Genetické a Molekulární Definice Doplnění Skupiny D v MHC II. Třídy Nedostatek
- Abstrakt
- Úvod
- Výsledky
- Klasifikace pacientů do doplnění skupiny
- Korekce HLA II. třídy výraz transfekci s RFXAP cDNA
- Mutace RFXAP genu u pacientů se SS, AkO, ShA a ShG
- MHC II. třídy, DMB a Ii řetězce genové exprese v doplnění skupiny D
- Diskuse
- materiály a metody
- pacienti
- buněčná kultura
- Imunofluorescence
- Somatických doplnění analýzy
- Transfections
- PCR amplifikace a sekvenování RFXAP
- RT-PCR detekce HLA II. třídy, DMB, Ii a GADPH genovou expresi
- Zkratky
- Poděkování
Abstrakt
Čtyři doplnění skupin, A, B, C a D, byly popsány u buněčných linií vadné v koordinaci exprese MHC třída II geny. Patří sem buněčné linie vytvořené od pacientů postižených deficitem MHC třídy II a experimentálně generované mutantní buněčné linie. Skupina D, na rozdíl od ostatních skupin, byla po dlouhou dobu reprezentována pouze mutantní buněčnou linií 6.1.6. Gen zodpovědný za defekt v této skupině, RFXAP, byl nedávno klonován a bylo zjištěno, že je mutován v buněčné linii 6.1.6 a U tří pacientů. Zde uvádíme fúzní experimenty u několika nových pacientů s deficitem HLA třídy II, dokončení klasifikace většiny známých pacientů do čtyř komplementačních skupin. Pacienti z pěti nepříbuzných rodin byly klasifikovány v doplnění skupiny D, zatímco devět dalších spadají do doplnění skupin a a B. Žádný z pacientů nedefinoval novou komplementační skupinu. Úplná korekce exprese MHC třídy II byla získána v buňkách od pacientů patřících do skupiny D transfekcí RFXAP cDNA. Bylo zjištěno, že kódující oblast RFXAP byla mutována u všech pacientů. Bylo zjištěno, že mutace se opakují, protože v osmi dosud hlášených nesouvisejících rodinách byly nalezeny pouze tři různé mutace.
Úvod
exprese antigenu MHC třídy II je přísně kontrolována způsobem specifickým pro buňky (1) a je nezbytná pro imunitní odpovědi specifické pro antigen (2). Mechanismy, které řídí transkripci genů MHC třídy II, byly rozsáhle studovány, zejména pomocí buněk s nedostatkem exprese HLA třídy II. Tyto buňky jsou buď experimentálně generované mutanty, nebo buňky od pacientů postižených nedostatkem MHC třídy II (3). Tato primární imunodeficience vyplývající z defektní exprese antigenů třídy hla II je autozomálně recesivní porucha charakterizovaná extrémní náchylností k infekcím a nepřítomností buněčných a humorálních T-buněčných odpovědí po rozpoznání antigenu (4). Buňky od pacientů netranskribují geny α a β MHC třídy II kódující izotypy DR, DQ a DP HLA (3,5). Intrafamilial segregace analýza ukázala, že genetická abnormalita je lokalizována mimo MHC regionu a zahrnuje trans-působící regulační faktor(y) (5). V experimentech somatické fúze byly použity jak pacientovy buněčné linie, tak experimentální mutantní buněčné linie k vyhodnocení počtu transkripčních faktorů, které byly naprosto nezbytné k zajištění normální exprese MHC třídy II. Byly identifikovány čtyři komplementační skupiny, A, B, C A D (6,7).
geny odpovědné za vady ve skupinách a a C byly klonovány o doplnění klonování v RJ 2.5.5 buněčné linie (skupina A) a SJO buněčné linie (skupina C), resp. Gen CIITA kóduje protein nevázající DNA, který řídí jak konstitutivní, tak indukovatelnou expresi HLA třídy II a je mutován u pacientů skupiny a (8). Gen RFX5 kóduje 75 kDa podjednotku komplexu RFX a je mutován u pacientů z komplementační skupiny C (9). Třetí Gen, RFXAP (pro protein spojený s RFX), byl nedávno klonován Durandem a kol. (10). RFXAP kóduje malý 36 kDa podjednotky RFX složité, a mutace genu jsou odpovědné za vady v doplnění skupiny D. RFX5 a RFXAP proteiny tvoří, spolu s třetí bílkovin 41 kDa, multimeric komplexní RFX, který se váže na X box regionu MHC třídy II organizací (11). Je možné, že gen kódující tento třetí protein je mutován v komplementační skupině B, ve které dosud nebyl identifikován postižený gen. Vázání RFX komplexu na DNA závisí na kooperativní vazba s nejméně dvěma pleiotropní faktory, NFY a X2BP (12-14), ale není dostatečné pro třídu II transkripce. CIITA se musí spojit s RFX a jiné transkripční faktory, které se váží na X2 a Y boxy pořadatel umožní transkripci MHC třída II geny.
zde popisujeme, somatické doplnění analýzy o 13 nových HLA II. třídy nedostatek pacientů a dva již dříve hlášené u pacientů se SS (15) a ABI (16), podezření, že představují různé doplnění skupin. Jedním z nových pacientů, bylo zjištěno, že patří do skupiny a a sedmi dalšími do skupiny B. Nicméně, čtyři nové pacienty spadl do stejné doplnění skupiny jako pacienti SS a ABI. Druhé skupině bylo zjištěno, že představují skupinu D o doplnění analýzy, transfekce s RFXAP cDNA a mutace analýza RFXAP gen.
HLA-DR exprese na povrchu heterokaryons získané mezi buňkami ze skupin D a B (a a b) nebo D a S (c a d), 48 h po fusion. a) A b) vykazují heterokaryony B-buněk, ZM×ABL; (c) A (d) vykazují fibroblastové heterokaryony, ZM×HVM, indukované (d) nebo ne (c) IFN-γ. V písmenech b), c) A d) byly buňky obarveny monoklonální protilátkou bu-27 třídy II.
HLA-DR exprese na povrchu heterokaryons získané mezi buňkami ze skupin D a B (a a b) nebo D a S (c a d), 48 h po fusion. (a) A (b) vykazují heterokaryony B-buněk, ZM×ABL; (c) A (d) vykazují heterokaryony fibroblastů, ZM×HVM, indukované (d) nebo ne (c) IFN-γ. V písmenech b), c) A d) byly buňky obarveny monoklonální protilátkou bu-27 třídy II.
Výsledky
Klasifikace pacientů do doplnění skupiny
Somatických buněk fúzní experimenty byly provedeny buď pomocí B buňky nebo fibroblasty představující doplnění skupin A, B, C a D. Obě B buňky a fibroblasty byly k dispozici pouze pro pacienta ZM. Obrázek 1 ukazuje příklad exprese HLA získané v heterokaryonech obou B buněk a fibroblastů. Ve fibroblastových heterokaryonech bylo 48 hodin po léčbě interferonem-γ (IFN-γ) detekováno 3-10% hla-pozitivních buněk třídy II. V heterokaryonech B-buněk nebylo možné detekovat více než 5% pozitivních buněk HLA třídy II. Obrázek 2 shrnuje údaje získané somatické buňky fúzí, a Tabulka 2 udává klasifikaci nově studovaných pacientů s ohledem na dříve publikované údaje (6,7). Jeden pacient Pákistánského původu byl zařazen do skupiny A, sedm pacientů byly umístěny ve skupině B a pět byly zařazeny do skupiny D. Žádný z pacientů patřilo do skupiny C.
Somatické buněčné fúze analýzy
Somatické buněčné fúze analýzy
Doplnění skupin
Doplnění skupin
Jak ukazuje Tabulka 1, fibroblasty ze čtyř pacientů, ZM, AkO, ShA a ShG, doplněné buňky představující doplnění skupin a a B, ale ne doplnit SS buněčné linie fibroblastů, které nebyly zařazeny (15). Zm B buňky doplňovaly B buňky ze skupin A, B A C, ale nedoplňovaly hla třídu II-negativní 6.1.6 B buněčnou linii definující skupinu D. po fúzi mezi fibroblasty zm, AkO, Sha a ShG nebyla získána žádná komplementace. Kromě toho žádná z těchto buněčných linií fibroblastů, včetně ZM, nebyla doplněna buněčnou linií ABI (16). Buňky od pacientů SS, AkO, ShA, ShG ABI a ZM tedy patří do komplementační skupiny D.
Korekce HLA II. třídy výraz transfekci s RFXAP cDNA
Jak již bylo dříve oznámeno, v přechodné transfekci experimenty s RFXAP cDNA, korekce MHC II. třídy vyjádření bylo získáno v ZM a ABI fibroblastů (17). Obrázek 2 znázorňuje úplnou korekci konstitutivní exprese genu HLA třídy II v buňkách od pacienta zm, jediný pacient, pro kterého byla k dispozici linie B-buněk, po transfekci s RFXAP cDNA. Naproti tomu transfekce cDNA CIITA nebo RFX5 neobnovila expresi HLA třídy II; ani transfekce s prázdným vektorem. Podobné výsledky byly získány pro expresi MHC třídy II indukovanou IFN-γ u fibroblastů od pacientů AkO, SS a ShA (údaje nejsou uvedeny).
Mutace RFXAP genu u pacientů se SS, AkO, ShA a ShG
Full-délka RFXAP cDNAs byly amplifikovány pomocí PCR u pacientů se SS, AkO, ShA a ShG, jak je popsáno (10), subcloned ve vektoru pGEM a sekvenovány. U všech čtyř pacientů byly identifikovány mutace v RFXAP cDNA. Tyto mutace byly poté potvrzeny přímým sekvenováním genomických PCR produktů od pacientů a jejich rodičů.
v rodině SS, se dvěma postiženými dětmi, byla nalezena homozygotní delece G v nukleotidu 484 (484delG) (obr. 3). Stejná mutace byla zjištěna v rodině ZM (17). Výsledný posun snímků vede k zastavovacímu kodonu mimo rámec na nukleotidu 525. Bylo zjištěno, že rodiče jsou pro tuto mutaci heterozygotní.
korekce exprese membránové HLA třídy II transfekcí RFXAP cDNA. Sedm (vlevo), nebo dvacet dva (vpravo) dní po transfekci s pREP4-RFXAP (p36) nebo pREP4 (vv) plasmidy, ZM (skupina D) a Kh (skupina A) buňky byly léčeni IFN-γ, barevného 48 h později pro HLA II. třídy projevu a analyzovány pomocí průtokové cytometrie (FACScan).
korekce exprese membránové HLA třídy II transfekcí RFXAP cDNA. Sedm (vlevo), nebo dvacet dva (vpravo) dní po transfekci s pREP4-RFXAP (p36) nebo pREP4 (vv) plasmidy, ZM (skupina D) a Kh (skupina A) buňky byly léčeni IFN-γ, barevného 48 h později pro HLA II. třídy projevu a analyzovány pomocí průtokové cytometrie (FACScan).
V rodině AkO, náhrada glutaminu kodonu podle stop kodonu (CAG→TAG) na pozici 279 RFXAP gen byl detekován (C279X) (Obr. 4). Předpokládá se, že tato mutace povede ke zkrácenému proteinu 52 aminokyselin. Stejná mutace byla již dříve zjištěna u pacienta ABI (17). Rodiče AkO jsou pro tuto mutaci heterozygotní.
V rodině Sh, s dvěma postižených prvního stupně bratranci ShA a ShG, vložení sedmi nukleotidů ‘GCGGGCG na pozici 151 RFXAP cDNA byla nalezena. Tato mutace je označena jako 151ins7. Představuje duplikaci sekvence divokého typu zahrnující nukleotidy 144-150. To vede k posunu rámce, což má za následek stop kodon na nukleotidu 329. Oba pacienti z této rodiny zdědili tuto homozygotní mutaci (obr. 5). Rodiče obou pacientů byli heterozygotní (údaje nebyly zobrazeny).
mutační analýza RFXAP u pacienta SS. PCR produkty od pacienta a rodičů byly sekvenovány.
mutační analýza RFXAP u pacienta SS. PCR produkty od pacienta a rodičů byly sekvenovány.
mutační analýza RFXAP u pacienta AkO. PCR produkty od pacienta a rodičů byly sekvenovány.
mutační analýza RFXAP u pacienta AkO. PCR produkty od pacienta a rodičů byly sekvenovány.
Mutační analýza RFXAP u pacientů ShA a ShG. PCR produkty od obou pacientů byly sekvenovány.
Mutační analýza RFXAP u pacientů ShA a ShG. PCR produkty od obou pacientů byly sekvenovány.
MHC II. třídy, DMB a Ii řetězce genové exprese v doplnění skupiny D
Od zbytkové vyjádření DRA a DPB geny byly hlášeny v buňkách od pacientů ABI (16), MHC class II genové exprese byla zkoumána ve skupině D pacientů pomocí RT-PCR. Variabilní úroveň transkripce byla pozorována u genů DPA a / nebo DPB u čtyř pacientů, ale ne u kontrolního pacienta ze skupiny a (obr. 6). Avšak ani v buňkách ShG pacienta, ve kterých byly detekovány transkripty DPA i DPB, nebyla detekovatelná membránová exprese komplexu DPaß (obr. 7). V žádné z buněčných linií pacientů nebyly detekovány hla DR, DQ, DMB nebo II řetězcový gen mRNA RT-PCR (obr. 6).
exprese genů MHC třídy II, DMA, Ii a GADPH. Radioaktivní RT-PCR byla provedena pomocí RNA z pacientů indukovaných IFN-γ a kontrolních fibroblastů. V poslední lane (KhA), RNA byl použit připravený z buněk pacienta klasifikovány v doplnění skupiny a.
Exprese MHC II. třídy, DMA, Ii a GADPH geny. Radioaktivní RT-PCR byla provedena pomocí RNA z pacientů indukovaných IFN-γ a kontrolních fibroblastů. V poslední lane (KhA), RNA byl použit připravený z buněk pacienta klasifikovány v doplnění skupiny a.
Diskuse
i Přes rostoucí počet pacientů zkoumal a pleiotropní faktory se ukázaly být zapojen do řízení MHC třídy II projevu, počet doplnění skupin, a proto faktory, zmutoval v MHC třídy II imunodeficience pacientů, zůstává na čtyři (Tabulka 2). S 13 nových HLA II. třída-u pacientů s nedostatkem studovaných v této práci, většina hlášených pacientů byly nyní zařazeny do doplnění skupiny a nikdo definuje páté doplnění skupiny. Celkem 39 pacientů ze 34 rodin, tam jsou 6 v doplnění skupiny A, 22 ve skupině B, 3 ve skupině C a 8 ve skupině D. Dva bratři s částečným defektem MHC třídy II projevu a s mírnou formou imunodeficitu v poslední době byly klasifikovány v další doplnění skupiny (18). Tito atypičtí pacienti pravděpodobně představují další syndrom, protože jsou schopni reagovat na očkování (19).
Mezi imunodeficitními pacienty zařazené v této zprávě, pouze rodina Kh, s dvěma postiženého sourozence, patří do skupiny a. Zatímco dříve popsané skupiny pacientů byly španělského původu (15), tyto nové případy byly Pákistánského původu, což ukazuje, že CIITA mutace nejsou omezeny na jednoho etnického původu. Sedm nových pacientů spadá do skupiny B a jsou severoafrického, italského, tureckého a saúdskoarabského původu. Celkem, včetně BLS1 zakladatel pacienta, tam jsou 22 rodin ve skupině B.
HLA-DR a HLA-DP výraz na povrchu fibroblastů z kontroly a pacienti ShG ShA a léčeni po dobu 48 h s IFN-γ. Buňky byly obarveny anti-DR 112 a anti-DP 227 Mab.
HLA-DR a HLA-DP výraz na povrchu fibroblastů z kontroly a pacienti ShG ShA a léčeni po dobu 48 h s IFN-γ. Buňky byly obarveny anti-DR 112 a anti-DP 227 Mab.
čtyři noví pacienti ve třech rodinách spolu s pacientem SS (15) spadají do skupiny D.jsou severoafrického, tureckého a drúzského původu. Jejich klinické a biologické vlastnosti se nelišily od ostatních pacientů s deficitem HLA. Ve všech kromě jednoho však mohla být detekována transkripce genů DPA a/nebo DPB. Reziduální transkripce DPA a DPB byla také hlášena u pacienta ABI (16). U pacientů zkoumán v této práci, a to navzdory přítomnosti DP přepisy, zralý DPa-β heterodimers nebyly zjištěny na povrchu buněk, snad proto, Ii a DM geny nejsou vyjádřeny. Z této netěsnosti v defektu tedy nelze očekávat žádné funkční důsledky, jak je skutečně pozorováno in vivo.
Tři různé linie důkazů prokázat, že tito pacienti patří na doplnění skupiny D, tj. somatické buněčné fúze analýzy, transfekce pacientů buňky s RFXAP cDNA a mutační analýzy. Jednoznačné výsledky buněčné fúze byly získány použitím fibroblastů i B-buněčných linií, jak bylo prokázáno pro ZM pacienta. Absence doplnění mezi ZM buněk a 6.1.6 B buněčné linie, na jedné straně, a mezi ZM a SS fibroblastů, na druhou, potvrzen všechny ostatní syntézy dat, včetně těch z ABI fibroblastů. Předchozí nesprávného zařazení pacienta do skupiny ” E ” (16) bylo pravděpodobně způsobeno leakiness z 6.1.6 buněčné linie používané a/nebo fúzních experimentů provádí přes buněčné linie (B-fibroblastů buněčné fúze). Kompletní oprava HLA II. třídy exprese v buňkách ze skupiny D, a ne z jiných skupin, o transfekce RFXAP cDNA potvrdil dříve oznámené údaje z přechodné transfekci experimenty (10,17). Bylo zjištěno, že RFXAP cDNA byla mutována u pacientů SS, AKO, Sh a ShG, jak bylo také dříve prokázáno pro ZM a ABI (17).
byly nalezeny tři typy rekurentních mutací RFXAP, tj. substituce, delece a vložení (obr. 8). Velmi vysoký obsah CG v genu RFXAP vedoucí k polymerázovým chybám by mohl představovat generování těchto mutací (20). Na C279X přechod detekován u pacienta AKO je shodná s mutací dříve zjištěných pacientů ABI (17) a 484delG mutace u pacienta SS je totožný se detekována u pacientů DA a ZM (10,17). V obou případech mutace se předpokládá vést k posunovými a k syntéze silně redukované proteiny 52 a 136 aminokyselin, resp. V sh cousins byla nalezena dříve Neobjevená mutace, tj. vložení duplikovaných nukleotidů 144-150: “GCGGGGC”. Výsledkem této mutace je také posun snímků a zkrácený produkt. Všechny mutace byly detekovány v oblasti zahrnující nukleotidy 116-540 RFXAP cDNA, které odpovídají jedinému exonu.
Schematické znázornění RFXAP genu, což naznačuje, tři mutace nalezené u pacientů od šesti nesouvisející skupiny D rodiny.
Schematické znázornění RFXAP genu, což naznačuje, tři mutace nalezené u pacientů od šesti nesouvisející skupiny D rodiny.
proto byly dosud pozorovány pouze tři různé mutace genu RFXAP v šesti různých rodinách, včetně pacienta DA (10). Etnický původ rodin by mohl naznačovat rodový původ těchto mutací, protože pacienti SS, RA a ZM jsou severoafrického původu, zatímco pacienti AKO a ABI jsou tureckého původu. Je však pozoruhodné, že pouze ve skupině D deficitu MHC třídy II byly dosud detekovány takové opakující se mutace. Například ve skupině a, navzdory vysoké prevalenci pacientů španělského původu (15), nebyla zjištěna žádná rekurentní alela mezi různými pacienty (8 A B. Lisowska-Grospierre et al., publikovaný). Ve všech komplementačních skupinách, většina pacientů pochází z oblasti Mediterrenean, kde jsou časté sňatky.
Proč RFXAP genové mutace, pravděpodobně následek nefunkční proteiny, jsou spojeny s reziduální DPA/B genové transkripce, není zřejmé. Toto pozorování poskytuje důkaz pro omezenou, ale významnou dyskoordinovanou regulaci transkripce genu MHC třídy II. Tyto výsledky vyžadují další studium k určení domnělé specifické role RFXAP v transkripci dra/B, DQA/B versus DPA / B.
materiály a metody
pacienti
bylo studováno třináct dosud nepopsaných pacientů z jedenácti nesouvisejících rodin postižených imunodeficiencí MHC třídy II. Jedenáct rodin bylo pokrevních. Byli severoafrického (tři), italského (dva), tureckého (tři), drúzského (dva), pákistánského (dva) a saúdskoarabského (jeden) původu. U všech pacientů byly antigeny třídy hla II Nedetekovatelné na buněčném povrchu B buněk, monocytů a aktivovaných T buněk. Klinický projev ve všech byl charakterizován opakujícími se infekcemi, závažným průjmem a selháním prospívání. Absence humorálních a buněčných odpovědí specifických pro antigen byla pozorována u všech a hypogamaglobulin-aemie u několika pacientů. V této zprávě jsou hlášeny podrobné studie o buňkách pacientů, AkO, ShA, ShG, ZM. Pro ZM byly dříve prezentovány částečné výsledky (17). Pacient SS již byl popsán (15). Charakteristiky ABI pacienta, zahrnuté do experimentů somatické komplementace, již byly hlášeny (16).
buněčná kultura
B-buněčné linie byly vytvořeny z B buněk pacientů infekcí virem Epstein-Barrové (EBV). Kožní fibroblasty pacientů byly získány kožní biopsií a transformovány SV40, jak bylo popsáno výše (15). Všechny buněčné linie byly pěstovány při 37°C v 5% CO2 v RPMI-1640 (Gibco BRL Lifesciences) doplněny 20% tepelně inaktivované fetální telecí sérum. Fibroblasty nebo jejich heterokaryony byly ošetřeny IFN-γ (200 IU/ml) po dobu 40 hodin před analýzou exprese MHC třídy II.
Imunofluorescence
Anti-HLA-DR protilátek 20.6 (21), anti-třída II Bu27 (The Binding Site, Birmingham, UK) a anti-třída protilátek W6/32 (ServaLab) byly použity. B buňky byly barveny v suspenzi, zatímco fibroblasty byly fixovány ethanolem před inkubací s protilátkami, jak je popsáno (15). Buněčné suspenze byly analyzovány Cytofluorografem Becktona Dickinsona a fixované buňky mikroskopem Leitz Ortoplan.
Somatických doplnění analýzy
Fibroblastů a B-buněčné linie z nově zřízeného pacientů, stejně jako experimentální buněčné linie (HVJ, ABL, SJO a 6.1.6.) od pacientů dříve zařazených do komplementačních skupin A, B, C A D byly v těchto experimentech použity. Buněčná linie 6.1.6 byla geneticky vybraná plně negativní varianta MHC třídy II, laskavě poskytnutá C. Alcaide (Institut Pasteur). Kromě toho byly zahrnuty fúzní experimenty: pacient SS buněčná linie, představující domnělou komplementační skupinu X (15), a pacient Abi buněčná linie, údajně reprezentující skupinu E (16), laskavě poskytl P.van den Elsen. Přechodné heterokaryony obou buněčných typů, B buněk a fibroblastů byly získány metodou elektrofúze popsanou podrobně dříve (15). Fenotypová reverze byla testována imunofluorescencí nebo northern blot 48-72 h po buněčné fúzi. V případě fibroblastů byly buňky kultivovány v přítomnosti nebo nepřítomnosti 200 IU / ml rekombinantního IFN-γ (Genex).
Transfections
plasmidy použité k transfekci byly pREP4 (Invitrogen), pREP4-RFXAP a EBO-Sfi (prázdný vektor) nebo EBO-CIITA, laskavě poskytl V Steimle (8). Transfections B-buněčných linií a fibroblastů byly provedeny, jak je popsáno (22) s 1-10 µg každého plasmidu pomocí JOUAN GTH 128/A electropulser, jak je popsáno (15). Stabilní transfektanty byly generovány selekcí hygromycinem B (250 µg / ml; Calbiochem). Transfekované fibroblasty byly před testováním exprese MHC třídy II ošetřeny 200 IU/ml IFN-γ.
PCR amplifikace a sekvenování RFXAP
Full-délka RFXAP cDNA klonů z pacientů byly izolovány pomocí RT-PCR a subcloned do pGEM-T vector (Promega), podle standardních postupů, a stanovení mutací. Mutace pak byly potvrzeny v DNA pacientů a jejich rodičů o studium PCR amplifikované genomové DNA fragmentů zahrnující nukleotidy 116-540, jak je popsáno (17). PCR byla provedena s expand High Fidelity PCR systémem (Boeh-ringer Mannheim), jak je popsáno (10). Sekvenování rekombinantních plazmidů bylo provedeno pomocí Abi PRISM dye terminator cycle sequencing kit (ABI) a aplikovaného sekvenceru dna Biosystems. Genomické PCR produkty byly cyklus sekvence přímo pomocí značeného sekvenční primery a Termo-Sequenase kit (Amersham) a analyzovány na sekvenování gel.
RT-PCR detekce HLA II. třídy, DMB, Ii a GADPH genovou expresi
Celkem cytoplazmatické RNA byla extrahována z IFN-γ indukované fibroblastů, které guanidium thiokyanatanu metoda (23). First strand cDNA byla syntetizována s ptačí myeloblastózy, virus (AMV) reverzní transkriptázy (Boehringer Manneheim, SA) pomocí 10 ng oligo(dT) primer a 5 µg cytoplazmatické RNA. PCR amplifikace byla provedena v konečném objemu 50 µl pomocí 1/30 z cDNA, 1 µM každého primeru, 200 µM každého d NTP, 1.25 IU polymerázy AmpliTaq (Perkin-Elmer, Foster City, CA) a 0,1 µCi dCTP (Amersham) v každém vzorku. DNA byla denaturována při 94°C po dobu 1 min, žíhaný po dobu 1 min při 55°C pro detekci všech genů s výjimkou GADPH a alternativního řešení sporů, pro které je 58°C, teplota žíhání byla použita. Prodloužení při 72°C bylo na 1 min. Tento cyklus byl opakován 25x pro GADPH a alternativního řešení sporů, a 27 krát, pro ostatní geny, následuje 10 min elongace při 72°C. Vzorky byly electrophoresed na 5% akrylamidu gely při 150 V po dobu 2 h. Gely byly opraveny a sušené před expozicí v PhosphorImager pole (Molecular Dynamics) nebo X-Omat film (Kodak). Sekvence oligonukleotidových primerů použitých při PCR amplifikaci byly: pro HLA-aDQ, -ßDQ a DMB, jak to popsal Peijnenburg (16), pro GADPH, -aDR a Ii řetězce, jak je popsána Vedrenne et al. (24) a pro-ßDR, – aDP a-ßDP popsané hauberem et al. (25).
Zkratky
-
B-buňky,
linka B-lymfoblastoidních buněčných linií
-
IFN-γ
interferon γ
-
MHC
hlavní histokompatibilní komplex
-
RT-PCR
reverzní transkripce-polymerázové řetězové reakce.
Poděkování
Máme speciálně děkujeme Drs Peter van den Elsen za což nám umožňuje zahrnout ABI buněčné linie ve fúzních experimentech. Jsme vděční Drs Andrew Cant a Mario Abinun za vzorky krve a kožní biopsie od pacientů léčených v jejich jednotce pro BMT, a Dr. Klaus Schwarz za zaslání vzorků krve od dvou pacientů. Děkujeme také Françoise Selzové za její odbornou spolupráci a e. Barrasovi za vynikající technickou pomoc.
,
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, obj.
(str.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, obj.
(str.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, obj.
(str.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, obj.
(str.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)