables por una variedad de razones, aunque hay pocos detalles moleculares disponibles sobre los mecanismos de control. Los plásmidos en pulgadas son bastante heterogéneos y constan de al menos cuatro subgrupos: IncHI1, IncHI2, IncHI3 e IncHII. La genética se entiende mejor para el plásmido IncHI1 R27, que es de interés porque tiene una temperatura óptima de 26-30°C y puede proporcionar información relevante para plásmidos del suelo y ambientes acuáticos que generalmente tienen temperaturas óptimas mucho más bajas que los organismos entéricos .

La región de transferencia del plásmido IncI1 R64 (plásmido de 122 kb de S. typhimurium) es la más grande caracterizada hasta la fecha, abarcando 54 kb. La región no es simplemente funciones de transferencia contiguas, ya que también se han encontrado genes de herencia estables dentro del segmento . Codifica dos tipos de pilus, así como funciones auxiliares como la primasa. Los pili gruesos producidos se necesitan en todas las condiciones, mientras que los pili finos solo se necesitan en apareamientos líquidos donde los pares de apareamiento son más propensos a desmoronarse debido al movimiento del donante y el receptor. Basándose en la secuencia completa de la región pil, se propone que los pili delgados pertenecen a la familia de tipo IV, que generalmente se asocian con la unión de bacterias patógenas a células eucariotas . Existen múltiples versiones del gen pilV que codifica la pilina para el pilus delgado. Un mecanismo de control inusual permite la expresión secuencial de diferentes genes pilV . Denominado shufflon, los reordenamientos de ADN son promovidos por una serie de siete repeticiones de 19 bp sobre las que actúa una recombinasa específica del sitio de la familia integrasa . Las inversiones en estos sitios permiten todas las combinaciones posibles de los cuatro segmentos diferentes, tres de los cuales tienen dos terminales C alternativos codificados desde cada extremo (A/A’, B/B’, C/C’). El cuarto segmento codifica solo un posible terminal C. Las diferentes proteínas pilus permiten la invasión de diferentes especies de huéspedes para que estos reordenamientos controlen la transferencia a huéspedes específicos. R64 muestra una regulación positiva a través de dos polipéptidos putativos, TraB y TraC, que son necesarios para la expresión de una serie de funciones asociadas a la transferencia, incluido el gen del pilus delgado y el gen de la primasa . La región oriT se compone de oriT y dos genes, nikA y nikB, que se transcriben de un promotor en la región oriT y, por lo tanto, se autorregulan por el relaxosoma ensamblado por NikA y NikB .

Al igual que los plásmidos IncP, los plásmidos IncN parecen ser siempre competentes en transferencia. Los genes necesarios están codificados en una región de 12 kb, que comprende 14 genes tra: tres para el ensamblaje del relaxosoma y 11 para el Mpf, siendo este último similar a los genes trb de la IncP, los genes Ti virB y los genes ptl de Bordetella . La capacidad de transferencia sin sobrecargar al huésped se logra mediante dos genes represores, korA y korB, que forman parte de la región tra que está organizada como operones divergentes de un par de promotores estrechamente espaciados entre el operón korB-kikA y el operón Tral-korA-traCDNEOFG. Estos dos promotores están organizados como promotores divergentes consecutivos regulados por un único sitio de enlace KorA / KorB. Un tercer promotor independiente aguas arriba de traN también está regulado por un único sitio de enlace KorA / KorB. Por lo tanto, existe una regulación autógena de los genes para el poro de apareamiento conyugal. No se observa regulación a menos que ambos genes sean funcionales, lo que proporciona un medio para coordinar ambos operones, pero no se sabe si ambas proteínas o solo una se unen al ADN. KorB parece consistir en una duplicación directa de un polipéptido con similitud a la familia HN-S de proteínas reguladoras similares a las histonas . La regulación del sistema relacionado codificado por plásmidos IncW no se ha estudiado ampliamente, pero se sabe que TrwA, una de las tres proteínas del relaxosoma, proporciona un circuito de control autógeno al unirse cerca de oriT, que también es la ubicación de la trwAp. TrwA muestra similitud de secuencia con la proteína TraJ de los plásmidos IncP, pero tiene un motivo de unión al ADN similar al de la proteína TraY de F.

Una serie de pequeños plásmidos móviles también refuerzan el principio de control autógeno de los genes para las proteínas del relaxosoma. La región mob del plásmido IncQ de amplio rango RSF1010 está englobada en una región de 1,8 kb y codifica tres proteínas que son necesarias para que el plásmido explote el sistema de transferencia de la IncP. Los genes de MobA y MobB se superponen, mientras que MobC está codificado divergentemente en la dirección opuesta . Los promotores de estos genes están fuertemente agrupados en la región oriT, dos disparando hacia mobAB y uno hacia mobC. La unión de las proteínas del relaxosoma al oriT causa una regulación autógena. Los mutantes en la región terminal N del mobA o en el mobC causan derepression. La proteína MobB también influye en la proporción del plásmido que existe en el relaxosoma y el tiempo que el plásmido permanece en este estado y, por lo tanto, es un determinante de la frecuencia de transferencia . La región mob del plásmido pTF-FC2 de 12,4 kb de Thiobacillus ferrooxidans muestra notables similitudes con la región oriT de los plásmidos de la IncP, en términos tanto de la organización de operones divergentes transcritos de promotores en la región oriT como de la similitud de secuencias de las proteínas del relaxosoma . Datos recientes han confirmado la existencia de circuitos autógenos que controlan la expresión del gen mob y han demostrado la importancia de la FHI de la proteína del huésped para determinar la frecuencia de movilización . Por otro lado, la región mbe de ColE1, que es muy similar a otros plásmidos productores de colicina como ColK y ColA, no muestra evidencia de autorregulación . Mapas oriT aguas arriba de los genes mbe, separados de ellos por el gen rom, por lo que la existencia de tales circuitos crearía una organización compleja.

8 Conclusiones

La idea de que los sistemas de transferencia evolucionaron a través de la cooperación de dos tipos de funciones: los sistemas de captura/replicación de ADN y los sistemas de fusión celular está generalmente respaldada por un estudio de los ejemplos que se han estudiado hasta ahora. Cuando los genes de transferencia se encuentran en grupos pequeños en lugar de en un solo bloque, los genes agrupados generalmente tienen una función común. Se puede prever un escenario de reclutamiento de genes por casete funcional, incluso si la función original del bloqueo de genes no era promover la transferencia conjugativa. El plásmido IncI1 parece un buen ejemplo de esto, ya que hay bloques separados para los genes oriT/relaxosoma, así como los dos tipos de pilus: el tipo que se necesita para promover la fusión celular y el tipo que proporciona un medio para juntar las bacterias cuando están flotando libres en suspensión planctónica.

Un bloque de genes que se adquirió claramente como una unidad ya ensamblada son las funciones mpf encontradas en IncP, Ti, IncN e IncW, pero relacionadas con el bloque ptl de B. pertussis y el grupo de genes cag de Helicobacter pylori. Ha habido algunos reordenamientos de genes que pueden tener importancia reguladora o funcional, por ejemplo, la yuxtaposición del homólogo virB11 al inicio del operón en los plásmidos de la IncP y el sistema Tra del plásmido Ti. La regulación se ha etiquetado en el frente de esta región en los plásmidos de la RipC mediante la adición de trbA y la adquisición de un promotor regulado por KorB. En el caso del sistema IncN, uno de los dos genes reguladores, korA, está incrustado entre los dos primeros genes del operón y no se encuentra en operones relacionados. El reclutamiento o la pérdida de los genes reguladores puede comprenderse mejor cuando se ha secuenciado un mayor número de sistemas relacionados.

El sistema de regulación más simple encontrado es el de la regulación autógena, en el que los genes dentro de los bloques de funciones de transferencia cierran la expresión de los genes una vez que se sintetiza el aparato de transferencia. Los plásmidos con tales sistemas parecen estar constantemente listos para ser transferidos y los sistemas estudiados hasta ahora tienden a ser bastante amplios en su rango de hospedadores. Tal vez la disponibilidad constante de nuevos anfitriones proporcione al plásmido una razón para estar siempre listo para la transferencia. El ensamblaje de tales circuitos autógenos es claramente lógico en el caso de genes para proteínas de relaxosoma transcritas de promotores en la región oriT cuando estas proteínas se ensamblan para formar el relaxosoma. Es menos claro cómo un circuito autógeno que controla los genes mpf requeridos para el ensamblaje de pilus puede detectar cuando está presente un número apropiado de pili funcionales.

El siguiente nivel de regulación es el que exhiben los plásmidos similares a F en los que los genes normalmente están apagados. La posibilidad de que los genes se activen es pequeña, por lo que se requiere un largo período de tiempo o una gran población para garantizar la aparición de bacterias con capacidad de transferencia. Si tal bacteria se encuentra con un receptor, entonces se produce la transferencia y el receptor sigue siendo competente para la transferencia durante algún tiempo. Esto permite la propagación exponencial a través de una nueva población de bacterias plásmidas negativas. Este sistema de regulación puede ser apropiado para las bacterias que viven en el intestino de los mamíferos, donde solo ocasionalmente las bacterias se encuentran con grandes poblaciones nuevas de receptores potenciales. El ambiente del intestino puede ser demasiado rico con multitud de especies de bacterias para permitir la señalización por una vía similar a la que se encuentra en Agrobacterium. La perpetuación del estado de dominio de transferencia por el proceso de transferencia en sí parece una buena manera de controlar la expresión génica de transferencia en respuesta a la presencia de receptores apropiados. Una estrategia alternativa para lograr el mismo fin está representada por los plásmidos que responden a feromonas en los que los receptores potenciales producen una feromona que estimula la producción de sustancia de agregación. El plásmido en sí mismo en realidad apaga la producción interna de la feromona a la que responde, de modo que solo activa los genes de transferencia cuando hay receptores apropiados presentes.

Los otros sistemas estudiados muestran una estrecha integración de fenotipo y frecuencia de transferencia. Los plásmidos Ti responden tanto a los receptores potenciales, como a la densidad de población de donantes y a la disponibilidad de nutrientes. La transferencia de los transposones conjugativos es estimulada específicamente por los antibióticos a los que confieren resistencia. Una vez que un sistema regulador ha evolucionado para hacer frente, por ejemplo, a la presencia de un contaminante o un antibiótico, los genes que vinculan la actividad de estos procesos de transferencia a entornos en los que se seleccionan los genes tenderán a tener una ventaja porque superarán la replicación y la propagación cuando el entorno sea adecuado, pero minimizarán su efecto en su huésped cuando no existan las condiciones inductoras.

El conocimiento detallado que se está acumulando ahora nos permite apreciar qué factores pueden estimular o limitar la propagación del plásmido. Ciertos tipos de terapia con antibióticos pueden promover la propagación de la resistencia a otros miembros de una comunidad mixta y dejar un problema potencial para el futuro, incluso si el efecto a corto plazo es reducir la infección. El desarrollo de pantallas para compuestos que provocan la pérdida de genes de transferencia podría conducir a formas de hacer que el transporte de plásmidos sea una desventaja. En algunos casos extremos, por ejemplo, los plásmidos de la IncP, se ha demostrado que el exceso de expresión génica de transferencia es letal, por lo que tales agentes podrían tener un efecto dramático en la supervivencia de las bacterias plásmidas positivas. Los problemas actuales con los rasgos transmitidos por plásmidos pueden llevar a considerar estrategias antibacterianas que se habrían descartado hace años. Esperamos que el material cubierto en esta revisión pueda ayudar a desencadenar conceptos tan novedosos.

Agradecimientos

M. Z. recibe una subvención para proyectos del Wellcome Trust (046356 / Z). Otros trabajos sobre plásmidos de la IncP en el laboratorio de los autores han recibido el apoyo del Consejo de Investigación Médica del Reino Unido, el Wellcome Trust y el BBSRC. Agradecemos la ayuda de muchos colegas para el suministro de información y sugerencias útiles.