definição genética e Molecular do grupo de Complementação D em MHC Classe II deficiência

Abstract

quatro grupos de complementação, A, B, C E D, foram descritos entre linhas celulares defeituosas na expressão coordenada dos genes MHC classe II. Estas incluem linhas celulares estabelecidas a partir de doentes afectados com deficiência em MHC classe II e linhas celulares mutantes geradas experimentalmente. O Grupo D, Em contraste com os outros grupos, foi durante muito tempo representado apenas pela linhagem celular mutante 6.1. 6. O gene responsável pelo defeito neste grupo, o RFXAP, foi clonado recentemente e descobriu-se que sofreu mutação na linha celular 6.1.6 e em três doentes. Aqui relatamos experimentos de fusão em vários novos pacientes com deficiência de classe II da HLA, completando a classificação da maioria dos pacientes conhecidos nos quatro grupos de complementação. Pacientes de cinco famílias não relacionadas foram classificados no grupo de complementação D, enquanto nove outros caem nos grupos de complementação A E B. Nenhum dos pacientes definiu um novo grupo de complementação. A correcção completa da expressão MHC de classe II foi obtida em células de doentes pertencentes ao Grupo D por transfecção com o cDNA RFXAP. Verificou-se que a região de codificação RFXAP sofreu mutações em todos os doentes. Verificou-se que as mutações eram recorrentes, uma vez que apenas foram encontradas três mutações diferentes nas oito famílias não relacionadas notificadas até à data.

introdução

a expressão do antigénio classe II MHC é rigorosamente controlada de uma forma específica da célula (1) e é essencial para as respostas imunitárias específicas do antigénio (2). Os mecanismos que controlam a transcrição de genes MHC de classe II foram estudados extensivamente, particularmente através do uso de células deficientes na expressão de classe II da HLA. Estas células são ou mutantes gerados experimentalmente, ou células de doentes afetados com deficiência de classe II MHC (3). Esta imunodeficiência primária resultante de uma expressão defeituosa dos antigénios da classe II do HLA é uma doença recessiva autossómica caracterizada por uma extrema susceptibilidade às infecções, e uma ausência de respostas celulares e humorais das células T no reconhecimento dos antigénios (4). As células dos doentes não transcrevem os genes α e β MHC classe II que codificam os isotipos DR, DQ e DP HLA (3,5). A análise da segregação Intrafamilial mostrou que a anomalia genética está localizada fora da região MHC e envolve fatores regulatórios trans-atuantes(5). Tanto as linhas celulares dos pacientes como as linhas celulares mutantes experimentais foram usadas, em experimentos de fusão somática, para avaliar o número de fatores de transcrição que eram absolutamente necessários para garantir a expressão normal MHC classe II. Foram identificados quatro grupos de complementação, A, B, C E D (6,7).

os genes responsáveis pelo defeito nos grupos A E C foram clonados por clonagem de complementação na linha celular RJ 2.5.5 (grupo a) e na linha celular SJO (Grupo C), respectivamente. O gene CIITA codifica uma proteína não-ligada ao ADN que controla tanto a expressão constitutiva como a indutível da classe II do HLA e sofre mutação em doentes do grupo A (8). O gene RFX5 codifica uma subunidade de 75 kDa do complexo RFX e sofre mutação em pacientes do grupo de complementação C (9). Um terceiro gene, RFXAP (para a proteína associada a RFX), foi clonado recentemente por Durand et al. (10). RFXAP codifica uma pequena subunidade de 36 kDa do complexo RFX, e as mutações do gene são responsáveis pelo defeito no grupo de complementação D. As proteínas RFX5 e RFXAP formam-se, juntamente com uma terceira proteína de 41 kDa, um complexo multimérico RFX que se liga à Região x box dos promotores MHC classe II (11). É possível que um gene que codifica esta terceira proteína seja mutado no grupo de complementação B, no qual o gene afetado ainda não foi identificado. A ligação do complexo RFX ao ADN depende da ligação cooperativa com pelo menos dois factores pleiotrópicos, NFY e X2BP (12-14), mas não é suficiente para a transcrição da classe II. CIITA deve combinar com RFX e os outros fatores de transcrição que se ligam às caixas X2 e Y do promotor para permitir a transcrição de genes MHC classe II.

descrevemos aqui a análise de complementação somática de 13 novos doentes com deficiência de classe II da HLA e dois doentes previamente notificados SS (15) e ABI (16), suspeitos de representar diferentes grupos de complementação. Um dos novos pacientes foi encontrado como pertencente ao grupo A e outros sete ao grupo B. No entanto, quatro novos pacientes caíram no mesmo grupo de complementação que os pacientes SS e ABI. Este último grupo foi encontrado para representar o Grupo D por análise de complementação, transfecção com o cDNA RFXAP e análise de mutação do gene RFXAP.

Resultados

Classificação dos pacientes em complementação grupos

célula Somática de fusão experimentos foram realizados utilizando células B ou fibroblastos representando complementação grupos A, B, C e D. B e células de fibroblastos estavam disponíveis apenas para o paciente ZM. A figura 1 mostra um exemplo de expressão HLA obtida em heterocaryons de ambas as células B e fibroblastos. Nos heterocareões fibroblastos, 3-10% das células HLA classe II-positivas foram detectadas 48 h após o tratamento com interferão-γ (IFN-γ). Em heterocaryons de células B, não mais de 5% de células HLA classe II-positivo pode ser detectado. A figura 2 resume os dados obtidos pelas perfusões de células somáticas, e a Tabela 2 apresenta a Classificação dos pacientes recém-estudados em relação aos dados previamente publicados (6,7). Um paciente de origem paquistanesa foi classificado no grupo a, sete pacientes foram colocados no grupo B e cinco foram classificados no Grupo D. nenhum dos pacientes pertencia ao grupo C.

Como mostra o Quadro 1, fibroblastos de quatro pacientes, ZM, AkO, ShA e ShG, complementado células representando complementação grupos A e B, mas não de complementar a SS linha celular de fibroblastos, que não tinham sido classificados (15). As células ZM B complementavam as células B dos grupos A, B E C, mas não complementavam as linhas celulares HLA classe II-negativo 6.1.6 B definindo o Grupo D. Não se obteve qualquer complementação após fusão entre os fibroblastos ZM, AkO, Sha e ShG. Além disso, nenhuma dessas linhas celulares fibroblastas, incluindo ZM, complementou a linha celular ABI (16). Assim, as células dos pacientes SS, AkO, ShA, ShG ABI e ZM pertencem ao grupo de complementação D.Correcção da expressão de classe II da HLA por transfecção com o cDNA RFXAP

Como anteriormente relatado, em experiências de transfecção transitória com o cDNA RFXAP, foi obtida uma correcção da expressão de classe II da MHC em Zm e em fibroblastos ABI (17). A figura 2 retrata a correção integral da expressão genética constitutiva da classe II de HLA nas células do paciente ZM, o único paciente para o qual estava disponível uma linha de células B, Após transfecção com o cDNA RFXAP. Em contraste, a transfecção com CIITA ou RFX5 cDNAs não restaurou a expressão de classe II do HLA; nem a transfecção com o vector vazio. Foram obtidos resultados semelhantes para a expressão MHC de classe II induzida pelo IFN-γ em fibroblastos de doentes AkO, SS e ShA (dados não apresentados).

mutações do gene RFXAP em doentes SS, AkO, ShA e ShG

cDNAs RFXAP de comprimento completo foram amplificadas pela PCR de doentes SS, AkO, ShA e ShG, conforme descrito em (10), subclonadas num vector pGEM e sequenciadas. Nos quatro doentes, foram identificadas mutações no cDNA RFXAP. Estas mutações foram então confirmadas pela sequenciação direta de produtos de PCR genômicos dos pacientes e seus pais.

na família SS, com duas crianças afetadas, foi encontrada uma deleção homozigótica de um G no nucleótido 484 (484delG) (Fig. 3). A mesma mutação foi detectada na família ZM (17). The resulting frameshift leads to an out-of-frame stop codon at nucleotide 525. Os pais foram considerados heterozigóticos para esta mutação.

na família AkO, uma substituição de um codon glutamina por um codon stop (CAG→TAG) na posição 279 do gene RFXAP foi detectada (C279X) (Fig. 4). Prevê-se que esta mutação conduza a uma proteína truncada de 52 aminoácidos. A mesma mutação foi detectada anteriormente no doente ABI (17). Os pais de AkO são heterozigóticos para esta mutação.

na família Sh, com dois primos de primeiro grau afectados ShA e ShG, foi encontrada uma inserção de sete nucleótidos ‘GCGGCG’ na posição 151 do cDNA RFXAP. Esta mutação é designada 151ins7. Representa uma duplicação da sequência de tipo selvagem abrangendo nucleótidos 144-150. Ele leva a um frameshift resultando em um codon stop no nucleotídeo 329. Ambos os doentes desta família herdaram esta mutação homozigótica(Fig. 5). Os pais de ambos os doentes eram heterozigóticos (dados não apresentados).

a expressão genética MHC classe II, DMB e II no grupo de complementação D

uma vez que a expressão residual dos genes DRA e DPB tinha sido notificada em células do doente ABI (16), a expressão genética MHC classe II foi examinada em doentes do Grupo D por RT-PCR. Foi observado um nível variável de transcrição para os genes DPA e/ou DPB em quatro dos doentes, mas não num doente de controlo do Grupo A (Fig. 6). No entanto, mesmo nas células ShG do paciente, nas quais foram detectadas transcrições DPA e DPB, não houve expressão de membrana detectável do complexo DPaß (Fig. 7). Em nenhuma das linhas celulares do doente foram detectados pelo RT-PCR (Fig. 6).

Discussão

Apesar do crescente número de pacientes examinados e o pleiotropic fatores mostrado estar envolvidos no controle da expressão de MHC classe II, o número de complementação grupos, e, portanto, fatores de mutação no MHC de classe II imunodeficiência pacientes, mantém-se em quatro (Tabela 2). Com os 13 novos pacientes com deficiência de classe II de HLA estudados neste trabalho, a maioria dos pacientes relatados foram agora classificados em grupos de complementação e nenhum define um quinto grupo de complementação. Ao todo, dos 39 pacientes de 34 famílias, há 6 no grupo de complementação a, 22 no grupo B, 3 no Grupo C e 8 no Grupo D. dois irmãos com um defeito parcial da expressão MHC classe II e com uma forma leve de imunodeficiência recentemente foram classificados em um grupo de complementação adicional (18). Estes pacientes atípicos provavelmente representam outra síndrome, uma vez que são capazes de responder à vacinação (19).

Entre os pacientes imunodeficientes classificados neste relatório, apenas com a família Kh, com dois irmãos afetados, pertence ao grupo A. Enquanto anteriormente descrito pacientes do grupo A foram de ascendência espanhola (15), estes novos casos foram de origem Paquistanesa, mostrando que CIITA mutações não são restritos a uma origem étnica. Sete dos novos pacientes entram no grupo B e são de ascendência norte-africana, italiana, turca e saudita. Ao todo, incluindo o paciente fundador do BLS1, existem 22 famílias no grupo B.

quatro novos pacientes em três famílias, juntamente com o paciente SS (15), pertencem ao Grupo D. são de ascendência norte-africana, turca e Drusa. Suas características clínicas e biológicas não diferiam de outros pacientes com deficiência de HLA. No entanto, em todos menos um, a transcrição de genes DPA e/ou DPB pode ser detectada. Foi também notificada transcrição Residual de DPA e DPB no doente ABI (16). Nos pacientes estudados neste trabalho, apesar da presença de transcrições DP, heterodímeros DPA-β maduros não foram detectados na superfície celular, talvez porque os genes Ii e DM não são expressos. Assim, não se espera nenhuma consequência funcional desta fuga no defeito, como é observado in vivo.

três linhas de evidência diferentes demonstram que estes doentes pertencem ao grupo de complementação D, ou seja, a análise da fusão de células somáticas, a transfecção das células dos doentes com cDNA RFXAP e a análise mutacional. Foram obtidos resultados inequívocos de fusão celular utilizando fibroblastos e linhas de células B, como demonstrado para o doente ZM. A ausência de complementação entre as células ZM e a linha celular 6.1.6 B, por um lado, e entre os fibroblastos Zm E SS, por outro, validou todos os outros dados de fusão, incluindo os dos fibroblastos ABI. A classificação incorrecta anterior deste doente no grupo ” e ” (16) deveu-se provavelmente à fuga da linha celular 6.1.6 utilizada e/ou a experiências de fusão realizadas através de linhagens celulares (fusões de células B-fibroblastas). Uma correção completa da expressão de classe II de HLA em células do Grupo D, e não dos outros grupos, por transfeção do cDNA RFXAP confirmado anteriormente dados de experiências de transfeção transitória (10,17). O cDNA RFXAP foi encontrado para ser modificado em pacientes SS, AKO, Sh e ShG, como também mostrado anteriormente para ZM e ABI (17).

foram encontrados três tipos de mutações recorrentes do RFXAP, ou seja, substituição, supressão e inserção (Fig. 8). Um conteúdo de CG muito elevado no gene RFXAP que conduz a erros de polimerase pode explicar a geração destas mutações (20). A transição c279x detectada no doente AKO é idêntica à mutação anteriormente detectada no doente ABI (17) e a mutação 484delG no doente SS é idêntica à detectada nos doentes DA e ZM (10,17). Em ambos os casos, prevê-se que as mutações dêem origem a uma mudança de regime e à síntese de proteínas gravemente truncadas de 52 e 136 aminoácidos, respectivamente. Uma mutação ainda não descoberta foi encontrada nos primos Sh, ou seja, uma inserção de nucleótidos duplicados 144-150:’GCGGGC’. Esta mutação também resulta em uma transformação e um produto truncado. Todas as mutações foram detectadas numa região que abrange os nucleótidos 116-540 do cDNA RFXAP, que corresponde a um único exon.

portanto, apenas três mutações diferentes do gene RFXAP foram observadas até agora em seis famílias diferentes, incluindo o paciente DA (10). A origem étnica das famílias poderia indicar uma origem ancestral destas mutações, visto que os pacientes SS, RA e ZM são de origem Norte Africana, enquanto os pacientes AKO e ABI são de ascendência turca. No entanto, notavelmente, apenas no Grupo D da deficiência de classe II da MHC foram detectadas até agora tais mutações recorrentes. No grupo a, por exemplo, apesar da alta prevalência de pacientes de ascendência espanhola (15), não foi detectado Alelo recorrente entre os diferentes pacientes (8, e B. Lisowska-Grospierre et al., publicado). Em todos os grupos de complementação, a maioria dos pacientes vem da área mediterrânica, onde os casamentos consanguíneos são frequentes.

Why RFXAP gene mutations, probably resulting in nonfunctional proteins, are associated with residual DPA/B gene transcription is not understood. Esta observação fornece evidência de uma regulação discoordenada limitada, mas significativa, do regulamento de transcrição do gene MHC classe II. Estes resultados requerem um estudo adicional para determinar um papel putativo específico do RFXAP na transcrição DRA / B, DQA/B versus DPA/B.Foram estudados os materiais e métodos

materiais e métodos

doentes

treze doentes até agora não descritos de onze famílias independentes afectadas pela imunodeficiência MHC classe II. Onze famílias foram consanguíneas. Eram de origem norte-africana (três), italiana (dois), Turca (três), Drusa (dois), Paquistanesa (dois) e saudita (um). Em todos os doentes, os antigénios de classe II da HLA não foram detectáveis na superfície celular das células B, monócitos e células T activadas. A apresentação clínica no total foi caracterizada por infecções recorrentes, diarreia grave e insucesso. A ausência de respostas humorais e celulares específicas ao antigénio foi observada em todos os doentes, e hipogamaglobulina-anemia em vários dos doentes. Neste relatório, são notificados estudos detalhados sobre as células de doentes, AkO, ShA, ShG, ZM. No caso da ZM, foram apresentados anteriormente resultados parciais (17). O paciente SS já foi descrito (15). As características da ABI do doente, incluídas em experiências de complementação somática, já foram notificadas (16).

culturas celulares

linhagens de células B foram estabelecidas a partir das células B dos doentes pela infecção pelo vírus Epstein-Barr (EBV). Os fibroblastos cutâneos dos doentes foram obtidos por biópsia cutânea e transformados com SV40, como descrito anteriormente (15). Todas as linhas celulares foram cultivadas a 37°C em 5% de CO2 em RPMI-1640 (Lifesciences Gibco BRL), suplementadas com 20% de soro fetal inactivado pelo calor. Os fibroblastos ou os seus heterocaryons foram tratados pelo IFN-γ (200 UI/ml) durante 40 h antes da análise da expressão da classe II da MHC.

imunofluorescência

anticorpo Anti-HLA-DR 20.6 (21), Bu27 anti-classe II (local de ligação, Birmingham, Reino Unido) e anticorpo anti-classe I W6/32 (ServaLab) foram utilizados. As células B foram manchadas em suspensão, enquanto os fibroblastos foram fixados com etanol antes da incubação com anticorpos, como descrito em (15). As suspensões celulares foram analisadas com um citofluorógrafo Beckton Dickinson e células fixas com um microscópio Ortoplane Leitz.

análise de complementação somática

linhas de fibroblasto e células B dos doentes recém-estabelecidos, bem como linhas de células experimentais (HVJ, ABL, SJO e 6.1.6.) de pacientes previamente classificados para grupos de complementação A, B, C E D, respectivamente, foram usados nestes experimentos. A linha celular 6.1.6 foi uma variante da classe II da classe MHC totalmente negativa selecionada pela geneticin, gentilmente fornecida por C. Alcaide (Institut Pasteur). Além disso, as experiências de fusão incluíram:: linha celular SS do paciente, representando um grupo de complementação putativa X (15), e linha celular ABI do paciente, relatada como representando o grupo e (16), gentilmente fornecida por P. van den Elsen. Heterocariões transitórios de ambos os tipos de células, células B e fibroblastos foram obtidos pelo método de electrofusão descrito em detalhes anteriormente (15). A reversão fenotípica foi testada por imunofluorescência ou pelo Northern blot 48-72 h após fusão celular. No caso dos fibroblastos, as células foram cultivadas na presença ou ausência de 200 UI/ml de IFN-γ recombinante (Genex).

Transfections

Os plasmídeos utilizados para transfeccao foram pREP4 (Invitrogen), pREP4-RFXAP e EBO-Sfi (vector vazio) ou EBO-CIITA, gentilmente fornecidos pelo V Steimle (8). As transfusões de linhas de células B e fibroblastos foram realizadas como descrito (22) com 1-10 µg de cada plasmídeo, usando um JOUAN GTH 128/a electropulsor, como descrito (15). Os transfectantes estáveis foram gerados por selecção com higromicina B (250 µg/ml; Calbiochem). Os fibroblastos transfectados foram tratados com 200 UI / ml de IFN-γ antes do ensaio para a expressão de classe II da MHC.

amplificação e sequenciação de RFXAP

Clones cDNA RFXAP de comprimento completo dos doentes foram isolados por RT-PCR e subclonados em vector pGEM-T (Promega), de acordo com procedimentos padrão, e analisados para detecção de mutações. As mutações foram então confirmadas no ADN dos doentes e dos seus pais através do estudo de fragmentos de ADN genómico amplificados pela PCR abrangendo nucleótidos 116-540, como descrito (17). A PCR foi realizada com o Expand High Fidelity PCR System (Boeh-ringer Mannheim), como descrito em (10). A sequenciação de plasmídeos recombinantes foi realizada utilizando o kit de sequenciação do ciclo do corante de PRISM ABI (ABI) e um sequenciador de DNA Biosystems aplicado. Os produtos de PCR genómicos foram sequenciados directamente através do uso de iniciadores de sequenciação radiomarcados e de um kit de Termoequenase (Amersham), e analisados num gel de sequenciação.

RT-PCR detection of HLA class II, DMB, Ii and GADPH gene expression

total cytoplasmic RNA was extracted from IFN-γ induced fibroblasts by the guanidium tiocianate method (23). O cDNA da primeira vertente foi sintetizado com transcriptase reversa do vírus da mieloblastose aviária (AMV) (Boehringer Manneheim, SA) utilizando 10 ng de oligo(dT) como iniciador e 5 µg de ARN citoplásmico. Amplificação por PCR foi realizada em um volume final de 50 µl, utilizando 1/30 do cDNA, 1 µM de cada primer, 200 µM de cada d NTP, 1.25 UI de AmpliTaq polimerase (Perkin-Elmer, Forster City, CA) e 0,1 µCi dCTP (Amersham) em cada amostra. O ADN foi desnaturado a 94°C durante 1 minuto, recozido durante 1 minuto a 55°C para detectar todos os genes, excepto GADPH e aDR, para os quais foi utilizada uma temperatura de recozimento de 58°C. A extensão a 72 ° C foi de 1 min. Este ciclo foi repetido 25 vezes para GADPH e aDR e 27 vezes para os outros genes, seguido por 10 min de alongamento a 72°C. as Amostras foram electrophoresed em 5% géis de acrilamida a 150 V por 2 h. Os géis foram corrigidos e seca antes da exposição em um PhosphorImager caixa (Dinâmica Molecular) ou X-Omat filme (Kodak). As sequências de iniciadores de oligonucleótidos utilizados na amplificação PCR foram: para HLA-aDQ, -ßDQ e DMB conforme descrito por Peijnenburg (16), para a cadeia GADPH, -aDR e Ii como descrito por Vedrenne et al. (24), e para-ßDR,- aDP e-ßDP, conforme descrito por Hauber et al. (25).

Abreviaturas

Abreviaturas
• B-célula

  linha B-lymphoblastoid célula da linha

• IFN-γ

  interferon γ

• MHC

  principal complexo de histocompatibilidade

• RT-PCR

  transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase.

agradecimentos

agradecemos especialmente ao Dr. Peter van den Elsen por nos permitir incluir a linha de células ABI em experiências de fusão. Somos gratos a Drs Andrew não pode e Mario Abinun para amostras de sangue e biópsias de pele de pacientes tratados em sua Unidade de TMO, e ao Dr. Klaus Schwarz para nos enviar as amostras de sangue de dois pacientes. Agradecemos também a Françoise Selz pela sua colaboração especializada e E. Barras pela excelente assistência técnica.