Définition génétique et Moléculaire du Groupe de Complémentation D dans le déficit en CMH de Classe II

Résumé

Quatre groupes de complémentation, A, B, C et D, ont été décrits parmi des lignées cellulaires défectueuses dans l’expression des coordonnées des gènes de classe II du CMH. Il s’agit notamment de lignées cellulaires établies à partir de patients atteints d’un déficit en CMH de classe II et de lignées cellulaires mutantes générées expérimentalement. Le groupe D, contrairement aux autres groupes, n’a longtemps été représenté que par la lignée cellulaire mutante 6.1.6. Le gène responsable du défaut dans ce groupe, RFXAP, a récemment été cloné et s’est avéré muté dans la lignée cellulaire 6.1.6 et chez trois patients. Nous rapportons ici des expériences de fusion chez plusieurs nouveaux patients déficients en HLA de classe II, complétant la classification de la majorité des patients connus dans les quatre groupes de complémentation. Les patients de cinq familles non apparentées ont été classés dans le groupe de complémentation D, tandis que neuf autres appartiennent aux groupes de complémentation A et B. Aucun des patients n’a défini de nouveau groupe de complémentation. Une correction complète de l’expression du CMH de classe II a été obtenue dans des cellules de patients appartenant au groupe D par transfection avec l’ADNc RFXAP. La région codante de RFXAP s’est avérée mutée chez tous les patients. Les mutations se sont avérées récurrentes puisque seulement trois mutations différentes ont été trouvées dans les huit familles non apparentées signalées à ce jour.

Introduction

L’expression de l’antigène de classe II du CMH est étroitement contrôlée de manière spécifique à la cellule (1) et est essentielle pour les réponses immunitaires spécifiques à l’antigène (2). Les mécanismes qui contrôlent la transcription des gènes de classe II du CMH ont été largement étudiés, en particulier en utilisant des cellules déficientes en expression de classe II du HLA. Ces cellules sont soit des mutants générés expérimentalement, soit des cellules de patients atteints d’un déficit en CMH de classe II (3). Cette immunodéficience primaire résultant d’une expression défectueuse des antigènes HLA de classe II est un trouble autosomique récessif caractérisé par une sensibilité extrême aux infections, et une absence de réponses cellulaires et humorales des lymphocytes T lors de la reconnaissance de l’antigène (4). Les cellules des patients ne transcrivent pas les gènes α et β CMH de classe II codant pour les isotypes DR, DQ et DP HLA (3,5). L’analyse de ségrégation intrafamiliale a montré que l’anomalie génétique est localisée à l’extérieur de la région du CMH et implique un ou des facteurs de régulation à action trans (5). Des lignées cellulaires de patients et des lignées cellulaires mutantes expérimentales ont été utilisées, dans des expériences de fusion somatique, pour évaluer le nombre de facteurs de transcription absolument nécessaires pour assurer une expression normale du CMH de classe II. Quatre groupes de complémentation ont été identifiés, A, B, C et D (6,7).

Les gènes responsables du défaut dans les groupes A et C ont été clonés par clonage de complémentation dans la lignée cellulaire RJ 2.5.5 (groupe A) et la lignée cellulaire SJO (groupe C), respectivement. Le gène CIITA code pour une protéine non liée à l’ADN qui contrôle à la fois l’expression constitutive et inductible de la classe II de HLA et est muté chez les patients du groupe A (8). Le gène RFX5 code pour une sous-unité de 75 kDa du complexe RFX et est muté chez des patients du groupe de complémentation C (9). Un troisième gène, RFXAP (pour RFX-associated protein), a été cloné récemment par Durand et al. (10). RFXAP code pour une petite sous-unité de 36 kDa du complexe RFX, et des mutations du gène sont responsables du défaut du groupe de complémentation D. Les protéines RFX5 et RFXAP forment, avec une troisième protéine de 41 kDa, un complexe multimérique RFX qui se lie à la région de la boîte X des promoteurs de classe II du CMH (11). Il est possible qu’un gène codant pour cette troisième protéine soit muté dans le groupe de complémentation B, dans lequel le gène affecté n’a pas encore été identifié. La liaison du complexe RFX à l’ADN dépend de la liaison coopérative avec au moins deux facteurs pléiotropes, NFY et X2BP (12-14), mais n’est pas suffisante pour la transcription de classe II. CIITA doit se combiner avec RFX et les autres facteurs de transcription qui se lient aux boîtes X2 et Y du promoteur pour permettre la transcription des gènes de classe II du CMH.

Nous décrivons ici l’analyse de complémentation somatique de 13 nouveaux patients présentant un déficit en HLA de classe II et de deux patients précédemment rapportés SS (15) et ABI (16), soupçonnés de représenter différents groupes de complémentation. L’un des nouveaux patients appartenait au groupe A et sept autres au groupe B. Cependant, quatre nouveaux patients sont tombés dans le même groupe de complémentation que les patients SS et ABI. Ce dernier groupe représente le groupe D par analyse de complémentation, transfection avec l’ADNc RFXAP et analyse de mutation du gène RFXAP.

Résultats

Classification des patients en groupes de complémentation

Des expériences de fusion de cellules somatiques ont été réalisées en utilisant des cellules B ou des fibroblastes représentant les groupes de complémentation A, B, C et D. Les cellules B et les fibroblastes n’étaient disponibles que pour le patient ZM. La figure 1 montre un exemple d’expression de HLA obtenue dans des hétérokaryons de cellules B et de fibroblastes. Dans les hétérokaryons de fibroblastes, 3 à 10% des cellules HLA de classe II positives ont été détectées 48 h après le traitement par interféron-γ (IFN-γ). Dans les hétérokaryons de cellules B, pas plus de 5% de cellules HLA de classe II positives ont pu être détectées. La figure 2 résume les données obtenues par fusions de cellules somatiques, et le tableau 2 donne la classification des patients nouvellement étudiés par rapport aux données publiées précédemment (6,7). Un patient d’origine pakistanaise a été classé dans le groupe A, sept patients ont été placés dans le groupe B et cinq ont été classés dans le groupe D. Aucun des patients n’appartenait au groupe C.

Comme le montre le tableau 1, les fibroblastes de quatre patients, ZM, AkO, ShA et ShG, complétaient des cellules représentant les groupes de complémentation A et B mais ne complétaient pas la lignée de fibroblastes SS, qui n’avait pas été classée (15). Les cellules B ZM complétaient les cellules B des groupes A, B et C mais ne complétaient pas la lignée de cellules B HLA de classe II négative 6.1.6 définissant le groupe D. Aucune complémentation n’a été obtenue après fusion entre les fibroblastes ZM, AkO, Sha et ShG. De plus, aucune de ces lignées cellulaires de fibroblastes, incluant ZM, n’a complété la lignée cellulaire ABI(16). Ainsi, les cellules des patients SS, AkO, ShA, ShG ABI et ZM appartiennent toutes au groupe de complémentation D.

Correction de l’expression de HLA de classe II par transfection avec l’ADNc RFXAP

Comme indiqué précédemment, dans des expériences de transfection transitoire avec l’ADNc RFXAP, une correction de l’expression du CMH de classe II a été obtenue dans les fibroblastes ZM et ABI (17). La figure 2 illustre la correction complète de l’expression du gène constitutif de classe II de HLA dans les cellules du patient ZM, le seul patient pour lequel une lignée de cellules B était disponible, après la transfection avec l’ADNc RFXAP. En revanche, la transfection avec des ADNc CIITA ou RFX5 n’a pas restauré l’expression de classe II de HLA; la transfection avec le vecteur vide non plus. Des résultats similaires ont été obtenus pour l’expression du CMH de classe II induite par l’IFN-γ dans les fibroblastes de patients AkO, SS et ShA (données non présentées).

Des mutations du gène RFXAP chez des patients SS, AkO, ShA et ShG

Des ADNc RFXAP complets ont été amplifiés par PCR chez des patients SS, AkO, ShA et ShG, comme décrit (10), sous-clonés dans un vecteur pGEM et séquencés. Chez les quatre patients, des mutations de l’ADNc RFXAP ont été identifiées. Ces mutations ont ensuite été confirmées par séquençage direct des produits génomiques PCR des patients et de leurs parents.

Dans la famille SS, avec deux enfants atteints, une délétion homozygote d’un G au nucléotide 484 a été trouvée (484delG) (Fig. 3). La même mutation a été détectée dans la famille ZM (17). Le décalage de trame résultant conduit à un codon d’arrêt hors cadre au nucléotide 525. Les parents se sont révélés hétérozygotes pour cette mutation.

Dans la famille AkO, une substitution d’un codon glutamine par un codon stop (CAG→TAG) en position 279 du gène RFXAP a été détectée (C279X) (Fig. 4). Cette mutation devrait conduire à une protéine tronquée de 52 acides aminés. La même mutation a déjà été détectée chez le patient ABI (17). Les parents d’AkO sont hétérozygotes pour cette mutation.

Dans la famille Sh, avec deux cousins touchés au premier degré ShA et ShG, une insertion de sept nucléotides ‘GCGGGCG’ à la position 151 de l’ADNc RFXAP a été trouvée. Cette mutation est désignée 151ins7. Il représente une duplication de la séquence de type sauvage couvrant les nucléotides 144-150. Il conduit à un décalage de trame aboutissant à un codon d’arrêt au nucléotide 329. Les deux patients de cette famille ont hérité de cette mutation homozygote (Fig. 5). Les parents des deux patients étaient hétérozygotes (données non présentées).

Expression des gènes des chaînes CMH de classe II, DMB et Ii dans le groupe de complémentation D

Étant donné que l’expression résiduelle des gènes DRA et DPB avait été rapportée dans les cellules du patient ABI (16), l’expression des gènes CMH de classe II a été examinée chez les patients du groupe D par RT-PCR. Un niveau de transcription variable a été observé pour les gènes DPA et/ou DPB chez quatre des patients, mais pas chez un patient témoin du groupe A (Fig. 6). Cependant, même dans les cellules ShG des patients, dans lesquelles des transcriptions DPA et DPB ont été détectées, il n’y avait pas d’expression membranaire détectable du complexe DPaß (Fig. 7). Chez aucune des lignées cellulaires du patient, l’ARNm du gène de la chaîne HLA DR, DQ, DMB ou Ii n’a été détecté par RT-PCR (Fig. 6).

Discussion

Malgré le nombre croissant de patients examinés et les facteurs pléiotropes impliqués dans le contrôle de l’expression du CMH de classe II, le nombre de groupes de complémentation, et donc de facteurs mutés chez les patients immunodéficients du CMH de classe II, reste à quatre (tableau 2). Avec les 13 nouveaux patients déficients en HLA de classe II étudiés dans ce travail, la majorité des patients signalés ont maintenant été classés en groupes de complémentation et aucun ne définit un cinquième groupe de complémentation. Au total, sur les 39 patients de 34 familles, il y en a 6 dans le groupe de complémentation A, 22 dans le groupe B, 3 dans le groupe C et 8 dans le groupe D. Deux frères présentant un défaut partiel d’expression du CMH de classe II et présentant une forme légère d’immunodéficience ont récemment été classés dans un groupe de complémentation supplémentaire (18). Ces patients atypiques représentent probablement un autre syndrome, puisqu’ils sont capables de répondre à la vaccination (19).

Parmi les patients immunodéficients classés dans ce rapport, seule la famille Kh, avec deux frères et sœurs atteints, appartient au groupe A. Alors que les patients du groupe A précédemment décrits étaient d’origine espagnole (15), ces nouveaux cas étaient d’origine pakistanaise, montrant que les mutations CIITA ne sont pas limitées à une origine ethnique. Sept des nouveaux patients appartiennent au groupe B et sont d’origine nord-africaine, italienne, turque et saoudienne. Au total, y compris le patient fondateur de BLS1, il y a 22 familles dans le groupe B.

Quatre nouveaux patients dans trois familles, ainsi que le patient SS (15), appartiennent au groupe D. Ils sont d’origine nord-africaine, turque et druze. Leurs caractéristiques cliniques et biologiques ne différaient pas des autres patients déficients en HLA. Cependant, dans tous les gènes sauf un, la transcription des gènes DPA et / ou DPB a pu être détectée. Une transcription résiduelle du DPA et du DPB a également été rapportée chez le patient ABI (16). Chez les patients étudiés dans ce travail, malgré la présence de transcrits DP, des hétérodimères DPa-β matures n’ont pas été détectés à la surface cellulaire, peut-être parce que les gènes Ii et DM ne sont pas exprimés. Ainsi, aucune conséquence fonctionnelle n’est à attendre de cette fuite dans le défaut, comme on l’observe en effet in vivo.

Trois sources de données différentes démontrent que ces patients appartiennent au groupe de complémentation D, c’est-à-dire l’analyse de fusion cellulaire somatique, la transfection des cellules des patients avec l’ADNc RFXAP et l’analyse mutationnelle. Des résultats de fusion cellulaire non ambigus ont été obtenus en utilisant à la fois des fibroblastes et des lignées de cellules B, comme démontré pour le patient ZM. L’absence de complémentation entre les cellules ZM et la lignée cellulaire 6.1.6 B, d’une part, et entre les fibroblastes ZM et SS, d’autre part, a validé toutes les autres données de fusion, y compris celles des fibroblastes ABI. Une erreur de classification antérieure de ce patient dans le groupe “E” (16) était probablement due à la fuite de la lignée cellulaire 6.1.6 utilisée et / ou à des expériences de fusion réalisées à travers des lignées cellulaires (fusions de cellules de fibroblastes B). Une correction complète de l’expression de HLA de classe II dans les cellules du groupe D, et non des autres groupes, par transfection de l’ADNc RFXAP a confirmé les données précédemment rapportées à partir d’expériences de transfection transitoire (10,17). L’ADNc RFXAP s’est avéré muté chez les patients SS, AKO, Sh et ShG, comme indiqué précédemment pour ZM et ABI (17).

Trois types de mutations récurrentes de RFXAP ont été trouvés, à savoir la substitution, la délétion et l’insertion (Fig. 8). Une très forte teneur en CG dans le gène RFXAP conduisant à des erreurs de polymérase pourrait expliquer la génération de ces mutations (20). La transition C279X détectée chez le patient AKO est identique à la mutation précédemment détectée chez le patient ABI (17) et la mutation 484delG chez le patient SS est identique à celle détectée chez les patients DA et ZM (10,17). Dans les deux cas, les mutations sont prévues pour donner lieu à un décalage de cadre et à la synthèse de protéines sévèrement tronquées de 52 et 136 acides aminés, respectivement. Une mutation précédemment non découverte a été trouvée chez les cousins Sh, c’est-à-dire une insertion de nucléotides dupliqués 144-150: ‘GCGGGGC’. Cette mutation se traduit également par un décalage de cadre et un produit tronqué. Toutes les mutations ont été détectées dans une région couvrant les nucléotides 116-540 de l’ADNc RFXAP, qui correspondent à un seul exon.

Par conséquent, seules trois mutations différentes du gène RFXAP ont été observées jusqu’à présent dans six familles différentes, y compris le patient DA (10). L’origine ethnique des familles pourrait indiquer une origine ancestrale de ces mutations puisque les patients SS, RA et ZM sont d’origine nord-africaine, tandis que les patients AKO et ABI sont d’origine turque. Cependant, remarquablement, ce n’est que dans le groupe D du déficit en CMH de classe II que de telles mutations récurrentes ont été détectées jusqu’à présent. Dans le groupe A, par exemple, malgré une prévalence élevée de patients d’origine espagnole (15), aucun allèle récurrent n’a été détecté chez les différents patients (8, et B. Lisowska-Grospierre et al., inédit). Dans tous les groupes de complémentation, la plupart des patients viennent de la région méditerranéenne, où les mariages consanguins sont fréquents.

On ne comprend pas pourquoi les mutations du gène RFXAP, entraînant probablement la formation de protéines non fonctionnelles, sont associées à la transcription résiduelle du gène DPA/B. Cette observation fournit des preuves d’une régulation dyscoordinée limitée mais significative de la régulation de la transcription des gènes de classe II du CMH. Ces résultats nécessitent une étude plus approfondie pour déterminer un rôle spécifique présumé de RFXAP dans la transcription DRA / B, DQA / B par rapport à la transcription DPA / B.

Matériaux et méthodes

Patients

Treize patients jusqu’ici non décrits de onze familles non apparentées atteints d’immunodéficience au CMH de classe II ont été étudiés. Onze familles étaient consanguines. Ils étaient d’origine nord-africaine (trois), italienne (deux), turque (trois), druze (deux), pakistanaise (deux) et saoudienne (une). Chez tous les patients, les antigènes HLA de classe II étaient indétectables à la surface cellulaire des lymphocytes B, des monocytes et des lymphocytes T activés. La présentation clinique dans l’ensemble était caractérisée par des infections récurrentes, des diarrhées sévères et une incapacité à prospérer. L’absence de réponses humorales et cellulaires spécifiques à l’antigène a été observée chez tous, et une hypogammaglobuline-anémie chez plusieurs des patients. Dans ce rapport, des études détaillées sont rapportées sur les cellules des patients, AkO, ShA, ShG, ZM. Pour ZM, des résultats partiels ont été présentés précédemment (17). Le patient SS a déjà été décrit (15). Des caractéristiques du patient ABI, incluses dans des expériences de complémentation somatique, ont déjà été rapportées (16).

Culture cellulaire

Des lignées de cellules B ont été établies à partir des cellules B des patients par infection par le virus d’Epstein-Barr (EBV). Les fibroblastes cutanés des patients ont été obtenus par biopsie cutanée et transformés par SV40, comme décrit précédemment (15). Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées à 37 °C dans 5% de CO2 dans le RPMI-1640 (Gibco BRL Lifesciences) additionné de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur à 20%. Les fibroblastes ou leurs hétérokaryons ont été traités par IFN-γ (200 UI/ml) pendant 40 h avant analyse de l’expression du CMH de classe II.

Immunofluorescence

Anticorps anti-HLA-DR 20.6 (21), anti-classe II Bu27 (Le Site de liaison, Birmingham, Royaume-Uni) et anticorps anti-classe I W6/32 (ServaLab) ont été utilisés. Les cellules B ont été colorées en suspension, tandis que les fibroblastes ont été fixés avec de l’éthanol avant l’incubation avec des anticorps, comme décrit (15). Les suspensions cellulaires ont été analysées avec un cytofluorographe de Beckton Dickinson et les cellules fixes avec un microscope Leitz Ortoplan.

Analyse de complémentation somatique

Lignées de fibroblastes et de cellules B des patients nouvellement établis ainsi que des lignées cellulaires expérimentales (HVJ, ABL, SJO et 6.1.6.) de patients précédemment classés dans les groupes de complémentation A, B, C et D, respectivement, ont été utilisés dans ces expériences. La lignée cellulaire 6.1.6 était une variante du CMH de classe II entièrement négative sélectionnée par la généticine, gentiment fournie par C. Alcaide (Institut Pasteur). En outre, les expériences de fusion comprenaient: la lignée cellulaire du patient SS, représentant un groupe de complémentation putatif X (15), et la lignée cellulaire du patient ABI, représentant le groupe E (16), ont été fournies avec bienveillance par P. van den Elsen. Des hétérokaryons transitoires des deux types cellulaires, des cellules B et des fibroblastes ont été obtenus par la méthode d’électrofusion décrite en détail précédemment (15). La réversion phénotypique a été testée par immunofluorescence ou par northern blot 48-72 h après la fusion cellulaire. Dans le cas des fibroblastes, les cellules ont été cultivées en présence ou en absence de 200 UI/ml d’IFN-γ recombinant (Genex).

Transfections

Les plasmides utilisés pour la transfection étaient pREP4 (Invitrogen), pREP4-RFXAP et EBO-Sfi (vecteur vide) ou EBO-CIITA, aimablement fournis par V Steimle (8). Des transfections de lignées de cellules B et de fibroblastes ont été effectuées comme décrit (22) avec 1 à 10 µg de chaque plasmide, à l’aide d’un électropulseur JOUAN GTH 128/A, comme décrit (15). Des transfectants stables ont été générés par sélection avec l’hygromycine B (250 µg/ml; Calbiochem). Les fibroblastes transfectés ont été traités avec 200 UI/ml d’IFN-γ avant de tester l’expression du CMH de classe II.

L’amplification par PCR et le séquençage de clones d’ADNc RFXAP

sur toute la longueur des patients ont été isolés par RT-PCR et sous-clonés en vecteur pGEM-T (Promega), selon les procédures standard, et analysés pour détecter les mutations. Des mutations ont ensuite été confirmées dans l’ADN des patients et de leurs parents en étudiant des fragments d’ADN génomique amplifiés par PCR couvrant les nucléotides 116-540, comme décrit (17). La PCR a été réalisée avec le système de PCR Haute fidélité Expand (Boeh-ringer Mannheim), comme décrit (10). Le séquençage de plasmides recombinants a été réalisé à l’aide du kit de séquençage du cycle de terminaison du colorant PRISME ABI (ABI) et d’un séquenceur d’ADN Applied Biosystems. Les produits de PCR génomiques ont été directement séquencés à l’aide d’amorces de séquençage radiomarquées et d’un kit de thermo-séquénase (Amersham), et analysés sur gel de séquençage.

Détection par RT-PCR de l’expression des gènes HLA de classe II, DMB, Ii et GADPH

L’ARN cytoplasmique total a été extrait des fibroblastes induits par l’IFN-γ par la méthode du thiocyanate de guanidium (23). L’ADNc du premier brin a été synthétisé avec la transcriptase inverse du virus de la myéloblastose aviaire (AMV) (Boehringer Manneheim, SA) en utilisant 10 ng d’oligo (dT) comme amorce et 5 µg d’ARN cytoplasmique. L’amplification par PCR a été réalisée dans un volume final de 50 µl en utilisant 1/30 de l’ADNc, 1 µM de chaque amorce, 200 µM de chaque d NTP, 1,25 UI d’AmpliTaq polymerase (Perkin-Elmer, Forster City, CA) et 0,1 µCi dCTP (Amersham) dans chaque échantillon. L’ADN a été dénaturé à 94°C pendant 1 min, recuit pendant 1 min à 55°C pour détecter tous les gènes à l’exception du GADPH et de l’aDR, pour lesquels une température de recuit de 58°C a été utilisée. L’extension à 72°C a été de 1 min. Ce cycle a été répété 25 fois pour le GADPH et l’aDR et 27 fois pour les autres gènes, suivi d’un allongement de 10 min à 72°C. Des échantillons ont été électrophorés sur des gels d’acrylamide à 5% à 150 V pendant 2 h. Les gels ont été fixés et séchés avant exposition dans une boîte PhosphorImager (Dynamique moléculaire) ou sur film X-Omat (Kodak). Les séquences d’amorces oligonucléotidiques utilisées en amplification par PCR étaient : pour HLA-aDQ, -ßDQ et DMB telles que décrites par Peijnenburg (16), pour les chaînes GADPH, -aDR et Ii telles que décrites par Vedrenne et al. (24), et pour -ßDR, -aDP et -ßDP comme décrit par Hauber et al. (25).

Abréviations

Abréviations
• Cellule B

  lignée cellulaire B- lymphoblastoïde

• IFN-γ

  interféron γ

• CMH

  complexe majeur d’histocompatibilité

• RT-PCR

  réaction en chaîne de transcriptioninverse-polymérase.

Remerciements

Nous remercions particulièrement le Dr Peter van den Elsen de nous avoir permis d’inclure la lignée cellulaire ABI dans les expériences de fusion. Nous sommes reconnaissants aux Drs Andrew Cant et Mario Abinun pour les échantillons de sang et les biopsies cutanées des patients traités dans leur unité pour la BMT, et au Dr Klaus Schwarz pour nous avoir envoyé les échantillons de sang de deux patients. Nous remercions également Françoise Selz pour sa collaboration experte et E. Barras pour son excellente assistance technique.