genetisk og Molekylær Definition af Komplementeringsgruppe D i MHC klasse II-mangel

abstrakt

fire komplementationsgrupper, A, B, C og D, er blevet beskrevet blandt cellelinjer, der er defekte i koordinatekspressionen af MHC klasse II-gener. Disse inkluderer cellelinjer etableret fra patienter, der er ramt af MHC klasse II-mangel og eksperimentelt genererede mutante cellelinjer. Gruppe D, i modsætning til de andre grupper, var i lang tid kun repræsenteret af 6.1.6 mutantcellelinjen. Genet, der er ansvarlig for defekten i denne gruppe, RFKSAP, blev for nylig klonet og fundet muteret i 6.1.6-cellelinjen og hos tre patienter. Her rapporterer vi fusionseksperimenter i flere nye HLA klasse II-mangelfulde patienter, der afslutter klassificeringen af størstedelen af kendte patienter i de fire komplementationsgrupper. Patienter fra fem ikke-relaterede familier blev klassificeret i komplementationsgruppe D, mens ni andre falder i komplementationsgruppe A og B. Ingen af patienterne definerede en ny komplementeringsgruppe. Fuld korrektion af MHC klasse II-ekspression blev opnået i celler fra patienter, der tilhører gruppe D ved transfektion med rfksap cDNA. Rfksap-kodningsregionen viste sig at være muteret hos alle patienter. Mutationer viste sig at være tilbagevendende, da der kun er fundet tre forskellige mutationer i de otte ikke-relaterede familier, der er rapporteret til dato.

introduktion

MHC klasse II antigenekspression styres tæt på en cellespecifik måde (1) og er essentiel for antigenspecifikke immunresponser (2). Mekanismer, der styrer transkription af MHC klasse II-gener, er blevet undersøgt grundigt, især ved anvendelse af celler mangelfuld i HLA klasse II-ekspression. Disse celler er enten eksperimentelt genererede mutanter eller celler fra patienter, der er ramt af MHC klasse II-mangel (3). Denne primære immundefekt som følge af defekt ekspression af HLA klasse II antigener er en autosomal recessiv lidelse karakteriseret ved en ekstrem modtagelighed for infektioner og fravær af cellulære og humorale T-celleresponser ved antigengenkendelse (4). Celler fra patienterne transkriberer ikke gener i klasse II, der koder for isotyperne DR, DKV og DP HLA (3,5). Intrafamilial segregeringsanalyse har vist, at den genetiske abnormitet er lokaliseret uden for MHC-regionen og involverer transvirkende regulerende faktor(er) (5). Både patientcellelinjer og eksperimentelle mutante cellelinjer blev anvendt i somatiske fusionseksperimenter til at evaluere antallet af transkriptionsfaktorer, der var absolut nødvendige for at sikre normal MHC klasse II-ekspression. Fire komplementationsgrupper blev identificeret, A, B, C og D (6,7).

de gener, der er ansvarlige for defekten i gruppe A og C, blev klonet ved komplementeringskloning i henholdsvis RJ 2.5.5-cellelinjen (gruppe A) og SJO-cellelinjen (gruppe C). CIITA-genet koder for et ikke-DNA-bindende protein, der styrer både konstitutiv og inducerbar HLA klasse II-ekspression og muteres hos gruppe A-patienter (8). Rfks5-genet koder for en 75 kDa-underenhed af RFK-komplekset og muteres hos patienter fra komplementationsgruppe C (9). Et tredje gen, Rfksap (for rfksassocieret protein), blev klonet for nylig af Durand et al. (10). Rfksap koder for en lille 36 kDa-underenhed af rfksskomplekset, og mutationer af genet er ansvarlige for defekten i komplementeringsgruppe D. rfks5-og rfksap-proteinerne danner sammen med et tredje protein på 41 kDa et multimerisk kompleks rfkssk, der binder til boksregionen af MHC klasse II-promotorer (11). Det er muligt, at et gen, der koder for dette tredje protein, muteres i komplementeringsgruppe B, hvor det berørte gen endnu ikke er identificeret. Bindingen af komplekset til DNA afhænger af kooperativ binding med mindst to pleiotropiske faktorer, NFY og 12-14, Men er ikke tilstrækkelig til klasse II-transkription. CIITA skal kombineres med transkriptionsfaktorer og de andre transkriptionsfaktorer, der binder til promotorens H2-og Y-bokse for at tillade transkription af MHC klasse II-gener.

vi beskriver her den somatiske komplementeringsanalyse af 13 nye HLA klasse II-mangelspatienter og to tidligere rapporterede patienter SS (15) og ABI (16), der mistænkes for at repræsentere forskellige komplementeringsgrupper. En af de nye patienter blev fundet at tilhøre gruppe A og syv andre til gruppe B. imidlertid faldt fire nye patienter i samme komplementationsgruppe som patienter SS og ABI. Den sidstnævnte gruppe viste sig at repræsentere Gruppe D ved komplementeringsanalyse, transfektion med rfksap cDNA og mutationsanalyse af rfksap-genet.

resultater

klassificering af patienter i komplementationsgrupper

somatiske cellefusionseksperimenter blev udført under anvendelse af enten B-celler eller fibroblaster, der repræsenterer komplementationsgrupper A, B, C og D. både B-celler og fibroblaster var kun tilgængelige for patient-MS. Figur 1 viser et eksempel på HLA-ekspression opnået i heterokaryoner af både B-celler og fibroblaster. I fibroblast heterokaryoner blev 3-10% af HLA klasse II-positive celler detekteret 48 timer efter behandling med interferon-kar (IFN-kar). I B-celle heterokaryoner kunne ikke mere end 5% HLA klasse II-positive celler detekteres. Figur 2 opsummerer de data, der er opnået ved somatiske cellefusioner, og tabel 2 giver klassificeringen af de nyligt undersøgte patienter med hensyn til tidligere offentliggjorte data (6,7). En patient af pakistansk oprindelse blev klassificeret i gruppe A, syv patienter blev placeret i gruppe B og fem blev klassificeret i gruppe D. Ingen af patienterne tilhørte gruppe C.

som Tabel 1 viser, supplerede fibroblaster fra fire patienter, HM, AkO, ShA og ShG celler, der repræsenterede komplementationsgrupper A og B, men komplementerede ikke SS fibroblastcellelinjen, som ikke var klassificeret (15). B-celler supplerede B-celler fra gruppe A, B og C, men komplementerede ikke den HLA-klasse II-negative 6.1.6 B-cellelinie, der definerede gruppe D. ingen komplementering blev opnået efter fusion mellem HM, AkO, Sha og ShG fibroblaster. Derudover supplerede ingen af disse fibroblastcellelinjer, herunder HM, cellelinjen ABI (16). Således tilhører celler fra patienter SS, AkO, ShA, ShG ABI og HM alle komplementationsgruppe D.

korrektion af HLA klasse II-ekspression ved transfektion med rfksap cDNA

som tidligere rapporteret blev der i transiente transfektionsforsøg med rfksap cDNA opnået en korrektion af MHC klasse II-ekspression i HM-og ABI-fibroblaster (17). Figur 2 viser fuld korrektion af konstitutiv HLA klasse II-genekspression i celler fra patient med HM, den eneste patient, for hvem en B-cellelinie var tilgængelig, efter transfektion med rfksap cDNA. I modsætning hertil gendannede transfektion med CIITA eller rfks5 cDNA ‘ er ikke HLA klasse II-ekspression; heller ikke transfektion med den tomme vektor. Lignende resultater blev opnået for IFN-karrus-induceret MHC klasse II-ekspression i fibroblaster fra patienter AkO, SS og ShA (data ikke vist).

mutationer af RFKSAP-genet hos patienter SS, AkO, ShA og ShG

cDNA ‘ er i fuld længde blev amplificeret ved PCR fra patienter SS, AkO, ShA og ShG, som beskrevet (10), subkloneret i en pGEM-vektor og sekventeret. Hos alle fire patienter blev mutationer i rfksap cDNA identificeret. Disse mutationer blev derefter bekræftet ved direkte sekventering af genomiske PCR-produkter fra patienterne og deres forældre.

i familie SS, med to berørte børn, blev der fundet en homosygøs deletion af et G ved nukleotid 484 (484delg) (Fig. 3). Den samme mutation blev påvist i familie HM (17). Den resulterende frameshift fører til et stopkodon uden for rammen ved nukleotid 525. Forældrene viste sig at være heterosygøse for denne mutation.

i familie AkO blev der påvist en substitution af et glutaminkodon med et stopkodon (CAG-Kart-TAG) i position 279 af rfksap-genet (C279H) (Fig. 4). Denne mutation forventes at føre til et afkortet protein på 52 aminosyrer. Den samme mutation er blevet påvist tidligere i patient ABI (17). Forældrene til AkO er heterosygøse for denne mutation.

i familie Sh, med to berørte første grad fætre ShA og ShG, blev der fundet en indsættelse af syv nukleotider ‘GCGGGCG’ i position 151 i rfksap cDNA. Denne mutation er betegnet 151ins7. Det repræsenterer en duplikering af vildtypesekvensen, der spænder over nukleotider 144-150. Det fører til en frameshift, hvilket resulterer i et stopkodon ved nukleotid 329. Begge patienter fra denne familie arvede denne homosygøse mutation (Fig. 5). Forældrene til begge patienter var heterosygøse (data ikke vist).

MHC klasse II, DMB og Ii kæde genekspression i komplementeringsgruppe D

da der var rapporteret restekspression af DRA-og DPB-gener i celler fra patient ABI (16), blev MHC klasse II-genekspression undersøgt hos Gruppe D-patienter ved RT-PCR. Et variabelt transkriptionsniveau blev observeret for DPA-og/eller DPB-gener hos fire af patienterne, men ikke hos en kontrolpatient fra gruppe A (Fig. 6). Selv i Patient ShG-celler, hvor både DPA-og DPB-transkripter blev detekteret, var der imidlertid ingen påviselig membranekspression af DPA-Kurp-komplekset (Fig. 7). I ingen af patientcellelinjerne blev HLA DR, DKV, DMB eller Ii-kædegen mRNA detekteret ved RT-PCR (Fig. 6).

Diskussion

på trods af det stigende antal undersøgte patienter og de pleiotropiske faktorer, der er vist at være involveret i kontrollen af MHC klasse II-ekspression, forbliver antallet af komplementeringsgrupper og derfor faktorer muteret hos MHC klasse II-immundefektpatienter på fire (tabel 2). Med de 13 nye HLA klasse II-mangelfulde patienter, der er undersøgt i dette arbejde, er størstedelen af de rapporterede patienter nu klassificeret i komplementeringsgrupper, og ingen definerer en femte komplementeringsgruppe. I alt er der af de 39 patienter fra 34 familier 6 i komplementationsgruppe a, 22 i gruppe B, 3 i gruppe C og 8 i gruppe D. To brødre med en delvis defekt af MHC klasse II-ekspression og med en mild form for immundefekt blev for nylig klassificeret i en yderligere komplementeringsgruppe (18). Disse atypiske patienter repræsenterer sandsynligvis et andet syndrom, da de er i stand til at reagere på vaccination (19).

blandt de immunodeficiente patienter, der er klassificeret i denne rapport, tilhører kun familie Kh med to berørte søskende gruppe A. Mens tidligere beskrevne gruppe A-patienter har været af spansk afstamning (15), var disse nye tilfælde af pakistansk oprindelse, hvilket viste, at CIITA-mutationer ikke er begrænset til en etnisk oprindelse. Syv af de nye patienter falder i gruppe B og er af nordafrikansk, Italiensk, Tyrkisk og Saudiarabisk afstamning. I alt, inklusive bls1-grundlæggerpatienten, er der 22 familier i gruppe B.

fire nye patienter i tre familier sammen med patient SS (15) falder i gruppe D. de er af nordafrikansk, Tyrkisk og drusisk afstamning. Deres kliniske og biologiske egenskaber adskiller sig ikke fra andre patienter med HLA-mangel. I alle undtagen en kunne transkription af DPA-og/eller DPB-gener imidlertid påvises. Resterende DPA-og DPB-transkription blev også rapporteret hos patient ABI (16). Hos de patienter, der blev undersøgt i dette arbejde, blev der på trods af tilstedeværelsen af DP-transkripter ikke påvist modne DPA-kurr heterodimerer på celleoverfladen, måske fordi Ii-og DM-generne ikke udtrykkes. Således kan der ikke forventes nogen funktionelle konsekvenser af denne lækage i defekten, som det faktisk observeres in vivo.

tre forskellige beviser viser, at disse patienter tilhører komplementationsgruppe D, dvs.somatisk cellefusions analyse, transfektion af patienternes celler med rfksap cDNA og mutationsanalyse. Entydige cellefusions-resultater blev opnået ved anvendelse af både fibroblaster og B-cellelinjer, som påvist for patienten. Fraværet af komplementering mellem celler og cellelinjen 6.1.6 B på den ene side og mellem fibroblaster og SS på den anden side validerede alle andre fusionsdata, inklusive ABI-fibroblasternes. Tidligere fejlklassificering af denne patient i gruppe ‘E’ (16) skyldtes sandsynligvis lækagen af den anvendte 6.1.6 cellelinie og/eller fusionsforsøg udført på tværs af cellelinier (B-fibroblastcellefusioner). En fuldstændig korrektion af HLA klasse II-ekspression i celler fra gruppe D og ikke fra de andre grupper ved transfektion af cDNA bekræftede tidligere rapporterede data fra transiente transfektionsforsøg (10,17). CDNA viste sig at være muteret hos patienter SS, AKO, Sh og ShG, som også tidligere vist for HM og ABI (17).

tre typer tilbagevendende mutationer af RFKSAP blev fundet, dvs.substitution, deletion og indsættelse (Fig. 8). Et meget højt CG-indhold i RFKSAP-genet, der fører til polymerasefejl, kunne redegøre for dannelsen af disse mutationer (20). C279-overgangen påvist i patient AKO er identisk med den mutation, der tidligere blev påvist i patient ABI (17), og 484delg-mutationen i patient SS er identisk med den, der blev påvist hos patienter DA og HM (10,17). I begge tilfælde forventes mutationerne at give anledning til en frameshift og til syntesen af stærkt trunkerede proteiner på henholdsvis 52 og 136 aminosyrer. En tidligere uopdaget mutation blev fundet hos SH-kusinerne, dvs.en indsættelse af duplikerede nukleotider 144-150: ‘GCGGGC’. Denne mutation resulterer også i en frameshift og et afkortet produkt. Alle mutationer blev påvist inden for en region, der spænder over nukleotider 116-540 af rfksap cDNA, hvilket svarer til en enkelt ekson.

derfor er der hidtil kun observeret tre forskellige mutationer af rfksap-genet i seks forskellige familier, herunder patient DA (10). Familiernes etniske oprindelse kunne indikere en forfædres oprindelse af disse mutationer, da patienter SS, RA og SM er af nordafrikansk oprindelse, mens patienter AKO og ABI er af tyrkisk afstamning. Imidlertid er bemærkelsesværdigt kun i gruppe D af MHC klasse II-manglen sådanne tilbagevendende mutationer blevet påvist hidtil. I gruppe A, for eksempel på trods af en høj forekomst af patienter af spansk afstamning (15), er der ikke påvist nogen tilbagevendende allel blandt de forskellige patienter (8 Og B., ikke offentliggjort). I alle komplementationsgrupper kommer de fleste patienter fra det Mediterreneanske område, hvor sammenhængende ægteskaber er hyppige.

hvorfor genmutationer, der sandsynligvis resulterer i ikke-funktionelle proteiner, er forbundet med resterende DPA/B-gentranskription, forstås ikke. Denne observation giver bevis for en begrænset, men signifikant dyskoordinatregulering af MHC klasse II gentranskriptionsregulering. Disse resultater kræver yderligere undersøgelse for at bestemme en formodet specifik rolle af RFKSAP i DRA/B, DKA/B versus DPA/B transkription.

materialer og metoder

patienter

tretten hidtil ubeskrevne patienter fra elleve ikke-relaterede familier, der er ramt af MHC klasse II-immundefekt, blev undersøgt. Elleve familier var sammenhængende. De var af nordafrikansk (tre), italiensk (to), Tyrkisk (tre), drusere (to), Pakistansk (to) og Saudiarabisk (en) oprindelse. Hos alle patienter var HLA klasse II antigener ikke detekterbare på celleoverfladen af B-celler, monocytter og aktiverede T-celler. Klinisk præsentation i all var karakteriseret ved tilbagevendende infektioner, svær diarre og manglende trivsel. Fraværet af antigen-specifikke humorale og cellulære reaktioner blev observeret hos alle og hypogammaglobulin-aæmi hos flere af patienterne. I denne rapport rapporteres detaljerede undersøgelser af cellerne hos patienter, AkO, ShA, ShG, HM. Der er tidligere blevet fremlagt delvise resultater (17). Patient SS er allerede beskrevet (15). Karakteristika for patient ABI, inkluderet i somatiske komplementeringsforsøg, er allerede rapporteret (16).

cellekultur

B-cellelinjer blev etableret fra patienters B-celler ved Epstein-Barr virus (EBV) infektion. Patienternes hudfibroblaster blev opnået ved hudbiopsi og transformeret med SV40 som beskrevet tidligere (15). Alle cellelinjer blev dyrket ved 37 kg C i 5% CO2 i RPMI-1640 (Gibco BRL Lifesciences) suppleret med 20% varmeinaktiveret føtal kalveserum. Fibroblaster eller deres heterokaryoner blev behandlet af IFN-kur(200 IE/ml) i 40 timer før analyse af MHC klasse II-ekspression.

immunofluorescens

Anti-HLA-DR antistof 20, 6 (21), Anti-klasse II Bu27 (bindingsstedet, Birmingham, UK) og anti-klasse i antistof V6/32 (ServaLab) blev anvendt. B-celler blev farvet i suspension, mens fibroblaster blev fikseret med ethanol før inkubation med antistoffer, som beskrevet (15). Cellesuspensioner blev analyseret med en Beckton Dickinson cytofluorograf og faste celler med et Ortoplanmikroskop.

somatisk komplementeringsanalyse

Fibroblast-og B-cellelinjer fra de nyetablerede patienter samt eksperimentelle cellelinjer (HVJ, ABL, SJO og 6.1.6.) fra patienter, der tidligere var klassificeret til komplementeringsgrupper A, B, C og D, blev anvendt i disse forsøg. 6.1.6-cellelinjen var en geneticinvalgt fuldt negativ MHC klasse II-variant, venligt leveret af C. Alcaide (Institut Pasteur). Derudover omfattede fusionseksperimenter: patient SS cellelinje, der repræsenterer en formodet komplementeringsgruppe h (15) og patient ABI cellelinje, rapporteret at repræsentere gruppe E (16), venligt leveret af P. van den Elsen. Transiente heterokaryoner af begge celletyper, B-celler og fibroblaster blev opnået ved elektrofusionsmetoden beskrevet detaljeret tidligere (15). Fænotypisk reversion blev testet ved immunofluorescens eller ved northern blot 48-72 timer efter cellefusion. I tilfælde af fibroblaster blev cellerne dyrket i nærvær eller fravær af 200 IE/ml rekombinant IFN-kar (Geneks).

Transfektioner

plasmiderne, der blev anvendt til transfektion, var pREP4 (Invitrogen), pREP4-RFKSAP og EBO-SFI (tom vektor) eller EBO-CIITA, venligt leveret af V Steimle (8). Transfektioner af B-cellelinjer og fibroblaster blev udført som beskrevet (22) med 1-10-Gog af hvert plasmid under anvendelse af en Jouan GTH 128/en elektropulser som beskrevet (15). Stabile transfektanter blev genereret ved selektion med hygromycin B (250 liter/ml; Calbiochem). Transfekterede fibroblaster blev behandlet med 200 IE/ml IFN-Chr før testning for MHC klasse II-ekspression.

PCR-amplifikation og sekventering af rfksap

cDNA-kloner i fuld længde fra patienter blev isoleret ved RT-PCR og subkloneret i Pgem-t-vektor (Promega) i henhold til standardprocedurer og analyseret for mutationer. Mutationer blev derefter bekræftet i DNA fra patienter og deres forældre ved at studere PCR-amplificerede genomiske DNA-fragmenter, der spænder over nukleotider 116-540, som beskrevet (17). PCR blev udført med ekspandere high Fidelity PCR-System (Boeh-ringer Mannheim), som beskrevet (10). Sekventering af rekombinante plasmider blev udført under anvendelse af ABI PRISM dye terminator cycle sekventering kit (ABI) og en anvendt Biosystems DNA-sekvensator. Genomiske PCR-produkter blev cyklussekventeret direkte ved hjælp af radiomærkede sekventeringsprimere og et Termosekvenasesæt (Amersham) og analyseret på en sekventeringsgel.

RT-PCR-detektion af HLA-klasse II, DMB, Ii og GADPH-genekspression

Total cytoplasmatisk RNA blev ekstraheret fra IFN-Kerra-inducerede fibroblaster ved guanidium-thiocyanatmetoden (23). Første streng cDNA blev syntetiseret med aviær myeloblastose-virus (AMV) revers transkriptase (Boehringer Manneheim, SA) under anvendelse af 10 ng oligo(dT) som en primer og 5 larg af cytoplasmatisk RNA. PCR-amplifikation blev udført i et slutvolumen på 50 liter ved anvendelse af 1/30 af cDNA ‘ en, 1 liter af hver primer, 200 liter af hver d NTP, 1,25 IE Amplitak polymerase (Perkin-Elmer, Forster City, CA) og 0,1 liter dctp (Amersham) i hver prøve. DNA ‘ et blev denatureret ved 94 liter C i 1 min, udglødet i 1 minutter ved 55 liter C for at detektere alle gener undtagen GADPH og aDR, for hvilken en 58 liter liter C udglødningstemperatur blev anvendt. Forlængelse ved 72 kr. var i 1 min. Denne cyklus blev gentaget 25 gange for GADPH og aDR og 27 gange for de andre gener, efterfulgt af 10 min forlængelse ved 72 liter C. prøver blev elektroforeseret på 5% acrylamidgeler ved 150 V i 2 timer. geler blev fikseret og tørret før eksponering i en PhosphorImager-kasse (molekylær dynamik) eller til K-omat-film (Kodak). Sekvenserne af oligonukleotidprimere anvendt i PCR-amplifikation var: for HLA-ADK, – DMB og DMB som beskrevet af Peijnenburg (16), for GADPH,- aDR og Ii kæde som beskrevet af Vedrenne et al. (24), og for-krishdr,- aDP og-krishdp som beskrevet af Hauber et al. (25).

forkortelser

forkortelser
• B-celle

  linje B-lymfoblastoidcellelinie

• IFN-karrus

  interferon-karrus

• MHC

  større histokompatibilitetskompleks

• RT-PCR

  revers transkrip-tion-polymerasekædereaktion.

anerkendelser

vi takker specielt DRs Peter van den Elsen for at have tilladt os at inkludere ABI-cellelinjen i fusionseksperimenter. Vi er taknemmelige over for Dr. Cant og Mario Abinun for blodprøver og hudbiopsier fra patienter, der er behandlet i deres enhed for BMT, og over for Dr. Klaus for at have sendt os blodprøverne fra to patienter. Vi takker også for hendes ekspertsamarbejde og E. Barras for fremragende teknisk assistance.