Komplementaatioryhmän D geneettinen ja Molekyylimääritelmä MHC-luokan II puutos

Abstrakti

MHC-luokan II geenien koordinaattiekspressiossa viallisten solulinjojen joukosta on kuvattu neljä komplementaatioryhmää, A, B, C ja D. Tällaisia ovat esimerkiksi MHC-luokan II puutoksesta kärsivistä potilaista muodostetut solulinjat ja kokeellisesti syntyneet mutanttisolulinjat. D-ryhmää, toisin kuin muita ryhmiä, edusti pitkään vain 6.1.6-mutanttisolulinja. Tämän ryhmän vian aiheuttava geeni RFXAP kloonattiin hiljattain ja sen todettiin mutatoituvan 6.1.6-solulinjassa ja kolmessa potilaassa. Tässä raportoimme fuusiokokeista useilla uusilla HLA-luokan II puutteellisilla potilailla, täydentäen useimpien tunnettujen potilaiden luokittelua neljään täydentävään ryhmään. Potilaat viidestä toisistaan riippumattomasta perheestä luokiteltiin täydentävyysryhmään D, kun taas yhdeksän muuta kuului täydentävyysryhmiin A ja B. Yksikään potilaista ei määritellyt uutta täydentävää ryhmää. Täydellinen MHC-luokan II ilmentymän korjaus saatiin d-ryhmään kuuluvien potilaiden soluissa transfektiolla rfxap-cDNA: lla. Rfxap-koodausalueen havaittiin mutatoituvan kaikilla potilailla. Mutaatioiden havaittiin olevan toistuvia, sillä tähän mennessä raportoiduista kahdeksasta sukukunnasta on löydetty vain kolme eri mutaatiota.

Johdanto

MHC-luokan II antigeeniekspressiota kontrolloidaan tiukasti solupesifisesti (1) ja se on välttämätöntä antigeenispesifisten immuunivasteiden kannalta (2). MHC-luokan II geenien transkriptiota sääteleviä mekanismeja on tutkittu paljon, erityisesti käyttämällä HLA-luokan II ilmentymisessä puutteellisia soluja. Nämä solut ovat joko kokeellisesti syntyneitä mutantteja tai soluja potilailta, joilla on MHC-luokan II puutos (3). Tämä primaarinen immuunipuutos, joka johtuu HLA-luokan II antigeenien puutteellisesta ilmentymisestä, on autosomaalinen resessiivinen häiriö, jolle on ominaista äärimmäinen alttius infektioille ja solu-ja humoraalivasteiden puuttuminen antigeenintunnistuksen yhteydessä (4). Potilaiden solut eivät kopioi Dr -, DQ-ja DP HLA-isotyyppejä (3,5) koodaavia α-Ja β MHC-luokan II geenejä. Intrafamiliaalinen erotteluanalyysi on osoittanut, että geneettinen poikkeavuus on lokalisoitu MHC-alueen ulkopuolelle ja siihen liittyy transvaikutteisia säätelytekijöitä(T) (5). Sekä potilassolulinjoja että kokeellisia mutanttisolulinjoja käytettiin somaattisessa fuusiokokeessa arvioimaan niiden transkriptiotekijöiden määrää, jotka olivat ehdottoman välttämättömiä normaalin MHC-luokan II ilmentymisen varmistamiseksi. Täydentäviä ryhmiä tunnistettiin neljä, A, B, C ja D (6,7).

ryhmien A ja C viasta vastuussa olevat geenit kloonattiin komplementaatiokloonaamalla RJ 2.5.5-solulinjassa (ryhmä A) ja SJO-solulinjassa (ryhmä C). Cita-geeni koodaa ei-DNA: ta sitovaa proteiinia, joka kontrolloi sekä konstitutiivista että indusoituvaa HLA-luokan II ilmentymää ja muuntuu A-ryhmän potilailla (8). Rfx5-geeni koodaa RFX-kompleksin 75 kDa: n alayksikköä ja mutatoituu komplementaatioryhmän C (9) potilailla. Kolmas geeni, Rfxap (RFX-liittyvä proteiini), kloonattiin äskettäin Durand et al. (10). Rfxap koodaa pientä 36 kDa: n alayksikköä RFX-kompleksista, ja geenin mutaatiot ovat vastuussa komplementaatioryhmän d viasta.rfx5-ja RFXAP-proteiinit muodostavat yhdessä kolmannen 41 kDa: n proteiinin kanssa multimeerisen kompleksin RFX, joka sitoutuu MHC-luokan II promoottoreiden X-ruutuun (11). On mahdollista, että tätä kolmatta proteiinia koodaava geeni mutatoituu komplementaatioryhmässä B, jossa kyseistä geeniä ei ole vielä tunnistettu. RFX-kompleksin sitoutuminen DNA: han riippuu cooperatiivisesta sitoutumisesta, jossa on vähintään kaksi pleiotrooppista tekijää, NFY ja X2BP (12-14), mutta ei riitä luokan II transkriptioon. CIITAN on yhdistettävä RFX: ään ja muihin transkriptiotekijöihin, jotka sitoutuvat promoottorin X2-ja Y-laatikoihin, jotta MHC-luokan II geenit voidaan transkriptioida.

tässä kuvataan somaattinen komplementaatioanalyysi 13 uudesta HLA – luokan II puutospotilaasta ja kahdesta aiemmin raportoidusta SS (15) – ja ABI (16) – potilaasta, joiden epäillään edustavan erilaisia komplementaatioryhmiä. Yhden uusista potilaista todettiin kuuluvan ryhmään A ja seitsemän muuta ryhmään B. kuitenkin neljä uutta potilasta putosi samaan täydentävään ryhmään kuin potilaat SS ja ABI. Jälkimmäisen ryhmän todettiin edustavan ryhmää D täydentävällä analyysillä, transfektiolla rfxap-cDNA: n kanssa ja rfxap-geenin mutaatioanalyysillä.

tulokset

potilaiden luokittelu komplementaatioryhmään

somaattisten solujen fuusiokokeissa käytettiin joko B-soluja tai fibroblasteja, jotka edustivat komplementaatioryhmiä A, B, C ja D. sekä B-soluja että fibroblasteja oli saatavilla vain potilaalle ZM. Kuvassa 1 on esimerkki HLA-ilmentymästä, joka saadaan sekä B-solujen että fibroblastien heterokaryoneissa. Fibroblasti-heterokaryoneissa 3-10% HLA-luokan II positiivisista soluista havaittiin 48 h interferoni-γ (IFN-γ) – hoidon jälkeen. B-solujen heterokaryoneissa voitiin havaita enintään 5% HLA-luokan II-positiivisia soluja. Kuvassa 2 esitetään yhteenveto somaattisten solujen fuusioista saaduista tiedoista, ja taulukossa 2 esitetään vasta tutkittujen potilaiden luokittelu aiemmin julkaistuihin tietoihin nähden (6,7). Yksi pakistanilaistaustainen potilas luokiteltiin ryhmään A, seitsemän potilasta sijoitettiin ryhmään B ja viisi ryhmään D. yksikään potilaista ei kuulunut ryhmään C.

kuten taulukosta 1 ilmenee, neljän potilaan, ZM: n, AkO: n, ShA: n ja ShG: n fibroblastit täydensivät A-ja B-komplementaatioryhmien soluja, mutta eivät täydentäneet SS: n fibroblastisolulinjaa, jota ei ollut luokiteltu (15). ZM B-solut täydensivät A -, B-ja C-ryhmien B-soluja, mutta eivät täydentäneet ryhmän D määrittelevää HLA-luokan II-negatiivista 6.1.6 B-solulinjaa.täydentymistä ei saatu ZM -, AkO -, Sha-ja ShG-fibroblastien fuusion jälkeen. Lisäksi mikään näistä fibroblastisolulinjoista, jossa ZM: ää esiintyy, ei täydentänyt solulinjaa ABI (16). Siten SS -, AkO -, ShA -, ShG ABI-ja ZM-potilaiden solut kuuluvat kaikki komplementaatioryhmään D.

HLA-luokan II lausekkeen korjaus transfektiolla rfxap cDNA: lla

kuten aiemmin on raportoitu rfxap cDNA: lla tehdyissä ohimenevissä transfektiokokeissa, MHC-luokan II lausekkeen korjaus saatiin ZM-ja ABI-fibroblasteissa (17). Kuvassa 2 esitetään konstitutiivisen HLA-luokan II geenin ilmentymisen täydellinen korjaus soluissa potilaalta ZM, joka oli ainoa potilas, jolle oli saatavilla B-solulinja, rfxap-cDNA: lla suoritetun transfektion jälkeen. Sen sijaan transfektio cita – tai rfx5-cDNAs-valmisteella ei palauttanut HLA-luokan II lauseketta; ei myöskään transfektio tyhjällä vektorilla. Samanlaisia tuloksia saatiin IFN-γ-indusoidun MHC-luokan II ilmentymisen osalta fibroblasteissa potilailla AkO, SS ja ShA (tietoja ei näy).

rfxap-geenin mutaatiot potilailla SS, AkO, ShA ja ShG

täyspitkät rfxap cdnat monistettiin PCR: llä potilaista SS, AkO, ShA ja ShG, kuten on kuvattu (10), kloonattiin pgem-vektorilla ja sekvensoitiin. Kaikilla neljällä potilaalla todettiin rfxap-cDNA: n mutaatioita. Nämä mutaatiot vahvistettiin sitten sekvensoimalla suoraan potilaiden ja heidän vanhempiensa genomiset PCR-valmisteet.

SS-perheessä, jossa oli kaksi sairasta lasta, havaittiin homotsygoottinen g: n poisto nukleotidissa 484 (484delg) (Kuva. 3). Sama mutaatio havaittiin suvussa ZM (17). Tuloksena kehyksensiirto johtaa kehyksen ulkopuoliseen pysäytyskodoniin nukleotidi 525: ssä. Vanhempien todettiin olevan tämän mutaation suhteen heterotsygootteja.

suvussa ako havaittiin glutamiinikodonin korvaaminen pysäytyskodonilla (CAG→TAG) rfxap-geenin kohdassa 279 (C279X) (Kuva. 4). Tämän mutaation ennustetaan johtavan 52 aminohapon typistettyyn proteiiniin. Sama mutaatio on havaittu aiemmin abi-potilaalla (17). AkO: n vanhemmat ovat heterotsygootteja tälle mutaatiolle.

perheessä Sh, jossa oli kaksi ensimmäisen asteen serkkua ShA ja ShG, havaittiin seitsemän nukleotidin “GCGGGCG” lisäys rfxap cDNA: n asemaan 151. Tämä mutaatio on nimetty 151ins7: ksi. Se edustaa monistumista villin tyypin sekvenssistä, joka ulottuu nukleotideihin 144-150. Se johtaa kehyksensiirtoon, jonka seurauksena nukleotidi 329 pysäyttää kodonin. Molemmat tämän perheen potilaat perivät tämän homotsygoottisen mutaation (Kuva. 5). Molempien potilaiden vanhemmat olivat heterotsygootteja (tietoja ei näy).

MHC-luokan II, DMB ja Ii ketjugeenin ilmentyminen komplementaatioryhmässä D

koska Dra-ja DPB-geenien jäännösekspressiota oli raportoitu abi-potilaan soluissa (16), MHC-luokan II geenin ilmentymistä tutkittiin ryhmän D potilailla RT-PCR: llä. DPA-ja/tai DPB-geenien transkriptiossa havaittiin vaihteleva taso neljällä potilaalla, mutta ei A-ryhmän verrokkipotilaalla (Fig. 6). Kuitenkin jopa potilaiden ShG-soluissa, joissa havaittiin sekä DPA-että DPB-transkriptejä, ei ollut havaittavissa dpaß-kompleksin kalvoilmaisua (Kuva. 7). Yhdessäkään potilassolulinjassa ei ollut RT-PCR: n havaitsemaa HLA DR -, DQ -, DMB-tai Ii-ketjugeenin mRNA-geeniä (Kuva. 6).

Keskustelu

huolimatta tutkittujen potilaiden määrän kasvusta ja pleiotrooppisista tekijöistä, joiden on osoitettu osallistuvan MHC-luokan II ilmentymisen kontrolliin, täydentävien ryhmien ja siten mutatoituneiden tekijöiden määrä MHC-luokan II immuunipuutospotilailla on edelleen neljä (Taulukko 2). Tutkimuksessa tutkittujen 13 uuden HLA-luokan II puutteellisen potilaan kohdalla suurin osa raportoiduista potilaista on nyt luokiteltu täydentäviin ryhmiin, eikä yhdessäkään määritetä viidettä täydentävää ryhmää. Yhteensä 34 perheen 39 potilaasta 6 oli täydentävässä ryhmässä A, 22 ryhmässä B, 3 ryhmässä C ja 8 ryhmässä D. kaksi veljestä, joilla oli osittainen MHC-luokan ilmaisuvika ja lievä immuunipuutos, luokiteltiin äskettäin täydentävään ryhmään (18). Nämä epätyypilliset potilaat edustavat todennäköisesti toista oireyhtymää, koska he pystyvät reagoimaan rokotuksiin (19).

tässä raportissa luokitelluista immuunipuutospotilaista vain perhe Kh, jolla on kaksi sairastunutta sisarusta, kuuluu ryhmään A. vaikka aiemmin kuvatut ryhmän A potilaat ovat olleet espanjalaista syntyperää (15), nämä uudet tapaukset olivat pakistanilaista alkuperää, mikä osoittaa, että cita-mutaatiot eivät rajoitu yhteen etniseen alkuperään. Uusista potilaista seitsemän kuuluu B-ryhmään ja on pohjoisafrikkalaista, italialaista, turkkilaista ja saudiarabialaista syntyperää. BLS1-perustajapotilas mukaan lukien ryhmässä B on yhteensä 22 perhettä.

neljä uutta potilasta kolmesta perheestä sekä SS-potilas (15) kuuluvat ryhmään D. He ovat pohjoisafrikkalaista, turkkilaista ja Druusilaista syntyperää. Niiden kliiniset ja biologiset ominaisuudet eivät poikenneet muista potilaista, joilla oli HLA-puutos. Kuitenkin kaikissa paitsi yhdessä voidaan havaita DPA-ja/tai DPB-geenien transkriptio. DPA-ja DPB-transkription jäämiä raportoitiin myös abi-potilaalla (16). Tutkimuksessa tutkituilla potilailla DP-transkriptien esiintymisestä huolimatta kypsiä DPA-β-heterodimeerejä ei havaittu solun pinnalla, ehkä siksi, että Ii-ja DM-geenejä ei ilmaista. Näin ollen vian vuotavuudesta ei ole odotettavissa toiminnallisia seurauksia, kuten on havaittu In vivo.

kolme erilaista näyttöä osoittaa, että nämä potilaat kuuluvat komplementaatioryhmään D, eli somaattisten solujen fuusioanalyysi, potilaiden solujen siirto rfxap-cDNA: lla ja mutaatioanalyysi. Yksiselitteiset solufuusiotulokset saatiin käyttämällä sekä fibroblasteja että B-solulinjoja, kuten ZM-potilaan kohdalla on osoitettu. ZM-solujen ja 6.1.6 B-solulinjan sekä ZM-ja SS-fibroblastien välisen komplementaation puuttuminen validoi kaikki muut fuusiotiedot, myös abi-fibroblastien tulokset. Tämän potilaan aiempi luokitteluvirhe ryhmään ” E ” (16) johtui todennäköisesti käytetyn 6.1. 6 solulinjan vuotavuudesta ja/tai solulinjojen välillä tehdyistä fuusiokokeista (B-fibroblastisolufuusiot). RFXAP-cDNA: n transfektiolla tehty täydellinen HLA-luokan II ilmentymän korjaus ryhmän D soluissa, ei muissa ryhmissä, vahvisti aiemmin raportoidut tiedot ohimenevistä transfektiokokeista (10,17). Rfxap cDNA: n havaittiin mutatoituvan SS -, AKO -, Sh-ja ShG-potilailla, kuten aiemmin on osoitettu myös ZM-ja ABI-potilailla (17).

rfxap: sta löydettiin kolmenlaisia toistuvia mutaatioita, ts. substituutio, deleetio ja insertio(Kuva. 8). Rfxap-geenin erittäin korkea CG-pitoisuus, joka johtaa polymeraasivirheisiin, voi selittää näiden mutaatioiden syntymisen (20). Potilaalla AKO havaittu c279x-transitio on sama kuin potilaalla ABI (17) aiemmin havaittu mutaatio ja potilaalla SS todettu 484delg-mutaatio on sama kuin potilailla DA ja ZM (10,17). Molemmissa tapauksissa mutaatioiden ennustetaan aiheuttavan kehyksensiirron ja vaikeasti typistettyjen proteiinien synteesin 52 ja 136 aminohaposta. Sh-serkuilta löydettiin aiemmin tuntematon mutaatio eli kahdennettujen nukleotidien 144-150: “GCGGGGC” lisäys. Tämä mutaatio johtaa myös kehyksensiirtoon ja typistettyyn tuotteeseen. Kaikki mutaatiot havaittiin alueella, joka kattoi rfxap-cDNA: n nukleotidit 116-540, jotka vastaavat yhtä eksonia.

siksi rfxap-geenin on toistaiseksi havaittu vain kolme eri mutaatiota kuudessa eri perheessä, mukaan lukien potilaan DA (10). Perheiden etninen alkuperä voisi osoittaa näiden mutaatioiden esi-alkuperän, koska potilaat SS, RA ja ZM ovat pohjoisafrikkalaista alkuperää, kun taas potilaat AKO ja ABI ovat turkkilaista syntyperää. Merkillepantavaa on kuitenkin se, että vain MHC-luokan II puutoksen ryhmässä D on tähän mennessä havaittu tällaisia toistuvia mutaatioita. Esimerkiksi ryhmässä A, vaikka espanjalaista syntyperää olevien potilaiden esiintyvyys on suuri (15), ei ole havaittu toistuvia alleelia eri potilailla (8, ja B. Lisowska-Grospierre ym., julkaisematon). Kaikissa täydentävissä ryhmissä suurin osa potilaista tulee Välimeren alueelta, jossa verisukulaisavioliitot ovat yleisiä.

miksi RFXAP-geenimutaatiot, jotka todennäköisesti aiheuttavat epäfunktionaalisia proteiineja, liittyvät DPA/B-geenin transkriptioon. Tämä havainto antaa näyttöä MHC-luokan II geenin transkription säätelyn rajallisesta, mutta merkittävästä poikkeavasta säätelystä. Nämä tulokset vaativat lisätutkimuksia, jotta voidaan määrittää rfxap: n mahdollinen spesifinen rooli DRA/B: ssä, DQA/B: ssä verrattuna DPA/B: n transkriptioon.

aineistot ja menetelmät

potilaat

kolmetoista tähän mennessä kuvaamatonta potilasta yhdestätoista perheestä, joilla oli MHC-luokan II immuunipuutos, tutkittiin. Yksitoista perhettä oli verisukulaisia. He olivat pohjoisafrikkalaista (kolme), italialaista (kaksi), turkkilaista (kolme), Druusilaista (kaksi), pakistanilaista (kaksi) ja saudiarabialaista (yksi) alkuperää. Kaikilla potilailla HLA-luokan II antigeenejä ei ollut havaittavissa B-solujen, monosyyttien ja aktivoituneiden T-solujen solupinnalla. Kliiniselle esiintymistiheydelle oli ominaista toistuvat infektiot, vaikea ripuli ja kukoistuksen puute. Antigeenispesifisten humoraali-ja soluvasteiden puuttuminen havaittiin kaikilla ja hypogammaglobuliini-amemia useilla potilailla. Tässä raportissa on yksityiskohtaisia tutkimuksia potilaiden soluista, AkO, ShA, ShG, ZM. ZM: n osalta esitettiin aiemmin osittaisia tuloksia (17). SS-potilas on jo kuvattu (15). Somaattisissa komplementaatiokokeissa on jo raportoitu abi-potilaan ominaisuuksia (16).

soluviljelmä

B-solulinjat määritettiin potilaiden B-soluista Epstein-Barr-virusinfektion (EBV) avulla. Potilaiden ihon fibroblastit otettiin ihobiopsialla ja muunnettiin SV40: llä edellä kuvatulla tavalla (15). Kaikki solulinjat kasvatettiin 37°C: ssa 5% CO2: ssa RPMI-1640: ssä (Gibco BRL Lifesciences) täydennettynä 20%: n lämpö inaktivoidulla sikiön vasikkaseerumilla. Fibroblasteja tai niiden heterokaryoneja hoidettiin IFN-γ: lla(200 IU/ml) 40 tunnin ajan ennen MHC-luokan II ekspression analysointia.

immunofluoresenssi

Anti-HLA-DR-vasta-aine 20, 6 (21), anti-luokan II Bu27 (The Binding Site, Birmingham, UK) ja anti-luokan I vasta-aine W6/32 (ServaLab) käytettiin. B-solut värjättiin suspensiossa, kun taas fibroblastit kiinnitettiin etanoliin ennen vasta-aineiden inkubaatiota, kuten on kuvattu (15). Solususpensiot analysoitiin Beckton Dickinson-sytofluorografilla ja kiinteät solut Leitz Ortoplan-mikroskoopilla.

somaattinen komplementaatioanalyysi

vastaperustettujen potilaiden fibroblasti-ja B-solulinjat sekä kokeelliset solulinjat (HVJ, ABL, SJO ja 6.1. 6.) näissä kokeissa käytettiin potilaita, jotka oli aiemmin luokiteltu täydentäviin ryhmiin A, B, C ja D. 6.1.6-solulinja oli genetiikan valitsema täysin negatiivinen MHC-luokan II muunnos, jonka ystävällisesti toimitti C. Alcaide (Institut Pasteur). Lisäksi fuusiokokeita olivat: potilaan SS-solulinja, joka edustaa oletettua täydentävää ryhmää X (15), ja potilaan ABI-solulinja, jonka raportoidaan edustavan ryhmää E (16), ystävällisesti toimittanut P. van den Elsen. Molempien solutyyppien, B-solujen ja fibroblastien ohimeneviä heterokaryoneja saatiin aiemmin yksityiskohtaisesti kuvatulla elektrofuusiomenetelmällä (15). Fenotyyppinen palautuminen testattiin immunofluoresenssilla tai northern blotilla 48-72 tunnin kuluttua solufuusion jälkeen. Fibroblastien tapauksessa soluja viljeltiin joko 200 IU/ml rekombinanttia IFN-γ: ta (Genex) käyttäen tai ilman.

Transfektiot

transfektiossa käytetyt plasmidit olivat pREP4 (Invitrogen), pREP4-RFXAP ja EBO-Sfi (tyhjä vektori) tai EBO-cita, ystävällisesti toimittanut V Steimle (8). B-solulinjojen ja fibroblastien transfektiot suoritettiin kuvatulla tavalla (22) 1-10 µg: lla kutakin plasmidia käyttäen JOUAN GTH 128/a-elektropulseria kuvatulla tavalla (15). Stabiileja transfektantteja syntyi hygromycine B: llä (250 µg/ml; Kalbiokemia). Transfektoituja fibroblasteja hoidettiin 200 IU/ml IFN-γ: lla ennen MHC-luokan II ilmentymistestiä.

PCR-monistus ja sekvensointi rfxap

potilaiden täyspitkät rfxap cDNA-kloonit eristettiin RT-PCR: llä ja subklonoitiin pgem-T-vektoriksi (Promega) standardimenetelmien mukaisesti ja analysoitiin mutaatioiden varalta. Mutaatiot vahvistettiin sitten potilaiden ja heidän vanhempiensa DNA: ssa tutkimalla PCR-monistettuja genomisia DNA-fragmentteja, jotka kattavat nukleotidit 116-540, kuten on kuvattu (17). PCR suoritettiin Expand High Fidelity PCR-järjestelmällä (Boeh-Ringer Mannheim) kuvatulla tavalla (10). Rekombinanttiplasmidien sekvensoinnissa käytettiin ABI PRISM dye terminator cycle sequencing kit (ABI) – sekvensaattoria ja sovellettua Biosystems DNA-sekvensseriä. Genomiset PCR-tuotteet sekvensoitiin suoraan käyttämällä radioleimattuja sekvensointialustoja ja Termosekenaasisarjaa (Amersham) ja analysoitiin sekvensointigeelillä.

RT-PCR: n osoittaminen HLA-luokan II, DMB, Ii ja GADPH-geenin ilmentymisestä

sytoplasmisen RNA: n kokonaismäärä uutettiin IFN-γ: n indusoimista fibroblasteista guanidiumtiosyanaattimenetelmällä (23). Ensimmäinen lohko cDNA syntetisoitiin lintujen myeloblastoosiviruksen (AMV) käänteiskopioijaentsyymillä(Boehringer Manneheim, SA) käyttäen 10 ng oligoa (dT) primerina ja 5 µg sytoplasmaista RNA: ta. PCR-amplifikaatio suoritettiin 50 µl: n lopullisessa tilavuudessa käyttäen 1/30 cDNA: Ta, 1 µM kutakin primeria, 200 µM kutakin d NTP: tä, 1, 25 IU AmpliTaq polymeraasia (Perkin-Elmer, Forster City, CA) ja 0, 1 µCi Dctp: tä (Amersham) kussakin näytteessä. DNA denaturoitiin 94°C: n lämpötilassa 1 min, hehkutettiin 1 min 55°C: n lämpötilassa kaikkien geenien havaitsemiseksi paitsi GADPH: n ja aDR: n, joille käytettiin 58°C: n hehkutuslämpötilaa. Pidennys 72°C: ssa kesti 1 min. Tämä sykli toistettiin 25 kertaa GADPH: n ja aDR: n osalta ja 27 kertaa muiden geenien osalta, minkä jälkeen 10 minuutin venymä 72°C: ssa. näytteet elektroforisoitiin 5-prosenttisilla akryyliamidigeeleillä 150 V: n lämpötilassa 2 tunnin ajan.geelit kiinnitettiin ja kuivattiin ennen altistusta Fosforimager-laatikossa (molekyylidynamiikka) tai X-Omat-kalvolle (Kodak). PCR-monistuksessa käytetyt oligonukleotidialkuperusteiden sekvenssit olivat: HLA-aDQ: lle, – ßDQ: lle ja DMB: lle peijnenburgin (16) kuvaamalla tavalla, GADPH: lle, -aDR: lle ja Ii-ketjulle Vedrenne et al: n kuvaamalla tavalla. (24), Ja for-ßDR, -aDP ja-ßDP, kuten Hauber et al. (25).

lyhenteet

lyhenteet
• B-solu

  Linja B-lymfoblastoidisolulinja

• interferoni γ

  interferoni

• MHC

  merkittävä histokompleksi

• RT-PCR

  Käänteinen transkriptiopolymeraasiketjureaktio.

kiitokset

Kiitämme erityisesti DRS Peter van den Elseniä siitä, että saimme sisällyttää abi-solulinjan fuusiokokeisiin. Olemme kiitollisia tohtori Andrew Cantille ja Mario Abinunille verinäytteistä ja ihon koepaloista potilailta, joita hoidettiin heidän BMT-yksikössään, ja tohtori Klaus Schwarzille siitä, että hän lähetti meille kahden potilaan verinäytteet. Kiitämme myös Françoise Selziä asiantuntevasta yhteistyöstä ja E. Barrasia erinomaisesta teknisestä avusta.