A fehérje-fragmentum komplementációs vizsgálatok alkalmazása a sejtbiológiában

Bevezetés

a biokémiai útvonalak valójában a fehérje komplexek dinamikus összeszerelésének és szétszerelésének rendszerei, ezért a modern biológiai kutatások nagy része azzal foglalkozik, hogy a fehérjék hogyan, mikor és hol lépnek kölcsönhatásba a biokémiai folyamatokban részt vevő más fehérjékkel. A fehérje-fehérje kölcsönhatások tanulmányozásának egyszerű megközelítései iránti igény, különösen nagy léptékben, a közelmúltban nőtt a genomprojektek előrehaladásával, mivel az ismeretlen társítása ismert géntermékekkel az egyik kulcsfontosságú módszer a gén funkciójának megállapítására. Ezt a kihívást szem előtt tartva fejlesztette ki laboratóriumunk fehérje-fragmentum komplementációs vizsgálatokat (PCAs). Ebben a stratégiában két érdekes fehérje (a és B fehérjék) fuzionálódik egy riporter fehérje komplementer fragmenseivel (enzim, fluoreszcens fehérje stb.). Ha az A és B fehérjék kölcsönhatásba lépnek, a riporter fragmensei összeállnak, a riporter natív struktúrájába hajtogatódnak, és helyreállítják annak aktivitását (1.ábra). A PCA reporter fehérjéket úgy választották ki, mint amelyek különféle kimutatható tevékenységeket termelnek, beleértve a fluoreszcens, lumineszcens és kolorimetrikus jeleket, valamint az egyszerű túlélési szelekciós vizsgálatokat (1-14). Bizonyítottuk, hogy a PCA stratégia a következő képességekkel rendelkezik: (i) lehetővé teszi a fehérje-fehérje kölcsönhatások kimutatását in vivo és in vitro bármilyen sejttípusban; (ii) lehetővé teszi a fehérje-fehérje kölcsönhatások kimutatását a megfelelő szubcelluláris rekeszekben vagy organellákban; (iii) lehetővé teszi az olyan kölcsönhatások kimutatását, amelyek kifejezetten a fejlődési, táplálkozási, környezeti vagy hormon által indukált jelekre reagálnak; (iv) lehetővé teszi a sejtekben a fehérje-összeállítás kinetikai és egyensúlyi aspektusainak nyomon követését; és (v) lehetővé teszi az új fehérje-fehérje kölcsönhatások szűrését bármilyen sejttípusban (2,3,6,9) (15-19).

elv

bemutattuk a PCA elvét, kezdve a dihidrofolát-reduktáz enzimmel (DHFR), mint riporter (1). Nyilvánvaló volt, hogy ha az enzimnek a fragmenseiből történő hajtogatása (amint azt az aktivitás feloldásával detektáltuk) teljesen függ a kölcsönhatásban lévő fehérjék összekapcsolódásától, akkor a leírt rendszer valójában a kölcsönhatások detektora. Mi és mások azóta bebizonyítottuk, hogy ez az elv számos enzimre általánosítható, beleértve a Gaussia és a Renilla luciferázokat, a TEM-laktamázt, valamint a zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) és annak variánsait (1-14). A PCA-fragmensek döntő jellemzője, hogy úgy vannak kialakítva, hogy ne hajtódjanak spontán módon anélkül, hogy a fehérjék kölcsönhatása közvetlen közelségbe hozná őket (1,20). Ha spontán hajtogatás történt, a PCA egyszerűen nem fog működni. A spontán hajtogatás hamis pozitív jelhez vezetne, olyan helyzethez, amely reménytelenül megzavarja a könyvtári képernyők in vivo értelmezését (várhatóan fontos alkalmazás). A PCA-val ellentétben léteznek olyan, a PCA-hoz hasonló, de fogalmilag és gyakorlatilag eltérő (21,22), DG-galaktozidázon és split inteineken alapuló vizsgálati rendszerek. Mindkét esetben az enzimek jól ismert, természetesen előforduló és spontán asszociáló alegységei egymással kölcsönhatásban lévő fehérjékhez kapcsolódnak. A központi probléma itt az, hogy az alegységek, még ha gyengén is társulnak, mindig képesek erre bizonyos mértékig, ami azt jelenti, hogy a spontán összeszerelés állandó háttere van.

korlátozások

a PCA stratégia általános abban az értelemben, hogy nem korlátozódik egyetlen enzimriporterre, és több különböző formában dolgozták ki, amelyek mindegyike a legalkalmasabb egy adott kérdés kezelésére. Például az egyszerű túlélési szelekciós PCA-k, például a DHFR-en alapuló PCA-k a leghasznosabbak a könyvtári kiválasztáshoz, míg a lumineszcencia vagy fluoreszcencia leolvasás PCA-k a legjobbak a fehérje komplexek térbeli és időbeli dinamikájának tanulmányozásához. Mivel a fúziós fehérjék olyan sejtekben expresszálódhatnak, amelyek releváns modellek egy adott biokémiai út tanulmányozásához, valószínűleg natív biológiai állapotukban vannak, beleértve a helyes poszttranszlációs módosításokat is (nyilvánvalóan maguk a PCA-fragmensek nem zavarhatják a fehérjék célzását vagy módosítását, és ezt meg kell vizsgálni).

a legegyszerűbb és ezért legnépszerűbb PCA-k közé tartoznak a fluoreszcens fehérjék (például GFP és variánsok), mivel a jelet a belső fluorofor (7-9)(14,15,17,23) biztosítja. A fluoreszcens fehérjéket azonban magas szinten kell expresszálni annak biztosítása érdekében, hogy a jel a háttér sejtes fluoreszcencia felett legyen, és a fluoreszcens protein PCA-k irreverzibilisnek bizonyultak, ami hasznos lehet (ritka komplexek csapdába ejtése és vizualizálása), de a forgalom félreértelmezéséhez vagy a kölcsönható fehérjék lokalizációjához is vezethet (8,23,24). Másfelől a DHFR-en és a Ca-n alapuló PCAs-ok, mint riporterek, közvetett bizonyítékok alapján reverzibilisnek bizonyultak az interakciók megszakadása után, míg a Gaussia luciferázon alapuló PCA-k közvetlenül reverzibilisnek bizonyultak (2,3,6). A PCA reverzibilitása tehát lehetővé teszi a fehérje komplex összeszerelésének és szétszerelésének kinetikai és egyensúlyi aspektusainak kimutatását az élő sejtekben (2.ábra).

Standard kontrollok egy PCA vizsgálathoz

a PCA stratégia megköveteli, hogy a riporter fehérje fragmensei összegyűljenek és összehajtódjanak, miután a kérdéses fehérjék komplexet képeztek. A riporter összeszerelése és helyes hajtogatása függ mind a riporter fehérjéire jellemző szerkezeti geometria, mind a kölcsönhatásban lévő fehérjék által alkotott komplex visszanyerésétől. Ez a PCA-vizsgálatok egyik fő megkülönböztetése a fluoreszcens rezonancia energiaátvitelhez (FRET) vagy a biolumineszcencia rezonancia energiaátvitelhez (BRET) vagy az élesztő két hibrid vizsgálatokhoz képest, és ez a tulajdonság lehetővé tette számunkra, hogy az eritropoetin receptor szerkezetalapú vizsgálatát végezzük (19). Jellemzően egy 10 aminosavból álló rugalmas polipeptid-linkert helyezünk be, amely a következőkből áll: (Gly.Gly.Gly.Gly.Ser) 2 az érdekes fehérje és a PCA riporter fragmentum között (mindkét fúzió esetében). Ezt a linkert azért választottuk, mert ez a lehető legrugalmasabb, és empirikusan megfigyeltük, hogy az ilyen hosszúságú linkerek elég hosszúak ahhoz, hogy a fragmensek megtalálják egymást és összehajoljanak, függetlenül a kölcsönhatásban lévő fehérjék méretétől, amelyekhez a fragmensek összeolvadnak (16).

annak biztosítása érdekében, hogy a nem specifikus válaszok ne forduljanak elő, egy sor ellenőrzést kell végrehajtani. Ezek a kontrollok a következőket foglalhatják magukban, bár az első a legfontosabb: (i) nem kölcsönhatásba lépő fehérjék. PCA-választ nem szabad megfigyelni, ha nem kölcsönhatásba lépő fehérjéket használnak PCA-partnerként; a nem kölcsönhatásban lévő fehérje túlzott expressziója önmagában nem versenyezhet az ismert kölcsönhatásért. (ii) Partner fehérje interfész mutációk. A partner pont-vagy deléciós mutációjának, amelyről ismert, hogy megzavarja az interakciót, szintén meg kell akadályoznia a PCA-választ. (iii) verseny. A PCA-választ csökkenteni kell az egyik vagy a másik kölcsönhatásban lévő fehérje egyidejű túlexpressziójával, amely nem fuzionálódik egy komplementer PCA-fragmenshez. (iv) fragmentum csere. Két fehérje között megfigyelt kölcsönhatásnak akkor is meg kell történnie, ha a fehérjéket kicserélik a megfelelő riporter fragmensekkel.

a PCA alkalmazása a Fehérjetervezésben: Könyvtár vs.az optimálisan kölcsönhatásba lépő fehérjék könyvtári szűrése

a PCA első alkalmazásai között szerepelt egy fehérje tervezési probléma. A DHFR PCA assay-t Escherichia coli-ban használták a komplementer tervezésű leucin cipzárképző szekvenciák két könyvtárának szűrésére 1010 potenciális kölcsönhatásban lévő párral, amelyek közül gyakorlatilag 106-ot tudtunk lefedni. Megmutattuk, hogy a PCA képernyő mind az optimális kötési specificitás, mind az oldhatóság és a kölcsönhatásban lévő cipzárak expressziója szempontjából kiválasztott (18,25). Ennek a megközelítésnek a legfontosabb jellemzője, hogy két könyvtárat egyszerre lehetett egymás ellen szűrni, ezt a folyamatot összehasonlítható élesztő két hibrid képernyőkkel nem lehet könnyen elérni. Ennek a megközelítésnek az egyszerűsége és a tervezési stratégiáról kapott információk sajátos jellege arra utal, hogy a DHFR PCA széles körben alkalmazható a fehérje tervezésében és az irányított evolúciós kísérletekben. Azt is mutatja, hogy a PCA kiegészíti a fágmegjelenítési stratégiákat, mivel a teljes kiválasztási, optimalizálási és szigorúsági teszteket in vivo végzik, így ez a megközelítés könnyen végrehajtható.

a PCA alkalmazása cDNS könyvtári szűrésre emlős sejtekben

az új géntermék funkciójának meghatározásának első lépése annak meghatározása kölcsönhatások más géntermékekkel. A tisztán fehérje interakción alapuló szűrési megközelítés (például élesztő két hibrid) azonban korlátozott, mert csak azt mondja, hogy két fehérje kölcsönhatásba lép, miközben nem nyújt más információt, amely összekapcsolhatja a fehérjét a funkciójával. Ezért megmutattuk, hogy a PCA használható egy cDNS könyvtár szűrési stratégiában, amely egyesíti az egyszerű sejtalapú fehérje interakciós képernyőt specifikus funkcionális vizsgálatokkal, amelyek biztosítják az interakció biológiai relevanciájának kezdeti validálását (9). Az első lépés a csali és a cDNS-kódolt zsákmányfehérjék könyvtárának fizikai kölcsönhatásainak szűrése, a PCA riporter ép élő sejtekben történő helyreállításának nyomon követésével. Ennek az első lépésnek az a fontos jellemzője, hogy a kölcsönhatások közvetlenül kimutathatók a teljes hosszúságú fehérjék között azokban a sejtekben, amelyekben a csali fehérje normálisan működik, ezáltal biztosítva a szükséges szubcelluláris célzást, poszttranszlációs módosításokat és kölcsönhatásokat más fehérjékkel. Nyilvánvaló, hogy a kísérleti érvényesség érdekében bizonyítani kell, hogy a PCA fragmensek nem zavarják a fehérjék célzását vagy módosítását. A második lépésben a fehérje kölcsönhatása funkcionálisan validálható, az alábbiak szerint: először is, a PCA által detektált fehérje kölcsönhatást olyan szerekkel, például hormonokkal vagy specifikus inhibitorokkal kell megzavarni, amelyekről ismert, hogy modulálják azt a specifikus biokémiai utat, amelyben a fehérjék részt vesznek. Ezt bizonyítottuk a DHFR PCA esetében, és ezt a tulajdonságot használtuk az élő emlőssejtek jelátviteli útvonalainak feltérképezésére (16). Másodszor, a fehérje interakció szubcelluláris lokalizációja, amelyet ismét a PCA detektál, megváltoztathatók az utat moduláló szerek. Így a PCA-alapú szűrési stratégia ötvözi az egyszerű szűrési lépést a közvetlen funkcionális vizsgálatokkal. Mi és mások ezt a stratégiát alkalmazták a szerin/treonin protein kináz, PKB/Akt (9,15,26,27) új szubsztrátjainak vagy szabályozóinak azonosítására.

a PCA használata molekuláris Vonalzóként: Receptor vizsgálatok

a PCA stratégiák különlegessége, hogy ha ismerjük a riporter enzim háromdimenziós szerkezetét, akkor pontosan meg lehet jósolni, milyen közel kell lennie a fragmentumoknak ahhoz, hogy biztosítsuk, hogy az enzim megfelelően hajtogatódik és mérhető aktivitással rendelkezik. Ezt a tényt a dimer eritropoietin receptor (EpoR) DHFR PCA alkalmazásával történő aktiválásának strukturális alloszterikus modelljének tesztelésére alkalmazták, és a megközelítés kiterjeszthető az alloszterikus átmenetek tanulmányozására dimer vagy multimer fehérje interfészekben (19). Az EpoR esetében kimutatták, hogy a receptor dimer transzmembrán doméneket 73-mal választják el egymástól 6db, amint azt a nem kötött EpoR kristályszerkezetében megfigyelték. Úgy érveltek, hogy ha ez az inaktív állapot létezik egy élő sejt membránján, akkor a transzmembrán domének C végéhez fuzionált DHFR fragmensek csak akkor hajtódnak össze, ha egy ligandum olyan konformációs változást indukál, amely lehetővé teszi a fragmensek elég közel kerülését ahhoz, hogy biztosítsák a DHFR pontos háromdimenziós szerkezetének kialakulását (19,28). Ez megkövetelné, hogy a töredékek N végpontjai egymástól 8 fő legyen. A transzmembrán domén és a DHFR fragmensek közötti rugalmas linker peptidek behelyezése lehetővé tette számunkra, hogy megvizsgáljuk az extracelluláris domén dimer beillesztési pontjai közötti távolságot, és megerősítsük, hogy a DHFR-nek a töredékeiből való összehajtásához elég hosszú Linker-ekre volt szükség ahhoz, hogy a 73.

biokémiai hálózatok feltérképezése

az anyagcsere, a jelátviteli kaszkádok és a sejtciklus sejt biokémiai gépei példák a makromolekuláris komplexek dinamikus összeszerelésére és szétszerelésére. Ezeket úgy definiáljuk, hogy a kölcsönhatásban lévő fehérjéket csoportosítjuk a perturbációk (hormonok, metabolitok, enzimgátlók stb.). A fehérje-fehérje kölcsönhatások felhasználhatók egy ismeretlen funkciójú fehérje összekapcsolására olyan fehérjékkel, amelyekről ismert, hogy részt vesznek egy ismert biokémiai folyamatban. Kimutattuk, hogy a farmakológiai profilalkotás (Az útvonal-specifikus gyógyszerek és a fehérje hormonok fehérje-fehérje kölcsönhatásokra gyakorolt hatásainak monitorozása), valamint a fehérje-fehérje kölcsönhatások celluláris helyének meghatározása PCAs segítségével érhető el(9)(15-17)(26). Ezen eredmények elemzése lehetővé teszi annak ábrázolását, hogy a biokémiai hálózatok hogyan fejlődnek időben és térben, valamint a specifikus ingerekre adott válaszként. Elvi bizonyítékként beszámoltunk ennek a stratégiának az alkalmazásáról a receptor tirozin-kinázok (RTKs) által közvetített jelátviteli út feltérképezésére (16). A megfigyelt kölcsönhatások farmakológiai profilja és celluláris elhelyezkedése lehetővé tette számunkra, hogy az egyes géntermékeket az útvonalak releváns pontjára helyezzük (3.ábra). Elemzésünk eredményeiből kiderült az RTK hálózat szervezésének térképe, amely összhangban volt a meglévő modellekkel, de számos új interakciót is tartalmazott. Az a képesség, hogy megfigyeljük a fehérje kölcsönhatások hálózatát az élő sejtekben, amelyek tartalmazzák az alapul szolgáló útvonal összes összetevőjét, rejtett kapcsolatokat tártak fel, amelyeket korábban nem figyeltek meg, annak ellenére, hogy ezt a hálózatot intenzíven megvizsgálták. A bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a PCA stratégia rendelkezik az Általános génfunkciók validálásához és az útvonal feltérképezéséhez szükséges jellemzőkkel. A PCA-k szélesebb körének közelmúltbeli alkalmazása lehetővé tette egy olyan általános megközelítés kidolgozását, amely összekapcsolja a kábítószerek hatását a specifikus jelátviteli útvonalakon, és felderíti a kábítószerek előre nem látható tevékenységeit (17).

következtetés

a PCA fejlesztése és alkalmazása még folyamatban van. Például, az itt leírt korlátozott, bár informatív alkalmazáskészletek mellett, a stratégiát teljes genomok nagyszabású szűrésére alkalmazzák. A fehérje tervezésének és a fehérje hajtogatásának kifinomultabb problémáit vizsgálják, beleértve azokat a tényezőket is, amelyek szabályozzák a fehérjék, fehérjék és nukleinsavak, valamint a fehérjék és a kis szerves molekulák közötti optimális kölcsönhatások szekvenciáinak kiválasztását. A PCA egy nagyon általános és rugalmas kísérleti megközelítés, ezért arra kell számítanunk, hogy a közeljövőben egyre több új alkalmazást fogunk látni ennek az alapvető eszköznek a molekuláris és sejtbiológiában.