Anvendelse af proteinfragmentkomplementeringsassays i cellebiologi

introduktion

biokemiske veje er virkelig systemer til dynamisk samling og demontering af proteinkomplekser, og derfor er meget af moderne biologisk forskning bekymret for, hvordan, hvornår og hvor proteiner interagerer med andre proteiner involveret i biokemiske processer. Efterspørgslen efter enkle tilgange til at studere protein-protein-interaktioner, især i stor skala, er vokset for nylig med fremskridtene i genomprojekter, da associering af ukendt med kendte genprodukter giver en afgørende måde at etablere et gens funktion på. Det var med denne udfordring i tankerne, at vores laboratorium udviklede protein-fragment complementation assays (PCAs). I denne strategi fusioneres to proteiner af interesse (proteiner A og B) til komplementære fragmenter af et reporterprotein (et ferment, fluorescerende protein osv.). Hvis proteinerne A og B interagerer, bringes reporterfragmenterne sammen, foldes ind i reporterens oprindelige struktur og rekonstituerer dens aktivitet (Figur 1). PCA-reporterproteiner er valgt som dem, der producerer en række påviselige aktiviteter, herunder fluorescerende, luminescerende og kolorimetriske signaler samt enkle overlevelsesvalgsanalyser (1-14). Vi har demonstreret, at PCA-strategien har følgende muligheder: (i) det tillader påvisning af protein-protein-interaktioner in vivo og in vitro i enhver celletype; (II) det tillader påvisning af protein-protein-interaktioner i passende subcellulære rum eller organeller; (iii) det tillader påvisning af interaktioner, der specifikt induceres som reaktion på udviklingsmæssige, ernæringsmæssige, miljømæssige eller hormoninducerede signaler; (iv) Det tillader overvågning af kinetiske og ligevægtsaspekter af proteinsamling i celler; og (v) det tillader screening for nye protein-protein-interaktioner i enhver celletype (2,3,6,9) (15-19).

princip

vi demonstrerede princippet om PCA startende med dihydrofolatreduktase (DHFR) som reporter (1). Det var indlysende, at hvis foldningen af dets fragmenter (som detekteret ved rekonstitution af aktivitet) var helt afhængig af bindingen af de interagerende proteiner, så er det beskrevne system faktisk en detektor af interaktionerne. Vi og andre har siden vist, at dette princip kan generaliseres til en række forskellige former, herunder Gaussia og renilla luciferaser, tem-Kurt-lactamase, samt grønt fluorescerende protein (GFP) og dets varianter (1-14). Et afgørende træk ved PCA-fragmenter er, at de er designet til ikke at folde spontant uden at blive bragt i nærheden af interaktionen mellem de proteiner, som de er smeltet sammen (1,20). Hvis spontan foldning opstod, ville PCA simpelthen ikke fungere. Spontan foldning ville føre til et falsk positivt signal, en situation, der håbløst ville forvirre fortolkningen af biblioteksskærme in vivo (forventes at være en vigtig applikation). I modsætning til PCA er der assaysystemer baseret på Kris-galactosidase og opdelte inteiner, der ligner PCA, men som er konceptuelt og praktisk forskellige (21,22). I begge tilfælde fusioneres velkendte naturligt forekommende og spontant associerende underenheder til interagerende proteiner. Det centrale problem her er, at underenheder, selvom de er svagt associerede, altid er i stand til at gøre det til en vis grad, hvilket betyder, at der er en konstant baggrund for spontan samling.

begrænsninger

PCA-strategien er generel i den forstand, at den ikke er begrænset til en enkelt reporter, og den er udtænkt i flere forskellige former, som hver især er bedst egnet til at løse et specifikt spørgsmål. For eksempel er enkle overlevelsesvalgs-PCA ‘er, såsom dem, der er baseret på DHFR, mest nyttige til valg af bibliotek, mens luminescens eller fluorescens udlæsning PCA’ er er bedst til studier af den rumlige og tidsmæssige dynamik i proteinkomplekser. Fordi fusionsproteinerne kan udtrykkes i celler, der er relevante modeller til undersøgelse af en specifik biokemisk vej, er de sandsynligvis i deres oprindelige biologiske tilstand inklusive de korrekte posttranslationelle modifikationer (naturligvis må PCA-fragmenterne ikke forstyrre målretning eller modifikation af proteinerne, og dette skal testes).

blandt de enkleste og derfor mest populære PCA ‘ er er dem, der er baseret på fluorescerende proteiner (såsom GFP og varianter), fordi signalet leveres af den iboende fluorofor (7-9)(14,15,17,23). Imidlertid skal fluorescerende proteiner udtrykkes ved høje niveauer for at sikre, at signalet er over baggrundscellulær fluorescens, og fluorescerende protein-PCA ‘ er har vist sig at være irreversible, hvilket kan være nyttigt (fangst og visualisering af sjældne komplekser), men kan også føre til fejlagtig fortolkning af omsætning eller lokalisering af interagerende proteiner (8,23,24). På den anden side er PCA ‘ er baseret på DHFR og Kris-lactamase som journalister blevet påvist, baseret på indirekte beviser, at være reversible efter forstyrrelse af interaktioner, mens en PCA baseret på gaussia luciferase har vist sig direkte at være reversibel (2,3,6). Reversibilitet af PCA muliggør således påvisning af kinetiske og ligevægtsaspekter af proteinkompleks samling og demontering i levende celler (figur 2).

standardkontroller til en PCA-undersøgelse

PCA-strategien kræver, at fragmenterne af reporterproteinet samles og foldes, efter at proteinerne af interesse har dannet et kompleks. Samlingen og den korrekte foldning af reporteren er afhængig af gendannelsen af både den strukturelle geometri, der er iboende for reporterproteinerne, og af det kompleks, der dannes af de interagerende proteiner. Dette er en af de største forskelle i PCA-analyserne sammenlignet med fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) eller bioluminescensresonansenergioverførsel (BRET) eller gær-to-hybridassays, og denne funktion tillod os at udføre en strukturbaseret undersøgelse af erythropoietin-receptoren (19). Vi indsætter typisk en 10-aminosyre fleksibel polypeptid linker bestående af (Gly.Gly.Gly.Gly.Ser)2 mellem proteinet af interesse og PCA-reporterfragmentet (for begge fusioner). Denne linker blev valgt, fordi den er den mest fleksible mulige, og vi har empirisk observeret, at linkere af denne længde er tilstrækkeligt lange til at tillade fragmenter at finde hinanden og folde, uanset størrelsen af de interagerende proteiner, hvortil fragmenterne er smeltet sammen (16).

for at sikre, at ikke-specifikke svar ikke forekommer, skal der udføres et sæt kontroller. Disse kontroller kan omfatte følgende, selvom den første er den vigtigste: (i) ikke-interagerende proteiner. Et PCA-respons bør ikke observeres, hvis ikke-interagerende proteiner anvendes som PCA-partnere; overekspression af et ikke-interagerende protein alene bør heller ikke konkurrere om den kendte interaktion. (II) partnerproteingrænseflademutationer. En punkt-eller sletningsmutation af en partner, der vides at forstyrre en interaktion, bør også forhindre et PCA-respons. iii) konkurrence. Et PCA-respons bør formindskes ved samtidig overekspression af det ene eller det andet af de interagerende proteiner, der ikke er smeltet sammen til et komplementært PCA-fragment. (iv) Fragmentbytte. En observeret interaktion mellem to proteiner bør forekomme, selvom proteinerne byttes med de respektive reporterfragmenter.

anvendelse af PCA i Proteindesign: Bibliotek vs. Biblioteksscreening for optimalt interagerende proteiner

blandt de første anvendelser af en PCA var et proteindesignproblem. DHFR PCA-analysen blev brugt i Escherichia coli til at screene to biblioteker med komplementært designede leucin lynlåsdannende sekvenser med 1010 potentielle interagerende par, hvoraf vi praktisk talt kunne dække 106. Vi demonstrerede, at PCA-skærmen er valgt til både optimal bindingsspecificitet, såvel som opløselighed og udtryk for interagerende lynlåse (18,25). Det vigtigste træk ved denne tilgang er, at det var muligt samtidig at screene to biblioteker mod hinanden, en proces, der ikke let opnås med sammenlignelige gær-to-hybridskærme. Enkelheden i denne tilgang og den specifikke karakter af de opnåede oplysninger om designstrategien antyder bred anvendelighed af DHFR PCA i proteindesign og rettede evolutionseksperimenter. Det viser også, at PCA supplerer fagvisningsstrategier, da hele udvælgelses -, optimerings-og strenghedstestene udføres in vivo, hvilket gør denne tilgang let udført.

anvendelse af PCA på cDNA-Biblioteksscreening i pattedyrceller

et første skridt i definitionen af funktionen af et nyt genprodukt er at bestemme dets interaktioner med andre genprodukter. Imidlertid er en rent proteininteraktionsbaseret screeningsmetode (såsom gær-to-hybrid) begrænset, fordi den kun fortæller dig, at to proteiner interagerer, mens de ikke giver andre oplysninger, der kan forbinde et protein med dets funktion. Derfor har vi vist, at PCA kan bruges i en cDNA-biblioteksscreeningsstrategi, der kombinerer en simpel cellebaseret proteininteraktionsskærm med specifikke funktionelle assays, der giver indledende validering af interaktionens biologiske relevans (9). Det første trin består i screening for fysiske interaktioner mellem AGN og et bibliotek med cDNA-kodede bytteproteiner ved at overvåge rekonstitutionen af PCA-reporteren i intakte levende celler. Et vigtigt træk ved dette første trin er, at interaktioner kan detekteres direkte og mellem proteiner i fuld længde i celler, hvor agnproteinet normalt fungerer, hvilket sikrer, at nødvendig subcellulær målretning, posttranslationelle modifikationer og interaktioner med andre proteiner kan forekomme. For eksperimentel gyldighed skal PCA-fragmenterne naturligvis demonstreres for ikke at forstyrre målretning eller modifikation af proteinerne. I det andet trin kan proteininteraktionen valideres funktionelt som følger: for det første skal proteininteraktionen, detekteret af PCA, forstyrres af midler, såsom hormoner eller specifikke hæmmere, der vides at modulere den specifikke biokemiske vej, hvor proteinerne deltager. Vi har demonstreret dette for DHFR PCA og brugt denne egenskab til at kortlægge signalveje i levende pattedyrceller (16). For det andet kan den subcellulære lokalisering af proteininteraktionen, igen detekteret af PCA, ændres af midler, der modulerer vejen. Således kombinerer den PCA-baserede screeningsstrategi et simpelt screeningstrin med direkte funktionelle analyser. Vi og andre har anvendt denne strategi til identifikation af nye substrater eller regulatorer af serin/threonin proteinkinase, PKB/Akt (9,15,26,27).

brug af PCA som molekylær Lineal: Receptorundersøgelser

et særligt træk ved PCA-strategier er, at hvis vi kender den tredimensionelle struktur af reporteren, er det muligt nøjagtigt at forudsige, hvor tæt sammen fragmenterne skal være for at sikre, at fragmenterne foldes korrekt og har en målbar aktivitet. Denne kendsgerning blev sat i gang for at teste en strukturel allosterisk model til aktivering af den dimeriske erythropoietinreceptor (EpoR) ved hjælp af DHFR PCA, og fremgangsmåden kunne udvides til at studere allosteriske overgange i dimeriske eller multimeriske proteingrænseflader (19). I EpoR-sagen viste det sig, at receptordimertransmembrandomænerne var adskilt med 73 liter, som observeret i krystalstrukturen af uligeret EpoR. Det blev begrundet, at hvis denne inaktive tilstand eksisterede på membranen i en levende celle, ville DHFR-fragmenter smeltet sammen med C-termini af transmembrane domæner kun foldes, hvis en ligand inducerede en konformationsændring, der gør det muligt for fragmenterne at komme tæt nok sammen til at sikre, at den nøjagtige tredimensionelle struktur af DHFR kunne dannes (19,28). Dette ville kræve, at fragmenternes n-termini er 8 liter fra hinanden. Indsættelse af fleksible linkerpeptider mellem transmembrandomænet og DHFR-fragmenterne gjorde det muligt for os at undersøge afstanden mellem indsættelsespunkterne for den ekstracellulære domænedimer og bekræfte, at der var behov for linkere, der var lange nok til at spænde over 73 liter, for at DHFR kunne foldes fra dets fragmenter.

kortlægning af biokemiske netværk

cellulære biokemiske maskiner til metabolisme, signaleringskaskader og cellecyklus er eksempler på dynamisk samling og demontering af makromolekylære komplekser. Disse defineres ved at gruppere interagerende proteiner i henhold til deres lignende reaktioner på et sæt forstyrrelser (hormoner, metabolitter, f.eks.). Protein-protein-interaktioner kan bruges til at forbinde et protein med ukendt funktion til proteiner, der vides at være involveret i en kendt biokemisk proces. Vi har vist, at farmakologisk profilering (overvågning af effekter af vejspecifikke lægemidler og proteinhormoner på protein-protein-interaktioner) og bestemmelse af den cellulære placering af protein-protein-interaktioner kan opnås ved hjælp af PCAs (9)(15-17)(26). Analyse af disse resultater giver mulighed for en repræsentation af, hvordan biokemiske netværk udvikler sig i tid og rum og som reaktion på specifikke stimuli. Som et principbevis rapporterede vi anvendelsen af denne strategi til kortlægning af en signaltransduktionsvej medieret af receptortyrosinkinaser (RTKs) (16). De farmakologiske profiler og den cellulære placering af interaktioner, vi observerede, tillod os at placere hvert genprodukt på det relevante punkt i stierne (figur 3). Fra resultaterne af vores Analyse fremkom et kort over organisationen af RTK-netværket, der var i overensstemmelse med eksisterende modeller, men som også omfattede flere nye interaktioner. Evnen til at overvåge et netværk af proteininteraktioner i levende celler indeholdende alle komponenterne i den underliggende undersøgte vej afslørede skjulte forbindelser, ikke observeret før, på trods af intens kontrol af dette netværk. De præsenterede resultater viser, at PCA-strategien har de funktioner, der er nødvendige for en generel genfunktionsvalidering og vejkortlægningsstrategi. En nylig anvendelse af et større sæt PCAs muliggjorde udvikling af en generel tilgang til at forbinde lægemidlers handlinger på specifikke signalveje og til at opdage uforudsete aktiviteter af lægemidler (17).

konklusion

udviklingen og anvendelsen af PCA er stadig i gang. For eksempel ud over de begrænsede, men informative, sæt applikationer, der er beskrevet her, anvendes strategien til storskala screening af hele genomer. Mere sofistikerede problemer med proteindesign og proteinfoldning undersøges, herunder undersøgelser af de faktorer, der styrer udvælgelsen af sekvenser for optimale interaktioner mellem proteiner, proteiner og nukleinsyrer og proteiner og små organiske molekyler. PCA er en meget generel og fleksibel eksperimentel tilgang, og derfor bør vi forvente at se et stigende antal nye anvendelser af dette grundlæggende værktøj til molekylær og cellebiologi i den nærmeste fremtid.