세포 생물학

소개

생화학 적 경로는 실제로 단백질 복합체를 동적으로 조립하고 분해하는 시스템이므로 현대 생물학 연구의 대부분은 단백질이 생화학 적 과정에 관여하는 다른 단백질과 어떻게,언제,어디서 상호 작용하는지에 관한 것입니다. 단백질-단백질 상호 작용을 연구 하는 간단한 접근에 대 한 수요,특히 대규모,게놈 프로젝트의 진행으로 최근 성장 했습니다.,이후 알려진된 유전자 제품과 알 수 없는 연결 유전자의 기능을 설정 하는 하나의 중요 한 방법을 제공 합니다. 이 문제를 염두에두고 우리 실험실은 단백질 조각 보완 분석법을 개발했습니다. 이 전략에서 관심있는 두 단백질(단백질 ㅏ 과 비)리포터 단백질(효소,형광 단백질 등)의 상보적인 단편에 융합됩니다.). 단백질 ㅏ 과 비 상호 작용하면 리포터 조각을 함께 가져 와서 리포터의 기본 구조로 접어 활동을 재구성합니다(그림 1). 단순 생존 선택 분석 실험(1-14)뿐만 아니라 형광,발광,및 비색 신호를 포함 하 여 검출 가능한 활동의 다양 한 생산으로 선택 되었습니다. (나)생체 조건 및 모든 세포 유형에서 체 외에서 단백질-단백질 상호 작용의 탐지를 수 있습니다; (2)적절 한 세포 하 구획 또는 세포 소기관에서 단백질-단백질 상호 작용의 검출을 허용 한다;(3)그것은 특히 발달,영양,환경,또는 호르몬 유도 신호;에 대 한 응답에서 유도 되는 상호 작용의 검출을 허용 한다(4)그것은 세포;단백질 어셈블리의 운동 및 평형 측면의 모니터링을 허용 하 고(5)그것은 어떤 세포 유형(2,3,6,9)(15-19)에서 새로운 단백질-단백질 상호 작용에 대 한 심사 수 있습니다.

이 원리들은 효소 디하이드로폴레이트 환원효소(디하이드로폴레이트 환원효소)를 리포터(1)로 시작하는 원리들을 입증하였다. 그 단편에서 효소의 폴딩(활동의 재구성에 의해 검출 된)이 상호 작용하는 단백질의 결합에 절대적으로 의존한다면,설명 된 시스템은 실제로 상호 작용의 검출기라는 것이 분명했습니다. 우리와 다른 사람들은 그 이후이 원리가 가우시아 및 레닐라 루시페라제,템-락타 마제,녹색 형광 단백질 및 그 변이체(1-14)를 포함한 여러 효소로 일반화 될 수 있음을 입증했습니다. 단편의 중요한 특징은 그들이 융합되는 단백질(1,20)의 상호 작용에 의해 근접하게하지 않고 자발적으로 접히지 않도록 설계된다는 것이다. 자연 접힘이 발생했다면,단순히 작동하지 않을 것입니다. 자발적인 접힘은 가양성 신호로 이어질 것입니다.이 상황은 생체 내 라이브러리 화면의 해석을 절망적으로 혼란스럽게합니다(중요한 응용 프로그램이 될 것으로 예상). 2012 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 15 일 두 경우 모두 잘 알려진 자연적으로 발생하고 자발적으로 연관되는 효소의 하위 단위가 상호 작용하는 단백질에 융합됩니다. 여기서 핵심 문제는 하위 단위가 약하게 연관 되더라도 항상 어느 정도 그렇게 할 수 있다는 것입니다.

제한

PCA 전략은 일반적인 의미에서 그것은 제한되지 않는 단일 효소 기자,그리고 고안되었습에서 여러 다른 형태는 각각의 가장 적합한 특정 요구를 해결하기 위해 질문입니다. 예를 들어,발광 또는 형광 판독 회충병 단백질 복합체의 공간 및 시간 역학의 연구에 대 한 최고의 하는 동안 간단한 생존 선택 회충병,그 기반과 같은 라이브러리 선택에 대 한 가장 유용 합니다. 융합 단백질은 특정 생화학 적 경로를 연구하기위한 관련 모델 세포에서 표현 될 수 있기 때문에,그들은 올바른 변형 후 수정을 포함하여 자신의 고유 한 생물학적 상태에있을 가능성이 높습니다(분명히 세포 분열 자체는 단백질의 표적화 또는 변형을 방해하지 않아야하며,이 테스트해야합니다).

가장 간단하고 따라서 가장 인기있는 형광 단백질 중 하나는 형광 단백질(예:형광 단백질 및 변형)을 기반으로 한 것입니다. 그러나,형광 단백질 신호 배경 세포 형광,위에 보장 하기 위해 높은 수준에서 표현 해야 합니다 및 형광 단백질 다당류는 유용할 수 있는(트래핑 및 희귀 복합체 시각화)돌이킬 수 없는 입증 되었습니다 하지만 또한 회전율 또는 상호 작용 단백질(8,23,24)의 현지화의 오해로 이어질 수 있습니다. 가우시아 루시퍼라아제에 기초한 가역적(2,3,6)이 직접적으로 나타났다. 따라서 살아있는 세포에서 단백질 복합체 조립 및 분해의 운동 및 평형 측면을 검출 할 수 있습니다(그림 2).

연구

연구 전략 보고자 단백질의 단편을 조립 하 고 관심의 단백질 복잡 한 형성 후 접어 필요 합니다. 조립 및 리포터의 올바른 접는 리포터 단백질 및 상호 작용 단백질에 의해 형성 된 복잡 한 본질적인 구조 형상의 복구에 따라 달라 집니다. 이것은 형광 공명 에너지 전달(프렛)또는 생물 발광 공명 에너지 전달(브렛)또는 효 모 2 하이브리드 분석 실험과 비교 하 여 분석 실험의 주요 차이점 중 하나 이며,이 기능은 우리가 에리스로포이에틴 수용 체(19)의 구조 기반 연구를 수행할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 10 아미노산 유연한 폴리펩티드 링커 구성(.글리글리글리Ser)2 사이의 단백질의 관심과 PCA 기자 조각(모두에 대한 융합). 이 링커는 가능한 가장 유연하기 때문에 선택되었으며,이 길이의 링커는 조각이 융합되는 상호 작용하는 단백질의 크기에 관계없이 조각이 서로를 찾고 접을 수 있도록 충분히 길다는 것을 경험적으로 관찰했습니다(16).

비특이적 응답이 발생하지 않도록 하려면 일련의 컨트롤을 수행해야 합니다. 첫 번째가 가장 중요하지만 이러한 컨트롤은 다음을 포함 할 수있다:(나는)비 상호 작용하는 단백질. 상호 작용하지 않는 단백질이 상호 작용하지 않는 단백질이 상호 작용하지 않는 단백질을 파트너로 사용하는 경우; 도 아니다 혼자 비 상호 작용 단백질의 과발현 알려진 상호 작용을 위해 경쟁한다. (2)파트너 단백질 계면 돌연변이. 상호 작용을 방해하는 것으로 알려진 파트너의 포인트 또는 삭제 변이도도 방지해야 합니다. (3)경쟁. PCA 응답해야 합 감소에 의해 동시 overexpression 하나 또는 기타의 단백질의 상호 작용하지 않는 융합을 보완 PCA 조각입니다. (4)조각 교환. 두 단백질 사이의 관찰 된 상호 작용은 단백질이 각각의 리포터 조각과 교환 되더라도 발생해야합니다.

단백질 디자인에 대 한 응용 프로그램:라이브러리 대 최적으로 상호 작용 하는 단백질에 대 한 라이브러리 심사

첫 번째 응용 프로그램 중 단백질 디자인 문제 이었다. 1010 잠재적인 상호 작용 쌍,우리는 실질적으로 106 커버 수 있는 보완 설계 된 류 신 지퍼 형성 시퀀스의 두 라이브러리를 화면 대장균에 사용 되었다. 우리는 최적의 바인딩 특이성 뿐만 아니라 용해도 및 상호 작용 지퍼(18,25)의 식에 대 한 선택 하는 것이 좋습니다. 이 방법의 가장 중요 한 기능은 동시에 서로 대 한 두 개의 라이브러리,비교 효 모 2 하이브리드 화면 쉽게 달성 하지 프로세스를 화면 가능 했다. 이 접근 방식의 단순성과 설계 전략에 대해 얻은 정보의 특정 특성은 단백질 설계 및 지시 된 진화 실험의 광범위한 유틸리티를 제안합니다. 또한 전체 선택,최적화 및 엄격한 테스트가 생체 내에서 수행되어이 접근 방식을 쉽게 실행할 수 있기 때문에 파지 디스플레이 전략을 보완한다는 것을 보여줍니다.새로운 유전자 산물의 기능을 정의하는 첫 번째 단계는 다른 유전자 산물과의 상호 작용을 결정하는 것이다. 그러나 순전히 단백질 상호 작용 기반 스크리닝 접근법(예:효모 2 하이브리드)은 단백질을 기능에 연결할 수있는 다른 정보를 제공하지 않으면 서 두 단백질이 상호 작용한다는 것을 알려주기 때문에 제한됩니다. 따라서,우리는 간단한 셀 기반 단백질 상호 작용 화면 상호 작용(9)의 생물 학적 관련성의 초기 검증을 제공 하는 특정 기능 분석 실험을 결합 하는 전략을 선별 하는 라이브러리에서 사용할 수 있는 것으로 나타났습니다. 첫 번째 단계는 그대로 살아있는 세포에서 미끼를 기자의 재구성을 모니터링 하 여 미끼와 유전자 인코딩된 먹이 단백질의 라이브러리 사이의 물리적 상호 작용에 대 한 심사 구성 됩니다. 이 첫 번째 단계의 중요한 특징은 상호 작용이 미끼 단백질이 정상적으로 기능하는 세포의 전체 길이 단백질 사이에서 직접 검출 될 수 있으므로 필요한 세포 하 표적화,전이 후 변형 및 다른 단백질과의 상호 작용이 발생할 수 있다는 것입니다. 물론,실험적 타당성에 대 한 표적화 또는 단백질의 수정을 방해 하지 입증 해야 합니다. 두 번째 단계에서 단백질 상호 작용은 다음과 같이 기능적으로 검증 될 수 있습니다: 첫째,단백질 상호 작용,단백질 참여 하는 특정 생 화 확 적인 경로 조절 알려져 있는 호르몬 또는 특정 억제제 등 에이전트에 의해 교란 해야 합니다. 이 속성을 사용 하 여 살아있는 포유류 세포(16)에서 신호 경로 매핑. 둘째,단백질 상호 작용의 세포 하 지역화,다시 검출,경로 변조 하는 에이전트에 의해 변경 될 수 있습니다. 따라서,검열 전략 기반 검열 전략 직접 기능 분석 실험과 간단한 검열 단계를 결합 합니다. 우리와 다른 새로운 기질 또는 세린/트레오닌 단백질 키 나 제의 규제의 식별에이 전략을 적용 했습니다.

분자 통치자로 사용 하 여:수용 체 연구

우리 리포터 효소의 3 차원 구조를 알고 있다면,그것은 정확 하 게 얼마나 가까운 단편은 효소가 정확 하 게 접히고 측정 가능한 활동을 보장 해야 합니다 예측할 수 있습니다. 이 방법은 이량체 또는 다량체 단백질 계면에서 알로 스테 릭 전이를 연구하는 것으로 확장 될 수 있습니다(19). 에포르의 경우,수용체 이량 체 막 횡단 도메인은 73 에 의해 분리 된 것으로 나타 났으며,이는 에포르의 결정 구조에서 관찰되었다. 이 비활성 상태가 살아있는 세포의 막에 존재한다면,막 횡단 영역의 테르 미니에 융합 된 단편은 리간드가 단편들이 충분히 가까이 오도록 허용하는 형태 변화를 유도 할 때만 접힐 것이라고 추론되었다. 이 필요로 하는 N termini 조각의 것 8Å 다. 막 횡단 도메인과 세포 외 도메인 이량 체의 삽입 지점 사이의 거리를 조사 하 고 링커 73 에 걸쳐 충분히 긴 확인 수 있도록 유연한 링커 펩 티 드의 삽입의 단편에서 폴드에 대 한 필요 했다.

매핑 생화학 네트워크

대사,신호 캐스케이드 및 세포주기를위한 세포 생화학 기계는 거대 분자 복합체를 동적으로 조립 및 분해하는 예입니다. 이들은 일련의 섭동(호르몬,대사 산물,효소 억제제 등)에 대한 유사한 반응에 따라 상호 작용하는 단백질을 그룹화하여 정의됩니다.). 단백질-단백질 상호 작용은 알려진 생화학 적 과정에 관여하는 것으로 알려진 단백질에 알 수없는 기능의 단백질을 연결하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 약리 프로 파일링(경로 특정 약물 및 단백질 호르몬 단백질-단백질 상호 작용에 대 한 모니터링 효과)와 단백질-단백질 상호 작용의 세포 위치를 결정 하 여 달성 될 수 있다 입증 했다(9)(15-17)(26). 이러한 결과의 분석 시간 및 공간 및 특정 자극에 대 한 응답에서 어떻게 생 화 확 적인 네트워크의 표현에 대 한 수 있습니다. 원리의 증거로,우리는 수용 체 티로신 키 나 제(16)에 의해 중재 신호 전달 경로 매핑에이 전략의 응용 프로그램을 보고 했다. 우리가 관찰 한 약리학 적 프로파일과 상호 작용의 세포 위치는 각 유전자 생성물을 경로의 관련 지점에 배치 할 수있게 해주었습니다(그림 3). 우리의 분석 결과에서 기존 모델,일치 했다 하지만 그 또한 여러 소설 상호 작용을 포함 하는 네트워크 조직의 지도 등장. 연구 기본 통로의 모든 구성 요소를 포함 하는 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용의 네트워크를 모니터링 하는 기능 숨겨진된 연결,이 네트워크의 강렬한 감시에도 불구 하 고 전에 관찰 하지 공개. 제시 하는 결과 보험 전략 일반 유전자 기능 유효성 검사 및 경로 매핑 전략에 필요한 기능을 보여 줍니다. 최근 더 큰 세트의 응용 프로그램은 특정 신호 경로에 대한 약물의 작용을 연결하고 약물의 예기치 않은 활동을 감지하는 일반적인 접근 방식을 개발할 수있었습니다(17).

결론

아직 개발 및 응용이 진행 중이다. 예를 들어,제한 된,하지만 정보,여기에 설명 된 응용 프로그램의 집합 뿐만 아니라 전략 전체 게놈의 대규모 심사에 적용 되 고 있다. 단백질 디자인 및 단백질 접힘의 더 정교한 문제 단백질,단백질 및 핵 산,단백질 및 작은 유기 분자 사이의 최적의 상호 작용에 대 한 시퀀스의 선택을 제어 하는 요인의 연구를 포함 하 여 탐구 되 고 있다. 따라서 우리는 가까운 장래에 분자 및 세포 생물학이 기본 도구의 새로운 응용 프로그램의 증가를 볼 것으로 예상한다.