kontrol af gener til konjugativ overførsel af plasmider og andre mobile elementer

5.2 bredt værtsområde plasmider

5.2.1 Stafylokokplasmider

nogle Stafylokokplasmider er 40-60 kb i størrelse og overførsel med lav frekvens (104-106 transconjugants pr donor) på faste overflader . pGO1 (52 kb), der koder for resistens over for aminoglycosider, trimethoprim og kvaternære ammoniumforbindelser, tjener som model til undersøgelse af genetisk organisering af overførselsregionen for sådanne plasmider . Den konjugative overførselsregion blev lokaliseret ved transposonmutagenese . DNA-sekvens og transkriptionel organisering af overførselsregionen (trs) identificerede 14 Orf ‘ er over en 14-kb–region, som sandsynligvis vil være funktionelle gener (trsA-trsN). trsA-trsM transskriberes i samme retning på en streng, mens trsN transskriberes forskelligt, og dens promotor overlapper delvist trsA. En klon indeholdende trs alene kan ikke overføres uafhængigt, og ingen kandidat Orit blev fundet inden for eller sammenhængende med trs. En yderligere orf, betegnet NES, placeret 13,5 kb 5 ‘ til trs er afgørende for konjugation . Dens forudsagte aminosyresekvens viser lighed med kendte afslapninger. 100 bp 5 ‘ til nes ligger en Orit-sekvens identisk med Orit af konjugative eller mobiliserbare plasmider: RSF1010, pTF-FC2, R1162, pSC101 og pIP501. Nes kan generere en enkelt streng nick på oriT. Placering af oriT og nes langt væk fra trs-klyngen er unik i undersøgte plasmider og kan afspejle den nylige indsættelse af fremmed DNA.

TrsN undertrykker transkription af gener, der er essentielle for konjugativ overførsel ved at binde til regioner 5′ til deres oversættelsesstartsteder . Renset TrsN binder DNA og forsinker gradvist fragmenter indeholdende promotorer til trsL, trsA og trsN. Overskridelse af TrsN nedsatte den transkriptionelle fusion af pgo1 og nedsatte konjugationsfrekvensen for pGO1. Omvendt steg transkriptions-og konjugationsfrekvensen i nærvær af overskydende mål trsL. i trsg -, trsI-og trsK-fusioner, der transskriberes fra promotoren forud for trsD, på trods af at der ikke er nogen binding af TrsN til dette promotorfragment. Dette antyder et komplekst transkriptionsmønster, som endnu ikke er udarbejdet fuldt ud. nes er uafhængig af trsn-regulering og producerer rigelige niveauer af udskrifter, mens de fleste af trs-transkripterne er lave på grund af regulering af trsN.

TrsN ser ud til at modulere snarere end at slukke og tænde genekspression, så produkterne fremstilles på det passende tidspunkt og niveau. Dette antyder eksistensen af forskellige komplekse feedback-sløjfer, og at trsN selv kan reguleres. Det er ikke klart, om trsN reagerer på trs-genprodukter, eller om der er signaler uden for cellen, der udløser eller modulerer konjugative funktioner.

den komplette nukleotidsekvens af overførselsregionen fra pSK41 blev for nylig rapporteret . traH koder for et lipoproteinprodukt, hvis sidste otte rester af den N-terminale signalsekvens deler aminosyresekvenslighed med peptid associeret med feromoninduceret konjugationsmekanisme af Enterococcus faecalis, hvilket antyder en mulig funktion af dette peptid som et feromon. TraH er anerkendt som et feromon af Enterococcus faecalis celler huser plasmid pAD1 , så det kan også spille en rolle i PSK41-rettet DNA-overførsel.

5.2.2 Streptokokplasmider

streptokok bredt værtsområde konjugativt plasmid pIP501 (30.2 kb, der giver resistens over for makrolid, lincosamid og streptogramin samt chloramphenicol) koder for to regioner, der er involveret i konjugationsevner, som blev identificeret ved transposonmutagenese . Region A indeholder et funktionelt oriT-sted svarende til oriTs af gramnegative bakterier og seks sammenhængende åbne læserammer (orf1–6) umiddelbart nedstrøms for dette oriT-sted. orf1 viste lighed med gramnegative plasmidrelaksaseproteiner (MobA-gen af RSF1010 og MobL–gen af pTF-FC2), men orfs2-6 var unikke. Desuden var orfs3 – 6 i stand til at supplere mutationer i trans, mens orf2 ikke kunne. På trods af ligheder i oriT og afslappende antyder det unikke ved orfs2–6 og deres formodede produkter, at der kan være grundlæggende forskelle mellem overførselssystemer for Gram-positive og Gram-negative bakterier.

6 konjugative transposoner

konjugative transposoner kombinerer træk ved transposoner, plasmider og bakteriofager . De kan punge fra og integrere i DNA som transposoner, skønt ved en anden mekanisme end den for godt undersøgt Tn5 og Tn10: de transponerer gennem kovalent lukkede cirkulære mellemprodukter og duplikerer ikke målstedet ved integration i DNA. Konjugativ overførsel sker også via et kovalent lukket overførselsmedium, i hvilken henseende de ligner plasmider . Imidlertid ligner deres udskæring og integration udskæring og integration af tempererede bakteriofager, og nogle af de kodede integraser viser sekvenslighed med medlemmer af lambda integrase-familien . De findes i både Gram-positive og Gram-negative bakterier. Hovedtyperne er beskrevet nedenfor.

6, 1 Tn916

Tn916 (18.5 kb) blev fundet i E. faecalis (Gram-positiv) såvel i Gram-negative arter som Neisseria og Kingella, og overførsel mellem disse arter er blevet påvist. Det bærer det samme Tcr-gen, tetM, som koder for en ribosombeskyttelsestype resistensprotein, som Tn5253 (60 kb), der findes i Streptococcus pneumoniae . Regionen, der er afgørende for overførsel af Tn916, er kortlagt og sekventeret . Ingen af de forudsagte produkter i denne region har signifikant sekvenslighed med køn pilus proteiner af konjugative plasmider og da antallet af gener er lille, dette overførselssystem kan være enklere end F eller RK2 og kan mangle en køn pilus. Et lille cis-virkende fragment, der kan mobilisere et ikke-overførbart plasmid, når et intakt transposon er til stede i trans, og bør derfor kode oriT, indeholdt fire sekvenser, der ligner enten RP4 eller f oriTs. En orf i overførselsregionen viste signifikant lighed med Mbee-mobiliseringsprotein af ColE1 . Således kan enkeltstrenget DNA overføres under konjugation.

overførsel af Tn916 stimuleres af tetracyclin 10-100 gange . Dette kan være det indirekte resultat af antibiotikainduceret stressrespons. Imidlertid kan stimulering af tetM-transkription med tetracyclin resultere i øget gennemlæsning af int og His, og dette kan resultere i øget transponeringsfrekvens. Et muligt regulerende gen, traA, er placeret mellem tetM og int/his . Det foreslås, at der er et lavt niveau af konstitutiv transkription fra promotoren opstrøms for traA, og at TraA er en transkriptionsaktivator, der opregulerer sin egen transkription og TN-transkription såvel som konjugationsgener. På denne måde kunne transponering og derfor indirekte overførsel være under dobbelt kontrol som observeret for overføringsgenerne af Ti-plasmider.

6.2 konjugative transposoner af Gram-negative anaerober

i Gram-negative anaerober, især Bacteroides, blev der fundet en gruppe transposoner, der var fuldstændig uafhængige af Tn916 . De er meget større: 65 kb til over 150 kb . Ligesom Tn916 har de et cirkulært overførselsmedium . De kan punktafgiftspligtige og mobilisere ikke-forbundne integrerede elementer (se Afsnit 6.4). De fleste af dem bærer en ribosombeskyttelsestype af Tcr – genettetk, og de har et kompliceret reguleringssystem, der registrerer tetracyclin og styrer overførselsfunktioner. To familier er kendt: Tcr Erl og TCR Emr 78539.

regionen af Bacteroides transposon TCR Emr DOT, som er nødvendig og tilstrækkelig til konjugal overførsel, er blevet lokaliseret til et 18-kb segment . OriT-regionen er midt i transposonen . Evnen til at mobilisere et plasmid i cis antyder, at efter at et nick er blevet introduceret ved oriT, transporteres en enkelt streng gennem parringsporen. OriT har ingen sekvens lighed med oriTs af konjugale E. coli plasmider eller enderne af T-DNA. Derudover lokaliseres generne, der koder for overførselsproteiner, mindst 3 kb væk fra oriT-regionen. Orf støder op til oriT koder for et regulerende protein RteC, som styrer ekspression af tra-generne.

kort eksponering af Bacteroides donor, der bærer Tcr Emr DOT til lave niveauer af tetracyclin stimulerer selvoverførsel med 10 000 gange . Denne stimulering skyldes sandsynligvis ikke stress forårsaget af tetracyclinhæmning af proteinsyntese, da den ikke-toksiske analoge chlortetracyclin også stimulerer overførsel. Tetracyclin stimulerer 20 gange transkription af operon indeholdende tetk og regulatoriske gener rteA og rteB (Fig. 6) . RteA har aminosyresekvens lighed med sensorproteinet i to komponentreguleringssystemer, men dets rolle i kontrol med overførsel er ikke etableret .

RteB har aminosyresekvens lighed med aktivatorproteinet i to komponentsystemer og kan derfor fungere med RteA. Det er vigtigt for overførsel og aktiverer rteC , et nedstrøms gen . Det ser ud til også at fungere som antirepressor for at imødegå effekten af en endnu uidentificeret repressor, som normalt forhindrer overførselsgener i at blive udtrykt : overførselsregionen af Tcr Em DOT, klonet i fravær af både rteABC og den formodede repressor, kan overføre konstitutivt. RteC er afgørende for selvoverførsel, men er ikke nødvendig for mobilisering af co-residente plasmider. Dette antyder, at RteC fungerer som en antirepressor til at kontrollere ekspression af afslapningsgener og/eller gener, der er essentielle for udskæring og cirkularisering af det konjugative transposon .

det forekommer usandsynligt, at dette komplekse tetracyclinrespons kan have udviklet sig i tiden siden den første kliniske anvendelse af dette antibiotikum. Tetracyclin produceret i naturen af actinomycetes er usandsynligt at bidrage til udviklingen af dette system, fordi de to organismer lever i forskellige nicher. En anden mulighed er, at tetracyclin ikke er den naturlige inducer, men ligner en plante phenolforbindelser, som er den virkelige inducer. Fordi Bacteroides kun konjugerer på faste overflader, kan sensing af tilstedeværelsen af planter signalere tilstedeværelsen af en passende overflade til parring .

6.3 første konjugative transposon i Enterobacteriaceae

CTnscr94 er en stor (kur 100 kb), konjugativ transposon i Enterobacteriaceae, som integreres på en RecA-uafhængig måde på to specifikke vedhæftningssteder i kromosomet af E. coli. Et af vedhæftningsstederne er blevet identificeret inden for pheV, det strukturelle gen for tRNAphe. Transposonen koder for en PTS-afhængig saccharosefermenteringsvej. Det ser ud til at være den første konjugative transposon identificeret i enteriske bakterier. Tidligere var der kun en rapport om en formodet konjugativ transposon, R391, fundet i Proteus rettgeri, men det er ikke veldokumenteret.

6.4 mobilisering af ikke-sammenkædede, integrerede DNA-segmenter af Bacteroides konjugative transposoner: NBU ‘er

NBU’ er, nonreplicating Bacteroides units (10-12 kb), er integrerede elementer, der deler høj homologi i en intern region, der indeholder mobiliseringsgener (mob) og oriT . Udskæring og cirkularisering af NBU ‘ er udløses af rteb leveret af konjugative transposoner . Ekspression af rteB induceres af lave niveauer af tetracyclin, således at tilstedeværelsen af en konjugativ transposon og eksponering for tetracyclin er nødvendig for udskæring og mobilisering af NBUs. NBUs koder kun for et enkelt mobiliseringsprotein, der er i stand til at binde til oriT, nicking og initiere overførsel af en enkelt strandet kopi gennem en parringspore leveret af det konjugative transposon . Nbu1-målstedet er placeret i 3 ‘ – enden af et tRNAleu-gen . Integrasegenet, intN1, af NBU1 udtrykkes konstitutivt. NBU cirkulære former mobiliseres også af IncP plasmider R751 og RK2 . De kan overføres fra Bacteroides til E. coli og ikke-specifikt integreret i E. coli-genomet .

6.5 konklusioner om konjugative transposoner

konjugative transposoner bidrager til spredning af antibiotikaresistensgener i klinisk vigtige bakterier som Bacteroides og Gram-positive cocci. Overførsel af mange af Bacteroides konjugative transposoner stimuleres af lave koncentrationer af antibiotika. Således vælger antibiotika ikke kun resistente stammer, men stimulerer også overførsel af resistensgener. Anvendelse af antibiotika ved subletal koncentration kan således have en større effekt på resident mikroflora end tidligere antaget.

7 andre systemer

en række andre systemer er bemærkelsesværdige af forskellige årsager, selvom der kun er få molekylære detaljer tilgængelige om kontrolmekanismer. Tommerplasmiderne er ret heterogene bestående af mindst fire undergrupper: IncHI1, IncHI2, IncHI3 og IncHII. Genetikken forstås bedst for inchi1 plasmid R27, hvilket er af interesse, fordi det har et temperaturoptimum på 26-30 liter C og kan give information, der er relevant for plasmider fra jord-og vandmiljøer, som generelt har meget lavere temperaturoptima end enteriske organismer .

overførselsregionen for IncI1-plasmidet R64 (122 kb plasmid fra S. typhimurium) er den hidtil største karakteriserede og dækker 54 kb. Regionen er ikke blot sammenhængende overførselsfunktioner, da der også er fundet stabile arvegener inden for segmentet . Det koder for to pilustyper såvel som hjælpefunktioner såsom primase. Den producerede tykke Pili er nødvendig under alle forhold, mens den tynde pili kun er nødvendig i flydende parringer, hvor parringspar er mere tilbøjelige til at falde fra hinanden på grund af bevægelse af donor og modtager. Baseret på den komplette sekvens af pil-regionen foreslås det, at den tynde pili hører til type IV-familien, som mere normalt er forbundet med binding af patogene bakterier til eukaryote celler . Der er flere versioner af pilV-genet, der koder for pilin for den tynde pilus. En usædvanlig kontrolmekanisme tillader sekventiel ekspression af forskellige pilV-gener . Betegnet shufflon, DNA-omlejringerne fremmes af en serie på syv 19-bp-gentagelser, som påvirkes af en stedsspecifik rekombinase af integrasefamilien . Inversionerne på disse steder tillader alle mulige kombinationer af de fire forskellige segmenter, hvoraf tre har to alternative C-termini kodet fra hver ende (A/A’, B/B’, C/C’). Det fjerde segment koder kun for en mulig C-terminal. De forskellige pilusproteiner tillader invasion af forskellige værtsarter, så disse omlejringer styrer overførslen til specifikke værter. R64 viser positiv regulering gennem to formodede polypeptider, TraB og TraC, som er nødvendige for ekspression af et antal overførselsassocierede funktioner, herunder genet for den tynde pilus og primasegenet . OriT-regionen består af oriT og to gener, nikA og nikB, som transkriberes fra en promotor i oriT-regionen og således autoreguleres af afslapningsomet samlet af NikA og NikB .

ligesom IncP-plasmiderne synes IncN-plasmiderne altid at være overførbare. De krævede gener er kodet i en 12-kb-region, der omfatter 14 tra-gener: 11 for Mpf, hvor sidstnævnte svarer til IncP trb-generne, Ti virB-generne og Bordetella ptl-generne . Overførsel færdigheder uden over-belaste værten opnås ved to repressor gener, korA og korB, som er en del af tra-regionen, som er organiseret som divergerende operoner fra et par tæt adskilte initiativtagere mellem korB-kikA operon og traL-korA-traCDNEOFG operon. Disse to promotorer er organiseret som back to back divergerende promotorer reguleret af et enkelt Kora/KorB-bindingssted. En tredje promotor, der står alene opstrøms for traN, reguleres også af et enkelt Kora / KorB-bindingssted. Der er således autogen regulering af generne til den konjugale parringspore. Ingen regulering observeres, medmindre begge gener er funktionelle, hvilket giver et middel til at koordinere begge operoner, men det vides ikke, om begge proteiner eller kun en binder til DNA. KorB ser ud til at bestå af en direkte duplikering af et polypeptid med lighed med HN-s-familien af histonlignende regulatoriske proteiner . Regulering af det relaterede system kodet af plasmider er ikke blevet undersøgt grundigt, men det er kendt, at Trva, et af de tre afslapningsproteiner, tilvejebringer et autogent kontrolkredsløb ved binding nær oriT, som også er placeringen for trvap. Trva viser sekvenslighed med TraJ-proteinet fra IncP-plasmider, men har et DNA-bindende motiv svarende til det for Bakkeproteinet fra F.

et antal små mobiliserbare plasmider forstærker også princippet om autogen kontrol af generne for afslapningsproteiner. Mob-regionen i det brede værtsområde incv plasmid RSF1010 er omfattet i en 1,8 kb-region og koder for tre proteiner, der er nødvendige for, at plasmidet kan udnytte IncP-overførselssystemet. Generne for MobA og MobB overlapper hinanden, mens MobC kodes forskelligt i den modsatte retning . Promotorerne for disse gener er tæt grupperet i oriT-regionen, to skyder mod mobAB og en mod mobC. Binding af afslapningsproteinerne til ellerdet forårsager autogen regulering. Mutanter i mobA N-terminal-regionen eller i mobC forårsager derepression. MobB-proteinet påvirker også andelen af plasmidet, der findes i afslapningsomet, og hvor lang tid plasmidet forbliver i denne tilstand og derfor er en determinant for overførselsfrekvens . 12,4 kb plasmid pTF-FC2 fra Thiobacillus ferrooksidans viser bemærkelsesværdige ligheder med Orit-regionen af IncP-plasmiderne, både hvad angår organiseringen af divergerende operoner transskriberet fra promotorer i oriT-regionen og også sekvenslighed af afslapningsproteinerne . Nylige data har bekræftet eksistensen af autogene kredsløb, der styrer mob-genekspression og demonstreret vigtigheden af værtsprotein IHF til bestemmelse af mobiliseringsfrekvens . På den anden side viser MBE-regionen ColE1, som meget ligner andre colicin-producerende plasmider, såsom ColK og ColA, ingen tegn på autoregulering . oriT kortlægger opstrøms for mbe-generne, adskilt fra det af rom-genet, og eksistensen af sådanne kredsløb ville således skabe en kompleks organisation.

8 konklusioner

ideen om, at overførselssystemer udviklede sig gennem samarbejde mellem to typer funktioner: DNA-nicking/replikationssystemer og cellefusions-systemer understøttes generelt af en undersøgelse af de eksempler, der er blevet undersøgt indtil videre. Hvor overførselsgener findes i små klynger snarere end en enkelt blok, har de klyngede gener generelt en fælles funktion. Et scenario med genrekruttering ved funktionel kassette kan overvejes, selvom genblokens oprindelige funktion ikke var at fremme konjugativ overførsel. IncI1-plasmidet synes at være et godt eksempel på dette, da der er separate blokke til Orit/afslapningsgener, såvel som de to typer pilus – den slags, der er nødvendig for at fremme cellefusion og den slags, der giver et middel til at trække bakterier sammen, når de flyder frit i planktonisk suspension.

en blok af gener, der klart blev erhvervet som en allerede samlet enhed, er mpf-funktionerne, der findes i IncP, Ti, IncN og Incv, men relateret til ptl-blokken af B. pertussis og CAG-genklyngen af Helicobacter pylori. Der har været nogle genomlejringer, der kan have regulatorisk eller funktionel betydning, for eksempel sammenstillingen af virB11-homologen til starten af operonen i IncP-plasmiderne og Ti-plasmid Tra-systemet. Regulering er blevet mærket på forsiden af denne region i IncP-plasmiderne gennem tilsætning af trbA samt erhvervelse af en KorB-reguleret promotor. I tilfælde af IncN-systemet er et af de to regulatoriske gener, korA, indlejret mellem de to første gener af operonen og findes ikke i beslægtede operoner. Rekruttering eller tab af regulatoriske gener kan forstås bedre, når et større antal relaterede systemer er blevet sekventeret.

det enkleste reguleringssystem, der findes, er autogen regulering, hvor gener inden for blokke af overførselsfunktioner lukker ekspressionen af generne, når overførselsapparatet er syntetiseret. Plasmider med sådanne systemer ser ud til at være konstant klar til overførsel, og de hidtil undersøgte systemer har tendens til at være ret brede i deres værtsområde. Måske giver den konstante tilgængelighed af nye værter plasmidet en grund til at være vedvarende klar til overførsel. Samlingen af sådanne autogene kredsløb er klart logisk i tilfælde af gener for afslapningsproteiner transkriberet fra promotorer i oriT-regionen, når disse proteiner samles for at danne afslapningsomet. Det er mindre klart, hvordan et autogent kredsløb, der styrer de mpf-gener, der kræves til pilus-samling, kan mærke, når et passende antal funktionelle pili er til stede.

det næste reguleringsniveau er det, der vises af F-lignende plasmider, hvor generne normalt er slukket. Chancen for, at generne tændes, er lille, så enten kræves en lang periode eller en stor population for at sikre udseendet af overføringsdygtige bakterier. Hvis en sådan bakterie møder en modtager, sker overførsel, og modtageren forbliver overførselskompetent i nogen tid. Dette tillader eksponentiel spredning gennem en ny population af plasmid-negative bakterier. Et sådant reguleringssystem kan være passende for bakterier, der lever i pattedyrs tarm, hvor bakterierne kun lejlighedsvis støder på store nye populationer af potentielle modtagere. Miljøet i tarmen kan være for rig med en lang række bakteriearter til at tillade signalering ved en vej svarende til den, der findes i Agrobacterium. Opretholdelsen af overførselens dygtige tilstand ved selve overførselsprocessen virker som en god måde at kontrollere overførselsgenekspression som reaktion på tilstedeværelsen af passende modtagere. En alternativ strategi for at opnå den samme ende er repræsenteret af de feromonresponsive plasmider, hvor potentielle modtagere producerer et feromon, der stimulerer produktionen af aggregeringsstof. Selve plasmidet lukker faktisk den interne produktion af feromonen, som den reagerer på, så den kun tænder overførselsgener, når der er passende modtagere til stede.

de andre undersøgte systemer viser en tæt integration af fænotype og overførselsfrekvens. Ti-plasmiderne reagerer både på potentielle modtagere, på donorpopulationstæthed og på næringsstoftilgængelighed. Overførsel af de konjugative transposoner stimuleres specifikt af de antibiotika, som de giver resistens over for. Når et reguleringssystem har udviklet sig til at håndtere for eksempel tilstedeværelsen af et forurenende stof eller et antibiotikum, vil gener, der forbinder aktiviteten af disse overførselsprocesser til miljøer, hvor generne er valgt, have en fordel, fordi de vil over replikere og sprede sig, når miljøet er rigtigt, men vil minimere deres virkning på deres vært, når de inducerende betingelser er fraværende.

den detaljerede viden, der nu akkumuleres, giver os mulighed for at forstå, hvilke faktorer der sandsynligvis vil stimulere eller begrænse plasmidspredning. Visse typer antibiotikabehandling kan fremme spredning af resistens til andre medlemmer af et blandet samfund og efterlade et potentielt problem for fremtiden, selvom den kortsigtede effekt er at reducere infektion. Udvikling af skærme til forbindelser, der resulterer i derepression af overførselsgener, kan føre til måder at gøre plasmidtransport til en ulempe. I nogle ekstreme tilfælde, for eksempel IncP-plasmiderne, har overskydende overførselsgenekspression vist sig at være dødelig, så sådanne midler kan have en dramatisk effekt på overlevelsen af plasmid-positive bakterier. De nuværende problemer med plasmidbårne træk kan føre til overvejelse af antibakterielle strategier, som ville have været diskonteret for mange år siden. Vi håber, at det materiale, der er omfattet af denne gennemgang, kan hjælpe med at udløse sådanne nye koncepter.

anerkendelser

M. å støttes af et projektstipendium fra velkomment tillid (046356/å). Andet arbejde med IncP-plasmider i forfatterens laboratorium er blevet støttet af det britiske medicinske Forskningsråd, velkomment tillid og BBSRC. Vi anerkender hjælp fra mange kolleger til levering af information og nyttige forslag.