Kontroll av gener for konjugativ overføring av plasmider og andre mobile elementer

5.2 Bred vert rekkevidde plasmider

5.2.1 Stafylokokk plasmider

Noen Stafylokokk plasmider er 40-60 kb i størrelse og overføring med lav frekvens (104-106 transconjugants per donor) på faste overflater . pGO1 (52 kb) som koder for resistens mot aminoglykosider, trimetoprim og kvaternære ammoniumforbindelser, fungerer som en modell for studier av genetisk organisering av overføringsområdet for slike plasmider . Den konjugative overføringsregionen ble lokalisert ved transposon mutagenese . DNA-sekvens og transkripsjonell organisering av overføringsregionen (trs) identifiserte 14 orfs over en 14 kb region som sannsynligvis vil være funksjonelle gener (trsA-trsN). trsA-trsM transkriberes i samme retning på en streng mens trsN transkriberes divergently og promotoren overlapper delvis trsA. En klone som inneholder trs alene kan ikke overføres uavhengig og ingen kandidat oriT ble funnet innenfor eller sammenhengende med trs. En ekstra orf, betegnet nes (nicking enzym av stafylokokker), som ligger 13,5 kb 5 ‘ til trs er viktig for konjugering . Den forutsagte aminosyresekvensen viser likhet med kjente relaxaser. 100 bp 5 ‘ til nes ligger en oriT sekvens identisk med oriT av konjugative eller mobiliserbare plasmider: RSF1010, pTF-FC2, R1162, pSC101 og pIP501. Nes kan generere en enkelt streng nick på oriT. Plasseringen av oriT og nes langt borte fra trs-klyngen er unik i studerte plasmider og kan gjenspeile den nylige innsetting av fremmed DNA.

TrsN undertrykker transkripsjon av gener som er avgjørende for konjugativ overføring ved å binde til regioner 5 ‘ til deres oversettelsesstartsteder . Renset TrsN binder DNA og forsinker gradvis fragmenter som inneholder promotorer for trsL, trsA og trsN. Overskudd Av TrsN reduserte β-galaktosidaseaktivitet i en trsl-lacZ transkripsjonell fusjon og redusert pgo1s konjugeringsfrekvens. Omvendt transkripsjon og konjugering frekvens økt i nærvær av overskytende mål trsL. β-Galaktosidaseaktivitet ble også redusert i trsG -, trsI-og trsK-fusjoner som transkriberes fra arrangøren før trsD, til tross for at Det ikke er noen binding Av TrsN til dette arrangørfragmentet. Dette antyder et komplekst transkripsjonsmønster som ennå ikke er fullt utarbeidet. nes er uavhengig av trsn regulering og produserer rikelig nivåer av transkripsjoner, mens de fleste av trs transkripsjoner er lave på grunn av regulering av trsN.

TrsN ser ut til å modulere i stedet for å slå av og på genuttrykk, slik at produktene er laget på riktig tidspunkt og nivå. Dette antyder eksistensen av ulike komplekse tilbakemeldingsløkker, og at trsN selv kan reguleres. Det er ikke klart om trsN reagerer på trs genprodukter eller om det er signaler utenfor cellen som utløser eller modulerer konjugative funksjoner.

den komplette nukleotidsekvensen av overføringsområdet fra pSK41 ble nylig rapportert . traH koder for et lipoproteinprodukt, hvis siste åtte rester Av Den n-terminale signalsekvensen deler aminosyresekvenslikhet med peptid assosiert Med Den feromoninduserte konjugasjonsmekanismen Til Enterococcus faecalis, noe som tyder på en mulig funksjon av dette peptidet som et feromon. TraH er anerkjent som et feromon Av Enterococcus faecalis-celler som har plasmid pAD1, så det kan også spille en rolle i PSK41-rettet DNA-overføring.

5.2.2 Streptokokkplasmider

Konjugativt plasmid pIP501 (30.2 kb, som gir resistens mot makrolid, linkosamid og streptogramin samt kloramfenikol) koder for to regioner involvert i konjugasjonsferdigheter som ble identifisert ved transposon mutagenese . Region a inneholder et funksjonelt oriT-område som ligner Orits Av Gram-negative bakterier og seks sammenhengende åpne leserammer (orf1–6) umiddelbart nedstrøms for dette oriT-området. orf1 viste likhet Med Gram-negative plasmid relaxase proteiner (MobA gen AV RSF1010 Og MobL gen av pTF-FC2), men orfs2-6 var unik. Videre orfs3-6 var i stand til å utfylle mutasjoner i trans, mens orf2 ikke kunne. Dermed til tross for likheter i oriT og relaxase, unikhet av orfs2–6 og deres antatte produkter tyder på at det kan være grunnleggende forskjeller mellom overføringssystemer Av Gram-positive og Gram-negative bakterier.

6 Konjugative transposoner

Konjugative transposoner kombinerer funksjoner av transposoner, plasmider og bakteriofager . De kan aksessere FRA OG integrere I DNA som transposoner, men med en annen mekanisme fra den for godt studerte Tn5 Og Tn10: de transponerer gjennom kovalent lukkede sirkulære mellomprodukter og dupliserer ikke målstedet ved integrering i DNA. Konjugativ overføring skjer også via en kovalent lukket overføring mellomliggende, i hvilken henseende de ligner plasmider . Imidlertid ligner deres excision og integrasjon excision og integrasjon av tempererte bakteriofager, og noen av de kodede integrasene viser sekvenslikhet til medlemmer av lambda integrase-familien . De finnes I Både Gram-positive og Gram-negative bakterier. Hovedtyper er beskrevet nedenfor.

6,1 Tn916

Tn916 (18.5 kb) ble funnet I E. faecalis (Gram-positiv) samt I Gram-negative arter Som Neisseria Og Kingella, og overføring mellom disse artene har blitt påvist. Den bærer det samme tcr-genet, tetM, som koder for en ribosombeskyttelsestype resistensprotein, Som Tn5253 (60 kb), funnet I Streptococcus pneumoniae . Regionen avgjørende for overføring Av Tn916 har blitt kartlagt og sekvensert . Ingen av de forventede produktene i denne regionen har signifikant sekvenslikhet med sexpilusproteiner av konjugative plasmider, og siden antall gener er små, kan dette overføringssystemet være enklere Enn F ELLER RK2 og kan mangle en sexpilus. Et lite cis-virkende fragment som kan mobilisere et ikke-overførbart plasmid når et intakt transposon er tilstede i trans, og bør derfor kode oriT, inneholdt fire sekvenser som ligner ENTEN RP4 eller F oriTs. En orf i overføringsregionen viste signifikant likhet Med MbeE mobilisasjonsprotein Av ColE1 . Dermed kan enkeltstrenget DNA overføres under konjugering.

Overføring Av Tn916 stimuleres av tetracyklin 10-100 ganger . Dette kan være det indirekte resultatet av antibiotikaindusert stressrespons. Fordi int og xis ligger nedstrøms for tetM, kan imidlertid stimulering av tetm-transkripsjon med tetracyklin resultere i økt gjennomlesning av int og xis, og dette kan resultere i økt transponeringsfrekvens. Et mulig regulatorisk gen, traA, ligger mellom tetM og int / xis . Det foreslås at det er et lavt nivå av konstitutiv transkripsjon fra promotoren oppstrøms for traA, og At TraA er en transkripsjonell aktivator som oppregulerer sin egen transkripsjon og xis-Tn transkripsjon samt konjugasjonsgener. På denne måten transposisjon og derfor indirekte overføring kan være under dobbel kontroll som observert for overføring gener Av Ti plasmider.

6.2 Konjugative transposoner Av Gram-negative anaerober

I Gram-negative anaerober, spesielt Bacteroides, ble det funnet en gruppe transposoner helt uavhengig Av Tn916 . De er mye større: 65 kb til over 150 kb . Som Tn916 har de et sirkulært overføringsmellomprodukt . De kan aksessere og mobilisere sammenkoblede integrerte elementer (Se Avsnitt 6.4). De fleste av dem bærer en ribosombeskyttelsestype Tcr gent tetQ, og de har et komplisert reguleringssystem som sanser tetracyklin og styrer overføringsfunksjoner. To familier er kjent: Tcr Erl og Tcr Emr 78539.

Regionen Av Bacteroides transposon Tcr Epj DOT som er nødvendig og tilstrekkelig for konjugal overføring har blitt lokalisert til en 18-kb segment . OriT-regionen ligger midt i transposonen . Evnen til å mobilisere et plasmid i cis tyder på at etter en nick er innført på oriT, en enkelt tråd transporteres gjennom parring pore. OriT har ingen sekvens likhet med oriTs av konjugale e. coli plasmider eller endene AV T-DNA. I tillegg er genene som koder for overføringsproteiner lokalisert minst 3 kb unna oriT-regionen. Orf ved siden av oriT koder for et regulatorisk protein RteC, som styrer ekspresjon av tra-gener.

Kort eksponering Av Bacteroides donor bærer Tcr Epj DOT til lave nivåer av tetracyklin stimulerer selv-overføring av 10 000 ganger . Denne stimuleringen skyldes sannsynligvis ikke stress forårsaket av tetracyklinhemming av proteinsyntese siden den ikke-toksiske analoge klortetracyklin stimulerer overføring også. Tetracyklin stimulerer 20 ganger transkripsjon av operonen som inneholder tetQ og regulatoriske gener rteA og rteB (Fig. 6) . RteA har aminosyresekvenslikhet med sensorproteinet i to komponentreguleringssystemer, men dets rolle i kontroll av overføring er ikke etablert .

RteB har aminosyresekvenslikhet med aktivatorproteinet i to komponentsystemer og kan derfor fungere med RteA. Det er viktig for overføring , og aktiverer rteC, et nedstrøms gen . Det ser også ut til å fungere som antirepressor for å motvirke effekten av en hittil uidentifisert repressor, som normalt forhindrer overføringsgener fra å bli uttrykt : overføringsområdet For Tcr Em DOT, klonet i fravær av både rteABC og den antatte repressoren, kan overføre konstitutivt. RteC er viktig for selvoverføring, men er ikke nødvendig for mobilisering av medbeboende plasmider. Dette antyder At RteC fungerer som en antirepressor for å kontrollere ekspresjon av relaxosomgener, og / eller gener som er avgjørende for eksisjon og sirkularisering av konjugativ transposon .

det virker usannsynlig at denne komplekse tetracyklinresponsen kan ha utviklet seg i tiden siden den første kliniske bruken av dette antibiotika. Tetracyklin produsert i naturen av actinomycetes er usannsynlig å bidra til utviklingen av dette systemet fordi de to organismene lever i forskjellige nisjer. En annen mulighet er at tetracyklin ikke er den naturlige induktoren, men ligner en plantefenolforbindelser som er den virkelige induktoren. Fordi Bacteroides konjugerer bare på faste overflater, kan sensing av tilstedeværelsen av planter signalere tilstedeværelsen av en egnet overflate for parring .

6.3 Første konjugative transposon I Enterobacteriaceae

CTnscr94 er en stor (∼100 kb), konjugativ transposon I Enterobacteriaceae som integreres På En RecA-uavhengig måte på to spesifikke festesteder i kromosomet Til E. coli. Et av vedleggsstedene er identifisert i pheV, det strukturelle genet for tRNAphe. Transposonet koder FOR EN PTS-avhengig sukrose-fermenteringsvei. Det synes å være den første konjugative transposon identifisert i enteriske bakterier. Tidligere var det bare en rapport av en antatt konjugativ transposon, R391, funnet I Proteus rettgeri, men det har ikke blitt godt dokumentert.

6.4 Mobilisering av ukoblede, integrerte DNA-segmenter Med Bacteroides konjugative transposoner: NBUs

NBUs, Nonreplicating Bacteroides units (10-12 kb), er integrerte elementer som deler høy homologi i en intern region som inneholder mobiliseringsgener (mob) og oriT . Excision og sirkularisering Av NBUs utløses Av RteB levert av konjugative transposoner . Ekspresjon av rteB induseres av lave nivåer av tetracyklin, slik at tilstedeværelse av et konjugativt transposon og eksponering for tetracyklin er nødvendig for eksisjon og mobilisering Av NBUs. NBUs kode bare en enkelt mobilisering protein som er i stand til å binde seg til oriT, nicking, og initiere overføring av en enkelt strandet kopi gjennom en parring pore levert av konjugative transposon . NBU1-målstedet ligger i 3 ‘ enden av et tRNAleu-gen . Integrasegenet, intN1, AV NBU1 uttrykkes konstitusjonelt. NBU sirkulære former mobiliseres også Av IncP plasmider R751 og RK2 . De kan overføres Fra Bacteroides Til E. coli og ikke-spesifikt integrert I e. coli genomet .

6.5 Konklusjoner om konjugative transposoner

Konjugative transposoner bidrar til spredning av antibiotikaresistensgener i klinisk viktige bakterier som Bacteroides og Gram-positive kokker. Overføring av Mange Av Bacteroides konjugative transposoner stimuleres av lave konsentrasjoner av antibiotika. Dermed velger antibiotika ikke bare resistente stammer, men stimulerer også overføring av resistensgener. Dermed kan bruk av antibiotika ved subletal konsentrasjon ha en større effekt på bosatt mikroflora enn tidligere antatt.

7 andre systemer

en rekke andre systemer er kjent for en rekke årsaker, selv om få molekylære detaljer er tilgjengelige om kontrollmekanismer. Tomme plasmider er ganske heterogene bestående av minst fire undergrupper: IncHI1, IncHI2, IncHI3 og IncHII. Genetikken er best forstått For inchi1 plasmid R27, som er av interesse fordi den har en temperatur optimal 26-30°C Og kan gi informasjon som er relevant for plasmider fra jord og vannmiljøer som generelt har mye lavere temperatur optima enn enteriske organismer .

overføringsområdet Til IncI1 plasmid R64 (122 kb plasmid Fra s. typhimurium) er den største karakteriserte hittil, og dekker 54 kb. Regionen er ikke bare sammenhengende overføringsfunksjoner siden stabile arvegener også er funnet innenfor segmentet . Den koder for to pilustyper samt tilleggsfunksjoner som primase. Den tykke pili produsert er nødvendig under alle forhold, mens den tynne pili er bare nødvendig i flytende parringer der parring parene er mer sannsynlig å falle fra hverandre på grunn av bevegelse av donor og mottaker. Basert på den komplette sekvensen av pil-regionen foreslås det at tynn pili tilhører TYPE IV-familien, som vanligvis er forbundet med vedlegg av patogene bakterier til eukaryote celler . Det er flere versjoner av pilV-genet som koder for pilin for tynn pilus. En uvanlig kontrollmekanisme tillater sekvensiell uttrykk for forskjellige pilV-gener . Kalt shufflon, dna rearrangements fremmes av en serie på syv 19-bp gjentar som er handlet på av en stedsspesifikk rekombinase av integrase familien . Inversjonene på disse stedene tillater alle mulige kombinasjoner av de fire forskjellige segmentene, hvorav tre har to alternative c-termini kodet fra hver ende (A/A’, B/B’, C/C’). Det fjerde segmentet koder bare en mulig C-terminus. De forskjellige pilusproteinene tillater invasjon av forskjellige vertsarter, slik at disse omorganiseringene styrer overføringen til bestemte verter. R64 viser positiv regulering gjennom to antatte polypeptider, TraB og TraC, som er nødvendig for ekspresjon av en rekke overføringsassosierte funksjoner, inkludert genet for tynn pilus og primasegenet . OriT-regionen består av oriT og to gener, nikA og nikB, som transkriberes fra en promotor i oriT-regionen og blir dermed autoregulert av relaxosomet samlet av NikA og NikB .

Som IncP plasmider IncN plasmider synes å være alltid overføre dyktig. Genene som kreves er kodet i en 12 kb-region, bestående av 14 tra-gener: tre for relaxosome montering og 11 For Mpf, sistnevnte er lik IncP trb gener, Ti virB gener Og Bordetella ptl gener . Overføring ferdigheter uten over-belaste verten oppnås ved to repressor gener, korA og korB, som er en del av tra-regionen som er organisert som divergerende operoner fra et par tett linjeavstand arrangører mellom korB-kikA operon og traL-korA-traCDNEOFG operon. Disse to arrangører er organisert som rygg mot rygg divergerende arrangører regulert av en Enkelt KorA / KorB bindende site. En tredje promoter som står alene oppstrøms traN er også regulert av Et Enkelt KorA/KorB bindingssted. Det er således autogen regulering av gener for den konjugale parringsporen. Ingen regulering observeres med mindre begge gener er funksjonelle, noe som gir et middel til å koordinere begge operoner, men det er ikke kjent om begge proteiner eller bare ett bindes TIL DNA. KorB ser ut til å bestå av en direkte duplisering av et polypeptid med likhet MED hn-s-familien av histonlignende regulatoriske proteiner . Regulering av det relaterte systemet kodet Av IncW plasmider har ikke blitt studert grundig, men Det er kjent At TrwA, et av de tre relaxosomproteinene, gir en autogen kontrollkrets ved binding nær oriT, som også er stedet for trwAp. TrwA viser sekvenslikhet til TraJ-proteinet Av IncP-plasmider, men har ET DNA-bindende motiv som ligner På Brettproteinet Av F.

en rekke små mobiliserbare plasmider forsterker også prinsippet om autogen kontroll av gener for relaxosomproteiner. Mob-regionen I Det brede vertsområdet IncQ plasmid RSF1010 er omfattet i en 1,8 kb-region og koder for tre proteiner som trengs for at plasmidet skal kunne utnytte IncP-overføringssystemet. Genene For MobA og MobB overlapper Mens MobC er kodet divergently i motsatt retning . Promotørene for disse genene er tett gruppert i oriT-regionen, to skyter mot mobAB og en mot mobC. Binding av relaxosomproteiner til oriT forårsaker autogen regulering. Mutanter i mobA N-terminal-regionen eller i mobC forårsaker derepresjon. MobB-proteinet påvirker også andelen av plasmidet som finnes i relaxosomet og hvor lenge plasmidet forblir i denne tilstanden og derfor er en determinant for overføringsfrekvens . Mob-regionen av 12.4-kb plasmid pTF-FC2 fra thiobacillus ferrooxidans viser bemerkelsesverdige likheter med oriT-regionen Av IncP-plasmidene, både når det gjelder organisering av divergerende operoner transkribert fra promotorer i oriT-regionen og også sekvenslikhet av relaxosomproteiner . Nylige data har bekreftet eksistensen av autogene kretser som kontrollerer mob-genuttrykk og demonstrert betydningen av vertsprotein IHF for å bestemme mobiliseringsfrekvensen . På den annen side viser mbe-regionen ColE1, som er veldig lik andre kolicinproduserende plasmider som ColK og ColA, ingen tegn på autoregulering . oriT kartlegger oppstrøms av mbe-genene, skilt fra det av rom-genet, og slik at eksistensen av slike kretser ville skape en kompleks organisasjon.

8 Konklusjoner

ideen om at overføringssystemer utviklet seg gjennom samarbeid mellom TO typer funksjon: DNA-nicking/replikasjonssystemer og cellefusjonssystemer støttes generelt av en undersøkelse av eksemplene som har blitt studert så langt. Hvor overføringsgener finnes i små klynger i stedet for en enkelt blokk, har de grupperte gener generelt en felles funksjon. Et scenario med genrekruttering med funksjonell kassett kan planlegges selv om den opprinnelige funksjonen til genblokken ikke var å fremme konjugativ overføring. IncI1-plasmidet virker som et godt eksempel på dette siden det er separate blokker for oriT / relaxosom-gener, samt de to typer pilus – den typen som trengs for å fremme cellefusjon og den typen som gir et middel til å trekke bakterier sammen når de flyter fritt i planktonisk suspensjon.

en blokk med gener som klart ble anskaffet som en allerede montert enhet, er mpf-funksjonene som finnes I IncP, Ti, IncN og IncW, men relatert til ptl-blokken Av b. pertussis og cag-genklyngen Av Helicobacter pylori. Det har vært noen genrearrangementer som kan ha regulatorisk eller funksjonell betydning, for eksempel sammenstillingen av virB11-homologen til starten av operonen I IncP-plasmider og Ti-plasmid Tra-systemet. Regulering har blitt merket på forsiden av denne regionen I IncP plasmider gjennom tillegg av trbA samt oppkjøp av En KorB-regulert promotor. I Tilfelle Av IncN-systemet er en Av de to regulatoriske gener, korA, innebygd mellom de to første gener av operonen og finnes ikke i relaterte operoner. Rekruttering eller tap av regulatoriske gener kan forstås bedre når et større antall relaterte systemer er sekvensert.

det enkleste reguleringssystemet som er funnet er autogen regulering, hvor gener i blokkene av overføringsfunksjoner slår ned ekspresjon av gener når overføringsapparatet er syntetisert. Plasmider med slike systemer ser ut til å være konstant klar for overføring, og systemene som hittil er studert, har en tendens til å være ganske brede i vertsområdet. Kanskje den konstante tilgjengeligheten av nye verter gir plasmidet en grunn til å være evig klar for overføring. Samlingen av slike autogene kretser er tydelig logisk når det gjelder gener for relaxosomproteiner transkribert fra promotorer i oriT-regionen når disse proteinene samles for å danne relaxosomet. Det er mindre klart hvordan en autogen krets som styrer mpf-gener som kreves for pilusmontering, kan fornemme når et passende antall funksjonelle pili er tilstede.

det neste nivået av regulering er det som vises Av F-lignende plasmider der genene normalt er slått av. Sjansen for at genene blir slått på er liten, så det er nødvendig med en lang periode eller en stor befolkning for å sikre utseendet på overførings-dyktige bakterier. Hvis en slik bakterie møter en mottaker, skjer overføringen, og mottakeren forblir overføring dyktig i noen tid. Dette tillater eksponentiell spredning gjennom en ny populasjon av plasmid-negative bakterier. Et slikt reguleringssystem kan være hensiktsmessig for bakterier som lever i pattedyrstammen, hvor bakteriene bare av og til møter store nye populasjoner av potensielle mottakere. Miljøet i tarmen kan være for rik med en rekke bakteriearter for å tillate signalering ved en vei som ligner den som finnes i Agrobacterium. Videreføringen av overførings dyktig tilstand ved selve overføringsprosessen virker som en god måte å kontrollere overføring genuttrykk i respons til tilstedeværelsen av passende mottakere. En alternativ strategi for å oppnå samme ende er representert av feromon-responsive plasmider der potensielle mottakere produserer et feromon som stimulerer produksjon av aggregeringsstoff. Plasmidet selv slår faktisk ned intern produksjon av feromonet som det reagerer på, slik at det bare slår på overføringsgener når det er passende mottakere til stede.

de andre undersøkte systemene viser en tett integrasjon av fenotype og overføringsfrekvens. Ti-plasmidene reagerer både på potensielle mottakere, til donorpopulasjonstetthet og til næringstilgjengelighet. Overføring av konjugative transposoner stimuleres spesielt av antibiotika som de gir resistens. Når et reguleringssystem har utviklet seg for å håndtere for eksempel tilstedeværelsen av et forurensende stoff eller et antibiotikum, vil gener som knytter aktiviteten til disse overføringsprosessene til miljøer der genene er valgt, ha en fordel fordi de vil over replikere og spre seg når miljøet er riktig, men vil minimere effekten på verten når de induserende forholdene er fraværende.

den detaljerte kunnskapen som nå samler seg, tillater oss å sette pris på hvilke faktorer som sannsynligvis vil stimulere eller begrense plasmid-spredning. Visse typer antibiotikabehandling kan fremme spredning av resistens til andre medlemmer av et blandet samfunn og gi et potensielt problem for fremtiden, selv om den kortsiktige effekten er å redusere infeksjon. Utvikling av skjermer for forbindelser som resulterer i derepresjon av overførings gener kan føre til måter å gjøre plasmid vogn en ulempe. I noen ekstreme tilfeller, for Eksempel IncP plasmider, har overskytende overføring genuttrykk vist seg å være dødelig, slik at slike midler kan ha en dramatisk effekt på overlevelse av plasmid-positive bakterier. De nåværende problemene med plasmid borne egenskaper kan føre til vurdering av antibakterielle strategier som ville ha vært diskontert år siden. Vi håper at materialet dekket i denne anmeldelsen kan bidra til å utløse slike nye konsepter.

Anerkjennelser

M. Z. støttes av Et prosjektstipend Fra Wellcome Trust (046356 / Z). Annet arbeid På IncP plasmider i forfatterens laboratorium har blitt støttet av UK Medical Research Council, Wellcome Trust og BBSRC. Vi anerkjenner hjelp fra mange kolleger for tilførsel av informasjon og nyttige forslag.