genetisk och molekylär Definition av Komplementeringsgrupp D i MHC klass II-brist

Abstrakt

fyra komplementeringsgrupper, A, B, C och D, har beskrivits bland cellinjer som är defekta i koordinatuttrycket av MHC klass II-gener. Dessa inkluderar cellinjer etablerade från patienter som drabbats av MHC klass II-brist och experimentellt genererade mutanta cellinjer. Grupp D, i motsats till de andra grupperna, representerades länge endast av 6.1.6 mutantcellinjen. Genen som är ansvarig för defekten i denna grupp, RFXAP, klonades nyligen och befanns vara muterad i 6.1.6-cellinjen och hos tre patienter. Här rapporterar vi fusionsexperiment i flera nya patienter med HLA-klass II-brist och kompletterar klassificeringen av majoriteten av kända patienter i de fyra komplementeringsgrupperna. Patienter från fem orelaterade familjer klassificerades i komplementeringsgrupp D, medan nio andra faller i komplementeringsgrupperna A och B. Ingen av patienterna definierade en ny komplementeringsgrupp. Fullständig korrigering av MHC klass II-uttryck erhölls i celler från patienter som tillhör grupp D genom transfektion med RFXAP cDNA. Rfxap-kodningsregionen befanns vara muterad hos alla patienter. Mutationer visade sig vara återkommande eftersom endast tre olika mutationer har hittats i de åtta orelaterade familjerna som hittills rapporterats.

introduktion

MHC klass II-antigenuttryck kontrolleras tätt på ett cellspecifikt sätt (1) och är väsentligt för antigenspecifika immunsvar (2). Mekanismer som styr transkription av MHC-klass II-gener har studerats omfattande, särskilt genom att använda celler som är bristfälliga i HLA-klass II-uttryck. Dessa celler är antingen experimentellt genererade mutanter eller celler från patienter som drabbats av MHC klass II-brist (3). Denna primära immunbrist som härrör från defekt uttryck av HLA klass II-antigener är en autosomal recessiv sjukdom som kännetecknas av en extrem mottaglighet för infektioner och en frånvaro av cellulära och humorala T-cellsvar vid antigenigenkänning (4). Celler från patienterna transkriberar inte gener av MHC-klass II-typ av MHC-gener som kodar för DR, DQ och DP HLA-isotyper (3,5). Intrafamilial segregeringsanalys har visat att den genetiska avvikelsen är lokaliserad utanför MHC-regionen och involverar transverkande regleringsfaktor(er) (5). Både patientcellinjer och experimentella mutanta cellinjer användes i somatiska fusionsexperiment för att utvärdera antalet transkriptionsfaktorer som absolut krävdes för att säkerställa normalt MHC-klass II-uttryck. Fyra kompletteringsgrupper identifierades, A, B, C och D (6,7).

generna som ansvarar för defekten i grupperna A och C klonades genom komplementering kloning i RJ 2.5.5 cellinjen (grupp A) respektive SJO cellinjen (Grupp C). Ciita-genen kodar för ett icke-DNA-bindande protein som styr både konstitutivt och inducerbart HLA-klass II-uttryck och muteras i Grupp A-patienter (8). Rfx5-genen kodar för en 75 kDa-subenhet av RFX-komplexet och muteras hos patienter från komplementeringsgrupp C (9). En tredje gen, RFXAP (för RFX-associerat protein), klonades nyligen av Durand et al. (10). RFXAP kodar en liten 36 kDa-subenhet av RFX-komplexet, och mutationer av genen är ansvariga för defekten i komplementeringsgrupp D. rfx5-och RFXAP-proteinerna bildar tillsammans med ett tredje protein av 41 kDa, ett multimeriskt komplex RFX som binder till X-boxregionen för MHC-klass II-promotorer (11). Det är möjligt att en gen som kodar för detta tredje protein muteras i komplementeringsgrupp B, där den drabbade genen ännu inte har identifierats. Bindningen av RFX-komplexet till DNA beror på kooperativ bindning med minst två pleiotropa faktorer, NFY och X2BP (12-14), Men är inte tillräcklig för klass II-transkription. CIITA måste kombinera med RFX och de andra transkriptionsfaktorerna som binder till promotorns X2-och Y-lådor för att tillåta transkription av MHC-klass II-gener.

vi beskriver här den somatiska komplementanalysen av 13 nya HLA-klass II-bristpatienter och två tidigare rapporterade patienter SS (15) och ABI (16), misstänkta för att representera olika komplementeringsgrupper. En av de nya patienterna befanns tillhöra grupp A och sju andra till grupp B. emellertid föll fyra nya patienter i samma komplementeringsgrupp som patienter SS och ABI. Den senare gruppen befanns representera Grupp D genom komplementanalys, transfektion med RFXAP cDNA och mutationsanalys av rfxap-genen.

resultat

klassificering av patienter i komplementeringsgrupper

somatiska cellfusionsexperiment utfördes med användning av antingen B-celler eller fibroblaster som representerar komplementeringsgrupper A, B, C och D. både B-celler och fibroblaster var endast tillgängliga för patient ZM. Figur 1 visar ett exempel på HLA-uttryck erhållet i heterokaryoner av både B-celler och fibroblaster. I fibroblast heterokaryoner detekterades 3-10% av HLA-klass II-positiva celler 48 h efter behandling med interferon-XXL (IFN-XXL). I B-cell heterokaryoner kunde inte mer än 5% HLA klass II-positiva celler detekteras. Figur 2 sammanfattar de data som erhållits genom somatiska cellfusioner och Tabell 2 ger klassificeringen av de nyligen studerade patienterna med avseende på tidigare publicerade data (6,7). En patient av pakistanskt ursprung klassificerades i Grupp A, sju patienter placerades i Grupp B och fem klassificerades i Grupp D. ingen av patienterna tillhörde Grupp C.

som Tabell 1 visar, fibroblaster från fyra patienter, zm, AkO, ShA och ShG, kompletterade celler som representerar komplementeringsgrupper A och B men kompletterade inte SS-fibroblastcellinjen, som inte hade klassificerats (15). ZM B-celler kompletterade B-celler från grupperna A, B och C men kompletterade inte HLA klass II-negativ 6.1.6 B-cellinje som definierade Grupp D. ingen komplettering erhölls efter fusion mellan zm, AkO, Sha och ShG fibroblaster. Dessutom kompletterade ingen av dessa fibroblastcellinjer, inklusive ZM, cellinjen ABI (16). Således hör celler från patienter SS, AkO, ShA, ShG ABI och ZM till komplementeringsgrupp D.

korrigering av HLA klass II-uttryck genom transfektion med RFXAP cDNA

som tidigare rapporterats, i transienta transfektionsexperiment med RFXAP cDNA, erhölls en korrigering av MHC klass II-uttryck i ZM och ABI fibroblaster (17). Figur 2 visar fullständig korrigering av konstitutivt HLA-klass II-genuttryck i celler från patient ZM, den enda patienten för vilken en B-cellinje var tillgänglig, efter transfektion med RFXAP cDNA. Däremot återställde transfektion med CIITA eller RFX5 cDNA inte HLA klass II-uttryck; inte heller transfektion med den tomma vektorn. Liknande resultat erhölls för IFN-Macau-inducerad MHC klass II-uttryck i fibroblaster från patienter AkO, SS och ShA (data visas inte).

mutationer av rfxap-genen hos patienter SS, AkO, ShA och ShG

Rfxap-cDNA i Full längd förstärktes med PCR från patienter SS, AkO, ShA och ShG, såsom beskrivits (10), subklonad i en pgem-vektor och sekvenserad. Hos alla fyra patienterna identifierades mutationer i RFXAP cDNA. Dessa mutationer bekräftades sedan genom direkt sekvensering av genomiska PCR-produkter från patienterna och deras föräldrar.

i familjen SS, med två drabbade barn, hittades en homozygot deletion av en G vid nukleotid 484 (484delG) (Fig. 3). Samma mutation detekterades i familjen ZM (17). Den resulterande ramförskjutningen leder till ett stoppkodon utanför ramen vid nukleotid 525. Föräldrarna befanns vara heterozygota för denna mutation.

i familjen AkO detekterades en substitution av ett glutaminkodon med ett stoppkodon (CAG-tagg) vid position 279 av rfxap-genen (C279X) (Fig. 4). Denna mutation förutspås leda till ett stympat protein med 52 aminosyror. Samma mutation har tidigare detekterats hos patienten ABI (17). Föräldrarna till AkO är heterozygota för denna mutation.

i familjen Sh, med två drabbade kusiner i första graden ShA och ShG, hittades en insättning av sju nukleotider ‘GCGGGCG’ vid position 151 i RFXAP cDNA. Denna mutation betecknas 151ins7. Det representerar en duplicering av vildtypssekvensen som spänner över nukleotider 144-150. Det leder till en frameshift vilket resulterar i ett stoppkodon vid nukleotid 329. Båda patienterna från denna familj ärvde denna homozygota mutation (Fig. 5). Föräldrarna till båda patienterna var heterozygota (data visas inte).

MHC-klass II, DMB och II-kedjegenuttryck i komplementeringsgrupp D

eftersom restuttryck av DRA-och DPB-gener hade rapporterats i celler från patient ABI (16) undersöktes MHC-klass II-genuttryck i Grupp D-patienter med RT-PCR. En variabel transkriptionsnivå observerades för DPA-och / eller DPB-gener hos fyra av patienterna, men inte hos en kontrollpatient från grupp A (Fig. 6). Men även i patientens SHG-celler, i vilka både DPA-och DPB-transkript detekterades, fanns det inget detekterbart membranuttryck av DPA-Askorbinkomplexet (Fig. 7). I ingen av patientcellinjerna detekterades HLA DR, DQ, DMB eller Ii-kedjegen mRNA med RT-PCR (Fig. 6).

diskussion

trots det växande antalet undersökta patienter och de pleiotropa faktorerna som visat sig vara involverade i kontrollen av MHC-klass II-uttryck, förblir antalet komplementeringsgrupper och därmed faktorer muterade hos MHC-klass II-immunbristpatienter vid fyra (tabell 2). Med de 13 nya HLA-klass II-bristfälliga patienterna som studerats i detta arbete har majoriteten av rapporterade patienter nu klassificerats i komplementeringsgrupper och ingen definierar en femte komplementeringsgrupp. Sammantaget av de 39 patienter från 34 familjer finns 6 i komplementeringsgrupp a, 22 i Grupp B, 3 i Grupp C och 8 i Grupp D. två bröder med en partiell defekt av MHC klass II-uttryck och med en mild form av immunbrist klassificerades nyligen i en ytterligare komplementeringsgrupp (18). Dessa atypiska patienter representerar förmodligen ett annat syndrom, eftersom de kan svara på vaccination (19).

bland de immunbristpatienter som klassificeras i denna rapport tillhör endast familjen Kh, med två drabbade syskon, Grupp A. medan tidigare beskrivna grupp A-patienter har varit av spansk härkomst (15) var dessa nya fall av pakistanskt ursprung, vilket visar att ciita-mutationer inte är begränsade till ett etniskt ursprung. Sju av de nya patienterna faller i Grupp B och är av nordafrikansk, italiensk, Turkisk och Saudiarabisk härkomst. Sammantaget, inklusive BLS1-grundarpatienten, finns det 22 familjer i Grupp B.

fyra nya patienter i tre familjer, tillsammans med patient SS (15), faller i Grupp D. De är av nordafrikansk, Turkisk och Drusisk härkomst. Deras kliniska och biologiska egenskaper skilde sig inte från andra patienter med HLA-brist. Men i alla utom en kunde transkription av DPA-och / eller DPB-gener detekteras. Återstående DPA-och DPB-transkription rapporterades också i patient ABI (16). Hos de patienter som studerades i detta arbete, trots närvaron av DP-transkript, detekterades inte mogna DPA-oc-heterodimerer vid cellytan, kanske för att Ii-och DM-generna inte uttrycks. Således kan inga funktionella konsekvenser förväntas från denna läckage i defekten, vilket faktiskt observeras in vivo.

tre olika bevislinjer visar att dessa patienter tillhör komplementeringsgrupp D, dvs somatisk cellfusionsanalys, transfektion av patienternas celler med RFXAP cDNA och mutationsanalys. Entydiga cellfusionsresultat erhölls genom användning av både fibroblaster och B-cellinjer, vilket demonstrerades för patient ZM. Frånvaron av komplettering mellan ZM-celler och 6.1.6 B-cellinjen å ena sidan och mellan zm-och SS-fibroblaster å andra sidan validerade alla andra fusionsdata, inklusive ABI-fibroblasterna. Tidigare felklassificering av denna patient i Grupp ‘ E ‘(16) berodde troligen på läckaget av 6.1.6-cellinjen som användes och/eller till fusionsexperiment utförda över celllinjer (B-fibroblastcellfusioner). En fullständig korrigering av HLA klass II-uttryck i celler från grupp D, och inte från de andra grupperna, genom transfektion av RFXAP cDNA bekräftade tidigare rapporterade data från transienta transfektionsexperiment (10,17). Rfxap cDNA befanns vara muterad hos patienter SS, AKO, Sh och ShG, vilket också tidigare visats för ZM och ABI (17).

tre typer av återkommande mutationer av RFXAP hittades, dvs substitution, deletion och insättning (Fig. 8). Ett mycket högt CG-innehåll i rfxap-genen som leder till polymerasfel kan redogöra för genereringen av dessa mutationer (20). C279x-övergången detekterad i patient AKO är identisk med den mutation som tidigare detekterats i patient ABI (17) och 484delg-mutationen i patient SS är identisk med den som detekterades hos patienter DA och ZM (10,17). I båda fallen förutspås mutationerna ge upphov till en ramförskjutning och till syntesen av kraftigt stympade proteiner av 52 respektive 136 aminosyror. En tidigare oupptäckt mutation hittades i sh-kusinerna, dvs en insättning av duplicerade nukleotider 144-150: ‘GCGGGGC’. Denna mutation resulterar också i en ramförskjutning och en stympad produkt. Alla mutationer detekterades inom en region som spänner över nukleotider 116-540 av RFXAP cDNA, vilket motsvarar en enda exon.

därför har endast tre olika mutationer av rfxap-genen hittills observerats i sex olika familjer, inklusive patient DA (10). Familjernas etniska ursprung kan indikera ett förfädernas ursprung för dessa mutationer eftersom patienter SS, RA och ZM är av nordafrikanskt ursprung, medan patienter AKO och ABI är av turkisk härkomst. Men anmärkningsvärt är att endast i Grupp D av MHC-klass II-bristen har sådana återkommande mutationer upptäckts hittills. I Grupp A, till exempel, trots en hög förekomst av patienter med spansk härkomst (15), har ingen återkommande allel upptäckts bland de olika patienterna (8, och B. Lisowska-Grospierre et al., opublicerad). I alla komplementeringsgrupper kommer de flesta patienter från Mediterrenean-området, där äktenskapliga äktenskap är frekventa.

varför rfxap-genmutationer, som troligen resulterar i icke-funktionella proteiner, är associerade med kvarvarande DPA/B-gentranskription förstås inte. Denna observation ger bevis för en begränsad men signifikant dyskoordinatreglering av MHC-klass II-gentranskriptionsreglering. Dessa resultat kräver ytterligare studier för att bestämma en förmodad specifik roll för RFXAP I DRA/ B, DQA/B kontra DPA / B transkription.

material och metoder

patienter

tretton hittills obeskrivna patienter från elva orelaterade familjer som drabbats av MHC klass II immunbrist studerades. Elva familjer var blodsförvanter. De var av nordafrikanska (tre), italienska (två), turkiska (tre), druser (två), pakistanska (två) och saudiarabiska (ett) ursprung. Hos alla patienter var HLA klass II-antigener odetekterbara på cellytan av B-celler, monocyter och aktiverade T-celler. Klinisk presentation i alla kännetecknades av återkommande infektioner, svår diarre och misslyckande att trivas. Frånvaron av antigenspecifika humorala och cellulära svar observerades hos alla och hypogammaglobulin-aemi hos flera av patienterna. I denna rapport rapporteras detaljerade studier på cellerna hos patienter, AkO, ShA, ShG, ZM. För ZM presenterades partiella resultat tidigare (17). Patient SS har redan beskrivits (15). Egenskaper hos patient ABI, som ingår i somatiska komplementeringsexperiment, har redan rapporterats (16).

cellodling

B-cellinjer fastställdes från patienternas B-celler genom Epstein-Barr-virus (EBV) – infektion. Patienternas hudfibroblaster erhölls genom hudbiopsi och transformerades med SV40, såsom beskrivits tidigare (15). Alla cellinjer odlades vid 37 kg C i 5% CO2 i RPMI – 1640 (Gibco BRL Lifesciences) kompletterat med 20% värmeinaktiverat fetalt kalvserum. Fibroblaster eller deras heterokaryoner behandlades med IFN-Bisexuell (200 IE/ml) i 40 timmar före analys av MHC klass II-uttryck.

immunofluorescens

Anti-HLA-DR-antikropp 20.6 (21), anti-klass II Bu27 (bindningsstället, Birmingham, UK) och anti-klass i-antikropp W6/32 (ServaLab) användes. B-celler färgades i suspension, medan fibroblaster fixerades med etanol före inkubation med antikroppar, såsom beskrivits (15). Cellsuspensioner analyserades med en Beckton Dickinson cytofluorograf och fixerade celler med ett Leitz Ortoplanmikroskop.

somatisk komplementanalys

Fibroblast-och B-cellinjer från de nyetablerade patienterna samt experimentella cellinjer (HVJ, ABL, SJO och 6.1.6.) från patienter som tidigare klassificerats till komplementeringsgrupper A, B, C respektive D användes i dessa experiment. 6.1.6-cellinjen var en geneticin-utvald helt negativ MHC-klass II-variant, vänligt tillhandahållen av C. Alcaide (Institut Pasteur). Dessutom inkluderade fusionsexperiment: patient SS-cellinje, som representerar en förmodad kompletteringsgrupp X (15) och patient ABI-cellinje, rapporterade att representera grupp E (16), vänligt tillhandahållen av P. van den Elsen. Transienta heterokaryoner av båda celltyperna, B-celler och fibroblaster erhölls genom elektrofusionsmetoden som beskrivits i detalj tidigare (15). Fenotypisk återgång testades genom immunofluorescens eller genom northern blot 48-72 h efter cellfusion. När det gäller fibroblaster odlades cellerna i närvaro eller frånvaro av 200 IE/ml rekombinant IFN-Bisexuell (Genex).

Transfektioner

plasmiderna som användes för transfektion var pREP4 (Invitrogen), pREP4-RFXAP och Ebo-SFI (Tom vektor) eller EBO-CIITA, vänligt tillhandahållen av V Steimle (8). Transfektioner av B-cellinjer och fibroblaster utfördes som beskrivet (22) med 1-10 occurg av varje plasmid, med användning av en Jouan GTH 128/a elektropulser, såsom beskrivet (15). Stabila transfektanter genererades genom selektion med hygromycin B (250 oc/ml; Kalbiochem). Transfekterade fibroblaster behandlades med 200 IU/ml IFN-Macau före testning för MHC klass II-uttryck.

PCR-amplifiering och sekvensering av RFXAP

fullängds rfxap cDNA-kloner från patienter isolerades med RT-PCR och subklonades till pGEM-t-vektor (Promega), enligt standardprocedurer, och analyserades för mutationer. Mutationer bekräftades sedan i DNA hos patienter och deras föräldrar genom att studera PCR-amplifierade genomiska DNA-fragment som spänner över nukleotider 116-540, såsom beskrivits (17). PCR utfördes med Expand High Fidelity PCR-systemet (Boeh-ringer Mannheim), såsom beskrivits (10). Sekvensering av rekombinanta plasmider utfördes med användning av ABI PRISM dye terminator cycle sequencing kit (ABI) och en tillämpad Biosystems DNA-sequencer. Genomiska PCR-produkter sekvenserades direkt genom användning av radiomärkta sekvenseringsprimrar och ett termo-Sequenas kit (Amersham) och analyserades på en sekvenseringsgel.

RT-PCR-detektion av HLA-klass II, DMB, Ii och GADPH-genuttryck

totalt cytoplasmiskt RNA extraherades från IFN-tuberkulininducerade fibroblaster med guanidiumtiocyanatmetoden (23). Första strängen cDNA syntetiserades med aviär myeloblastos virus (AMV) omvänt transkriptas(Boehringer Manneheim, SA) med användning av 10 ng av oligo (dT) som en primer och 5 Baccarat cytoplasmiskt RNA. PCR-amplifiering utfördes i en slutlig volym av 50 oc-l med användning av 1/30 av cDNA, 1 oc-lm av varje primer, 200 oc-lm av varje d NTP, 1,25 IE AmpliTaq-polymeras (Perkin-Elmer, Forster City, CA) och 0,1 oc-LCI dctp (Amersham) i varje prov. DNAEN denaturerades på 94 CCG för 1 min, glödgades för 1 min vid 55 CCG för att detektera alla gener utom GADPH och aDR, för vilka en 58 CCG glödgningstemperatur användes. Förlängning vid 72 kg C var i 1 min. Denna cykel upprepades 25 gånger för GADPH och aDR och 27 gånger för de andra generna, följt av 10 min töjning vid 72 C. prover elektroforesades på 5% akrylamidgeler vid 150 V under 2 h. geler fixerades och torkades före exponering i en Fosforimagerbox (molekyldynamik) eller till X-omat-film (Kodak). Sekvenserna av oligonukleotidprimrar som användes vid PCR-amplifiering var: för HLA-aDQ,- occuldq och DMB som beskrivs av Peijnenburg (16), för GADPH, – aDR och Ii-kedjan som beskrivs av Vedrenne et al. (24), och för-OC-Dr,- aDP och-oc-dp såsom beskrivits av Hauber et al. (25).

förkortningar

förkortningar
• B-cell

  linje B-lymfoblastoidcellslinje

• IFN-Ontario

  interferon

• MHC

  större histokompatibilitetskomplex

• RT-PCR

  omvänd transkriptions-polymeraskedjereaktion.

bekräftelser

vi tackar speciellt Drs Peter van den Elsen för att tillåta oss att inkludera ABI-cellinjen i fusionsexperiment. Vi är tacksamma till Drs Andrew Cant och Mario Abinun för blodprover och hudbiopsier från patienter som behandlats i deras enhet för BMT, och till Dr Klaus Schwarz för att skicka oss blodprover från två patienter. Vi vill också tacka Fran Kazakoise Selz för hennes expertsamarbete och E. Barras för utmärkt teknisk hjälp.