kontroll av gener för konjugativ överföring av plasmider och andra mobila element

5.2 brett värdområde plasmider

5.2.1 Stafylokockplasmider

vissa Stafylokockplasmider är 40-60 kb i storlek och överföring med låg frekvens (104-106 transkonjuganter per givare) på fasta ytor . pGO1 (52 kb) som kodar för resistens mot aminoglykosider, trimetoprim och kvartära ammoniumföreningar fungerar som en modell för studier av genetisk organisation av överföringsområdet för sådana plasmider . Den konjugativa överföringsregionen lokaliserades genom transposonmutagenes . DNA-sekvens och transkriptionsorganisation av överföringsregionen (trs) identifierade 14 ORF över en 14-kb–region som sannolikt kommer att vara funktionella gener (trsA-trsN). trsA-trsM transkriberas i samma riktning på en sträng medan trsN transkriberas Divergent och dess promotor överlappar delvis trsA. En klon som innehåller trs ensam kan inte överföras oberoende och ingen kandidat oriT hittades inom eller angränsande till trs. En ytterligare orf, betecknad nes (nicking enzyme of staphylococcus), belägen 13.5 kb 5′ till trs är väsentlig för konjugering . Dess förutsagda aminosyrasekvens visar likhet med kända relaxaser. 100 bp 5 ‘ till nes ligger en oriT-sekvens identisk med oriten av konjugativa eller mobiliserbara plasmider: RSF1010, pTF-FC2, R1162, pSC101 och pIP501. Nes kan generera en enda sträng nick på oriT. Placering av oriT och nes långt borta från trs-klustret är unikt i studerade plasmider och kan återspegla den senaste införandet av främmande DNA.

TrsN undertrycker transkription av gener som är väsentliga för konjugativ överföring genom att binda till regioner 5′ till deras översättningsstartplatser . Renat TrsN binder DNA och fördröjer gradvis fragment som innehåller promotorer för trsL, trsA och trsN. Överskott av TrsN minskade aktiviteten hos en trsl-lacZ transcriptional fusion och minskade pgo1s konjugationsfrekvens. Omvänt transkription och konjugering frekvens ökade i närvaro av överskott mål trsL. aktiviteten av galaktosidas minskade också i trsG -, trsI-och trsK-fusioner som transkriberas från promotorn som föregår trsD, trots att det inte finns någon bindning av TrsN till detta promotorfragment. Detta antyder ett komplext transkriptionsmönster som ännu inte har utarbetats fullt ut. nes är oberoende av trsN-reglering och producerar rikliga nivåer av transkript, medan de flesta trs-transkripten är låga på grund av reglering av trsN.

TrsN verkar modulera snarare än att stänga av och på genuttryck, så produkterna tillverkas vid lämplig tidpunkt och nivå. Detta antyder förekomsten av olika komplexa återkopplingsslingor och att trsN själv kan regleras. Det är inte klart om trsN svarar på trs-genprodukter eller om det finns signaler utanför cellen som utlöser eller modulerar konjugativa funktioner.

den fullständiga nukleotidsekvensen för överföringsregionen från pSK41 rapporterades nyligen . traH kodar för en lipoproteinprodukt, vars sista åtta rester av den N-terminala signalsekvensen delar aminosyrasekvenslikhet med peptid associerad med den Feromoninducerade konjugeringsmekanismen för Enterococcus faecalis, vilket antyder en möjlig funktion av denna peptid som en feromon. TraH erkänns som en feromon av Enterococcus faecalis-celler som hyser plasmid pAD1, så det kan också spela en roll i PSK41-riktad DNA-överföring.

5.2.2 Streptokockplasmider

streptokock brett värdområde konjugativ plasmid pIP501 (30.2 kb, som ger resistens mot makrolid, linkosamid och streptogramin samt kloramfenikol) kodar för två regioner som är involverade i konjugeringsförmåga som identifierades genom transposonmutagenes . Region A innehåller en funktionell oriT-plats som liknar oriter av gramnegativa bakterier och sex sammanhängande öppna läsramar (orf1–6) omedelbart nedströms om denna oriT-plats. orf1 visade likhet med gramnegativa plasmid relaxasproteiner (MobA-gen av RSF1010 och MobL–gen av pTF-FC2), men orfs2-6 var unika. Dessutom orfs3-6 kunde komplettera mutationer i trans, medan orf2 inte kunde. Således trots likheter i oriT och relaxase, unika orfs2–6 och deras förmodade produkter tyder på att det kan finnas grundläggande skillnader mellan överföringssystem av Gram-positiva och gramnegativa bakterier.

6 Konjugativa transposoner

Konjugativa transposoner kombinerar egenskaper hos transposoner, plasmider och bakteriofager . De kan punktskatter från och integreras i DNA som transposoner, men med en annan mekanism än den för väl studerade Tn5 och Tn10: de transponerar genom kovalent stängda cirkulära mellanprodukter och duplicerar inte målplatsen vid integration i DNA. Konjugativ överföring sker också via en kovalent stängd överföringsintermediär, i vilket avseende de liknar plasmider . Emellertid liknar deras excision och integration excision och integration av tempererade bakteriofager och några av de kodade integraserna visar sekvenslikhet med medlemmar av lambda integrasfamiljen . De finns i både Gram-positiva och gramnegativa bakterier. Huvudtyperna beskrivs nedan.

6,1 Tn916

Tn916 (18.5 kb) hittades i E. faecalis (Gram-positiv) såväl i gramnegativa arter som Neisseria och Kingella, och överföring mellan dessa arter har visats. Den bär samma TCR-gen, tetM, som kodar för en ribosomskyddstyp av resistensprotein, som Tn5253 (60 kb), som finns i Streptococcus pneumoniae . Regionen som är nödvändig för överföring av Tn916 har kartlagts och sekvenserats . Ingen av de förutsagda produkterna i denna region har signifikant sekvenslikhet med sexpilusproteiner av konjugativa plasmider och eftersom antalet gener är litet kan detta överföringssystem vara enklare än F eller RK2 och kan sakna en sexpilus. Ett litet cis-verkande fragment som kan mobilisera en icke-överförbar plasmid när en intakt transposon är närvarande i trans, och därför bör koda oriT, innehöll fyra sekvenser som liknar antingen RP4 eller F oriTs. En orf i överföringsregionen visade signifikant likhet med Mbee-mobiliseringsprotein av ColE1 . Således kan enkelsträngat DNA överföras under konjugering.

överföring av Tn916 stimuleras av tetracyklin 10-100 gånger . Detta kan vara det indirekta resultatet av antibiotikainducerad stressrespons. Eftersom int och xis ligger nedströms tetM, kan stimulering av tetm-transkription med tetracyklin resultera i ökat genomläsning av int och xis och detta kan resultera i ökad transpositionsfrekvens. En möjlig reglerande gen, traA, ligger mellan tetM och int/xis . Det föreslås att det finns en låg nivå av konstitutiv transkription från promotorn uppströms traA och att TraA är en transkriptionsaktivator som uppreglerar sin egen transkription och xis-TN-transkription samt konjugeringsgener. På detta sätt kan transposition och därmed indirekt överföring vara under dubbel kontroll som observerats för överföringsgenerna av Ti-plasmider.

6.2 Konjugativa transposoner av gramnegativa anaerober

i gramnegativa anaerober, särskilt Bacteroides, hittades en grupp transposoner som helt inte var relaterade till Tn916 . De är mycket större: 65 kb till över 150 kb . Liksom Tn916 har de en cirkulär överföringsintermediär . De kan punktskatter och mobilisera icke länkade integrerade element (se Avsnitt 6.4). De flesta av dem har en ribosomskyddstyp av TCR-gen tetQ och de har ett komplicerat regleringssystem som känner av tetracyklin och kontrollerar överföringsfunktioner. Två familjer är kända: Tcr ERL och TCR Emr 78539.

regionen för Bacteroides transposon TCR Emr DOT som är nödvändig och tillräcklig för konjugal överföring har lokaliserats till ett 18-kb-segment . OriT-regionen ligger mitt i transposon . Förmågan att mobilisera en plasmid i cis antyder att efter att ett nick har införts vid oriT transporteras en enda sträng genom parningsporen. Oriten har ingen sekvenslikhet med oriter av konjugala E. coli-plasmider eller ändarna av T-DNA. Dessutom lokaliseras generna som kodar för överföringsproteiner minst 3 kb från oriT-regionen. Orf intill oriT kodar ett regulatoriskt protein RteC, som styr uttryck av tra-generna.

kort exponering av Bacteroides-givare som bär Tcr Emr DOT till låga nivåer av tetracyklin stimulerar självöverföring med 10 000 gånger . Denna stimulering beror förmodligen inte på stress orsakad av tetracyklininhibering av proteinsyntes eftersom den icke-toxiska analoga klortetracyklin stimulerar överföringen också. Tetracyklin stimulerar 20-faldig transkription av operonen innehållande tetQ och regulatoriska gener rteA och rteB (Fig. 6) . RteA har aminosyrasekvenslikhet med sensorproteinet i tvåkomponentregleringssystem, men dess roll i kontrollen av överföring är inte etablerad .

RteB har aminosyrasekvenslikhet med aktivatorproteinet i två komponentsystem och kan därför fungera med RteA. Det är viktigt för överföring och aktiverar rteC, en nedströmsgen . Det verkar också fungera som antirepressor för att motverka effekten av en ännu oidentifierad repressor, som normalt förhindrar att överföringsgener uttrycks : överföringsregionen för Tcr Em DOT, klonad i frånvaro av både rteABC och den förmodade repressorn, kan överföra konstitutivt. RteC är nödvändigt för självöverföring men är inte nödvändigt för mobilisering av samboende plasmider. Detta tyder på att RteC fungerar som en antirepressor för att kontrollera uttryck av relaxosomgener och/eller gener som är väsentliga för excision och cirkularisering av det konjugativa transposonet .

det verkar osannolikt att detta komplexa tetracyklinsvar kan ha utvecklats under tiden sedan den första kliniska användningen av detta antibiotikum. Tetracyklin som produceras i naturen av aktinomyceter är osannolikt att bidra till utvecklingen av detta system eftersom de två organismerna lever i olika nischer. En annan möjlighet är att tetracyklin inte är den naturliga induceraren, men liknar en växtfenolföreningar som är den verkliga induceraren. Eftersom Bacteroides konjugerar endast på fasta ytor, kan avkänning av närvaron av växter signalera närvaron av en lämplig yta för parning .

6.3 första konjugativa transposon i Enterobacteriaceae

CTnscr94 är en stor (100 kb) konjugativ transposon i Enterobacteriaceae som integreras på ett RecA-oberoende sätt vid två specifika fästställen i kromosomen av E. coli. En av fästplatserna har identifierats inom pheV, den strukturella genen för tRNAphe. Transposon kodar för en PTS-beroende sackarosfermenteringsväg. Det verkar vara det första konjugativa transposonet som identifierats i enteriska bakterier. Tidigare fanns det bara en rapport om en förmodad konjugativ transposon, R391, som finns i Proteus rettgeri, men det har inte dokumenterats väl.

6.4 mobilisering av icke-länkade, integrerade DNA-segment av Bacteroides konjugativa transposoner: Nbus

nbus, Nonreplicating Bacteroides units (10-12 kb), är integrerade element som delar hög homologi i en intern region som innehåller mobiliseringsgener (mob) och oriT . Excision och cirkularisering av NBUs utlöses av RteB som tillhandahålls av konjugativa transposoner . Expression av rteB induceras av låga nivåer av tetracyklin, så att närvaron av en konjugativ transposon och exponering för tetracyklin är nödvändig för excision och mobilisering av NBUs. NBUs kodar bara ett enda mobiliseringsprotein som kan binda till oriT, nicking, och initiera överföring av en enkelsträngad kopia genom en parning pore tillhandahålls av den konjugativa transposon . Nbu1-målplatsen ligger vid 3 ‘ – änden av en tRNAleu-gen . Integrasgenen, intN1, av NBU1 uttrycks konstitutivt. NBU cirkulära former mobiliseras också av IncP plasmider R751 och RK2 . De kan överföras från Bacteroides till E. coli och icke-specifikt integreras i E. coli genomet .

6.5 slutsatser om konjugativa transposoner

Konjugativa transposoner bidrar till spridningen av antibiotikaresistensgener i kliniskt viktiga bakterier som Bacteroides och grampositiva kocker. Överföring av många av Bacteroides konjugativa transposoner stimuleras av låga koncentrationer av antibiotika. Således väljer antibiotika inte bara för resistenta stammar utan stimulerar också överföring av resistensgener. Således kan användning av antibiotika vid subletal koncentration ha en större effekt på bosatt mikroflora än vad man tidigare trott.

7 andra system

ett antal andra system är anmärkningsvärda av olika skäl, även om få molekylära detaljer finns tillgängliga om kontrollmekanismer. Tumplasmiderna är ganska heterogena bestående av minst fyra undergrupper: IncHI1, IncHI2, IncHI3 och IncHII. Genetiken förstås bäst för IncHI1 plasmid R27, vilket är av intresse eftersom det har en temperatur optimal av 26-30 C och kan ge information som är relevant för plasmider från mark-och vattenmiljöer som i allmänhet har mycket lägre temperatur optima än enteriska organismer .

överföringsområdet för IncI1 plasmid R64 (122 kb plasmid från S. typhimurium) är den största karakteriserade hittills och täcker 54 kb. Regionen är inte bara sammanhängande överföringsfunktioner eftersom stabila arvgener också har hittats inom segmentet . Den kodar för två pilus-typer samt hjälpfunktioner som primase. Den tjocka pili som produceras behövs under alla förhållanden medan den tunna pili endast behövs i flytande parningar där parningspar är mer benägna att falla sönder på grund av rörelse av givare och mottagare. Baserat på pilregionens fullständiga sekvens föreslås att den tunna pili tillhör typ IV-familjen, som vanligtvis är förknippade med bindning av patogena bakterier till eukaryota celler . Det finns flera versioner av pilV-genen som kodar för pilin för den tunna pilusen. En ovanlig kontrollmekanism möjliggör sekventiellt uttryck av olika pilV-gener . Kallas shufflon, DNA-omarrangemangen främjas av en serie av sju 19-bp-upprepningar som påverkas av ett platsspecifikt rekombinas av integrasfamiljen . Inversionerna på dessa platser tillåter alla möjliga kombinationer av de fyra olika segmenten, varav tre har två alternativa C-termini kodade från varje ände (A/A’, B/B’, C/C’). Det fjärde segmentet kodar bara en möjlig C-terminal. De olika pilusproteinerna tillåter invasion av olika värdarter så att dessa omarrangemang styr överföringen till specifika värdar. R64 visar positiv reglering genom två förmodade polypeptider, TraB och TraC, som behövs för uttryck av ett antal överföringsassocierade funktioner inklusive genen för den tunna pilusen och primasgenen . OriT-regionen består av oriT och två gener, nikA och nikB som transkriberas från en promotor i oriT-regionen och därmed autoreguleras av relaxosomen sammansatt av NikA och NikB .

liksom IncP-plasmiderna verkar IncN-plasmiderna alltid överföra skickliga. De nödvändiga generna kodas i en 12-kb-region, innefattande 14 tra-gener: tre för relaxosome-montering och 11 för Mpf, den senare liknar IncP trb-generna, Ti virB-generna och Bordetella ptl-generna . Överföringsförmåga utan att överbelasta värden uppnås av två repressorgener, korA och korB, som är en del av tra-regionen som är organiserad som divergerande operoner från ett par nära placerade promotorer mellan korB-kikA operon och traL-korA-traCDNEOFG operon. Dessa två promotorer är organiserade som back to back divergerande promotorer som regleras av en enda KorA/KorB-bindningsplats. En tredje promotor som står ensam uppströms traN regleras också av en enda KorA/KorB-bindningsplats. Det finns således autogen reglering av generna för den konjugala parningsporen. Ingen reglering observeras om inte båda generna är funktionella, vilket ger ett sätt att samordna båda operonerna, men det är inte känt om båda proteinerna eller bara en binder till DNA. KorB verkar bestå av en direkt duplicering av en polypeptid med likhet med hn-s-familjen av histonliknande regulatoriska proteiner . Reglering av det relaterade systemet kodat av IncW-plasmider har inte studerats omfattande men det är känt att TrwA, ett av de tre relaxosomproteinerna, ger en autogen kontrollkrets genom bindning nära oriT som också är platsen för trwAp. TrwA visar sekvenslikhet med Traj-proteinet hos IncP-plasmider men har ett DNA-bindande motiv som liknar det hos Brickproteinet hos F.

ett antal små mobiliserbara plasmider förstärker också principen om autogen kontroll av generna för relaxosomproteiner. Mob-regionen i det breda värdområdet IncQ plasmid RSF1010 omfattas i en 1.8-kb-region och kodar för tre proteiner som behövs för att plasmid ska utnyttja IncP-överföringssystemet. Generna för MobA och MobB överlappar varandra medan MobC kodas Divergent i motsatt riktning . Promotorerna för dessa gener är tätt grupperade i oriT-regionen, två skjuter mot mobAB och en mot mobC. Bindning av relaxosomproteinerna till ellerdet orsakar autogen reglering. Mutanter i mobA n-terminalregionen eller i mobC orsakar derepression. MobB-proteinet påverkar också andelen plasmid som finns i relaxosomen och den tid som plasmid förblir i detta tillstånd och är därför en determinant för överföringsfrekvens . Mob-regionen i 12.4-kb plasmid pTF-FC2 från Thiobacillus ferrooxidans visar anmärkningsvärda likheter med oriT-regionen i IncP-plasmider, i termer av både organisationen av divergerande operoner transkriberade från promotorer i oriT-regionen och även sekvenslikhet hos relaxosomproteinerna . Nya data har bekräftat förekomsten av autogena kretsar som styr mob-genuttryck och visat vikten av värdprotein IHF vid bestämning av mobiliseringsfrekvens . Å andra sidan visar MBE-regionen i ColE1, som mycket liknar andra kolicinproducerande plasmider såsom ColK och ColA, inga tecken på autoregulering . oriT kartlägger uppströms mbe-generna, separerade från den av rom-genen och så skulle förekomsten av sådana kretsar skapa en komplex organisation.

8 slutsatser

tanken att överföringssystem utvecklades genom samarbete mellan två typer av funktion: DNA-nicking/replicationssystem och cellfusionssystem stöds generellt av en undersökning av de exempel som hittills har studerats. Där överföringsgener finns i små kluster snarare än ett enda block, har de grupperade generna i allmänhet en gemensam funktion. Ett scenario med genrekrytering med funktionell kassett kan förutses även om genblockets ursprungliga funktion inte var att främja konjugativ överföring. IncI1-plasmid verkar vara ett bra exempel på detta eftersom det finns separata block för oriT/relaxosome – gener, liksom de två typerna av pilus-den sort som behövs för att främja cellfusion och den sort som ger ett sätt att dra bakterier tillsammans när de flyter fritt i planktonisk suspension.

ett block av gener som tydligt förvärvades som en redan monterad enhet är MPF-funktionerna som finns i IncP, Ti, IncN och IncW men relaterade till ptl-blocket av B. pertussis och Cag-genklustret av Helicobacter pylori. Det har förekommit några genarrangemang som kan ha reglerande eller funktionell betydelse, till exempel sammansättningen av virB11-homologen till början av operonen i IncP-plasmider och Ti-plasmid-tra-systemet. Reglering har märkts på framsidan av denna region i IncP-plasmider genom tillsats av trbA samt förvärv av en KorB-reglerad promotor. När det gäller IncN-systemet är en av de två regulatoriska generna, korA, inbäddad mellan operonens första två gener och finns inte i relaterade operoner. Rekrytering eller förlust av regulatoriska gener kan förstås bättre när ett större antal relaterade system har sekvenserats.

det enklaste regleringssystemet som finns är autogen reglering, där gener inom block av överföringsfunktioner stänger av uttrycket av generna när överföringsapparaten syntetiseras. Plasmider med sådana system verkar vara ständigt redo för överföring och de hittills studerade systemen tenderar att vara ganska breda i sitt värdområde. Kanske ger den ständiga tillgängligheten av nya värdar plasmid en anledning att vara ständigt redo för överföring. Sammansättningen av sådana autogena kretsar är tydligt logisk när det gäller gener för relaxosomproteiner transkriberade från promotorer i oriT-regionen när dessa proteiner samlas för att bilda relaxosomen. Det är mindre tydligt hur en autogen krets som styr MPF-generna som krävs för pilus-montering kan känna av när ett lämpligt antal funktionella pili är närvarande.

nästa nivå av reglering är den som visas av F-liknande plasmider där generna normalt stängs av. Chansen att generna slås på är liten, så antingen krävs en lång tidsperiod eller en stor population för att säkerställa uppkomsten av överföringsbegåvade bakterier. Om en sådan bakterie möter en mottagare sker överföring och mottagaren förblir överföringsfärdig under en tid. Detta möjliggör exponentiell spridning genom en ny population av plasmidnegativa bakterier. Ett sådant regleringssystem kan vara lämpligt för bakterier som lever i däggdjurstarmen där endast ibland möter bakterierna stora nya populationer av potentiella mottagare. Miljön i tarmen kan vara för rik med en mängd bakteriearter för att tillåta signalering av en väg som liknar den som finns i Agrobacterium. Bevarandet av överföringsförmågan genom själva överföringsprocessen verkar som ett bra sätt att kontrollera överföringsgenuttryck som svar på närvaron av lämpliga mottagare. En alternativ strategi för att uppnå samma ände representeras av feromonresponsiva plasmider där potentiella mottagare producerar en feromon som stimulerar produktionen av aggregeringsämne. Plasmiden själv stänger faktiskt av den interna produktionen av feromonen som den svarar på så att den bara slår på överföringsgener när det finns lämpliga mottagare närvarande.

de andra undersökta systemen visar en nära integration av fenotyp och överföringsfrekvens. Ti-plasmiderna svarar både på potentiella mottagare, till givarbefolkningstäthet och till näringstillgänglighet. Överföring av de konjugativa transposonerna stimuleras specifikt av antibiotika som de ger resistens mot. När ett regleringssystem har utvecklats för att hantera till exempel närvaron av ett förorenande ämne eller ett antibiotikum, tenderar gener som kopplar aktiviteten hos dessa överföringsprocesser till miljöer där generna väljs att ha en fördel eftersom de kommer att replikera och spridas när miljön är rätt men kommer att minimera deras effekt på deras värd när de inducerande förhållandena saknas.

den detaljerade kunskap som nu ackumuleras tillåter oss att uppskatta vilka faktorer som sannolikt kommer att stimulera eller begränsa plasmidspridning. Vissa typer av antibiotikabehandling kan främja spridning av resistens till andra medlemmar i ett blandat samhälle och lämna ett potentiellt problem för framtiden även om den kortsiktiga effekten är att minska infektionen. Att utveckla skärmar för föreningar som resulterar i derepression av överföringsgener kan leda till sätt att göra plasmidtransport till en nackdel. I vissa extrema fall, till exempel IncP-plasmider, har överskott av överföringsgenuttryck visat sig vara dödligt, så sådana medel kan ha en dramatisk effekt på överlevnaden av plasmid-positiva bakterier. De nuvarande problemen med plasmidburna egenskaper kan leda till övervägande av antibakteriella strategier som skulle ha diskonterats år sedan. Vi hoppas att det material som behandlas i denna översyn kan bidra till att utlösa sådana nya begrepp.

bekräftelser

M. Z. stöds av ett projektbidrag från Wellcome Trust (046356/Z). Annat arbete på IncP-plasmider i författarnas laboratorium har fått stöd av UK Medical Research Council, Wellcome Trust och BBSRC. Vi erkänner hjälp av många kollegor för tillhandahållande av information och användbara förslag.