Genetisk Og Molekylær Definisjon Av Komplementasjonsgruppe D I MHC KLASSE II Mangel

Abstrakt

Fire komplementasjonsgrupper, A, B, C Og D, har blitt beskrevet blant cellelinjer som er defekte i KOORDINATUTTRYKKET AV MHC KLASSE II-gener. Disse inkluderer cellelinjer etablert fra pasienter berørt MED MHC KLASSE II mangel og eksperimentelt genererte mutantcellelinjer. Gruppe D, i motsetning til de andre gruppene, var i lang tid representert bare av 6.1.6 mutantcellelinjen. Genet som er ansvarlig FOR defekten I DENNE gruppen, RFXAP, ble nylig klonet og funnet å være mutert i 6.1.6 cellelinjen og hos tre pasienter. Her rapporterer vi fusjonsforsøk i flere nye HLA KLASSE II-mangelfulle pasienter, og fullfører klassifiseringen av flertallet av kjente pasienter i de fire komplementgruppene. Pasienter fra fem ikke-relaterte familier ble klassifisert I komplementgruppe D, mens ni andre faller inn i komplementgruppe a og B. Ingen av pasientene definerte en ny komplementasjonsgruppe. FULL korreksjon AV MHC klasse II-uttrykk ble oppnådd i celler fra pasienter tilhørende gruppe D ved transfeksjon MED RFXAP cDNA. RFXAP-kodingsområdet ble funnet å være mutert hos alle pasienter. Mutasjoner ble funnet å være tilbakevendende siden bare tre forskjellige mutasjoner har blitt funnet i de åtte urelaterte familier rapportert til dags dato.

Innledning

MHC klasse II antigen uttrykk er tett kontrollert i en celle-spesifikk måte (1) og er avgjørende for antigen-spesifikke immunresponser (2). Mekanismer som styrer transkripsjon AV MHC klasse II-gener har blitt studert grundig, spesielt ved bruk av celler som er mangelfull I HLA KLASSE II-uttrykk. Disse cellene er enten eksperimentelt genererte mutanter, eller celler fra pasienter som er berørt MED MHC KLASSE II mangel (3). Denne primære immunsvikt som følge av defekte ekspresjon AV hla klasse II antigener er en autosomal recessiv lidelse preget av en ekstrem mottakelighet for infeksjoner, og et fravær av cellulære Og humorale t-cellerespons ved antigengjenkjenning (4). Celler fra pasientene transkriberer ikke α og β MHC KLASSE II-gener som koder FOR isotypene dr, DQ OG DP HLA (3,5). Intrafamilial segregeringsanalyse har vist at den genetiske abnormiteten er lokalisert utenfor MHC-regionen og involverer transvirkende reguleringsfaktor (er) (5). Både pasientcellelinjer og eksperimentelle mutantcellelinjer ble brukt i somatiske fusjonsforsøk for å evaluere antall transkripsjonsfaktorer som var absolutt nødvendige for å sikre normal MHC klasse II-uttrykk. Fire komplementasjonsgrupper ble identifisert, A, B, C og D (6,7).

genene som var ansvarlige for defekten i gruppe a og C ble klonet ved komplement kloning i henholdsvis rj 2.5.5 cellelinjen (gruppe a) og SJO cellelinjen (gruppe C). CIITA-genet koder for et ikke-DNA-bindende protein som styrer både konstitutivt og induktivt hla klasse II-uttrykk og er mutert i Gruppe a-pasienter (8). RFX5-genet koder for en 75 kDa-underenhet AV RFX-komplekset og er mutert hos pasienter Fra komplementasjonsgruppe C (9). ET tredje gen, RFXAP (FOR RFX-assosiert protein), ble klonet nylig Av Durand et al. (10). RFXAP koder for en liten 36 kDa-underenhet AV RFX-komplekset, og mutasjoner av genet er ansvarlige for defekten i komplementasjonsgruppe D. RFX5-og RFXAP-proteinene danner sammen med et tredje protein på 41 kDa, et multimerisk kompleks RFX som binder Seg Til x-boksregionen AV MHC KLASSE II-promotorer (11). Det er mulig at et gen som koder for dette tredje proteinet, er mutert I komplementasjonsgruppe B, der det berørte genet ennå ikke er identifisert. Bindingen AV RFX-komplekset til DNA avhenger av kooperativ binding med minst to pleiotropiske faktorer, NFY og X2BP (12-14), men er ikke tilstrekkelig for klasse II transkripsjon. CIITA må kombineres MED RFX og de andre transkripsjonsfaktorene som binder Seg Til x2-og Y-boksene til promotoren for å tillate transkripsjon AV MHC KLASSE II-gener.

vi beskriver her den somatiske komplementasjonsanalysen av 13 nye hla klasse II-mangelpasienter og to tidligere rapporterte PASIENTER SS (15) OG ABI (16), mistenkt for å representere ulike komplementasjonsgrupper. En av de nye pasientene ble funnet å tilhøre gruppe A og syv andre til gruppe B. fire nye pasienter falt imidlertid inn i samme komplementgruppe som PASIENTER SS og ABI. Sistnevnte gruppe ble funnet å representere gruppe D ved komplementasjonsanalyse, transfeksjon MED RFXAP cDNA og mutasjonsanalyse AV RFXAP-genet.

Resultater

Klassifisering av pasienter i komplementasjonsgrupper

somatiske cellefusjonsforsøk ble utført ved bruk av Enten b-celler eller fibroblaster som representerer komplementasjonsgrupper A, B, C og D. Både B-celler og fibroblaster var kun tilgjengelig for PASIENT ZM. Figur 1 viser et eksempel PÅ hla-uttrykk oppnådd i heterokaryoner av Både B-celler og fibroblaster. I fibroblast heterokaryoner ble 3-10% AV HLA klasse II-positive celler påvist 48 timer etter behandling med interferon-γ (IFN-γ). I B-celle heterokaryoner kunne ikke MER enn 5% HLA klasse II-positive celler detekteres. Figur 2 oppsummerer data oppnådd ved somatiske cellefusjoner, Og Tabell 2 gir klassifisering av de nylig studerte pasientene med hensyn til tidligere publiserte data (6,7). En Pasient Av Pakistansk opprinnelse ble klassifisert I Gruppe A, syv pasienter ble plassert I gruppe B og fem ble klassifisert I gruppe D. Ingen av pasientene tilhørte gruppe C.

som Tabell 1 viser, fibroblaster fra fire pasienter, ZM, AkO, ShA Og ShG, supplerte celler som representerer komplementasjonsgruppe a og B, men komplementerte IKKE ss-fibroblastcellelinjen, som ikke var klassifisert (15). ZM B-celler komplementerte B-celler fra gruppe a, B og C, men komplementerte IKKE HLA klasse II-negativ 6.1.6 b cellelinje som definerte gruppe D. ingen komplementering ble oppnådd etter fusjon MELLOM zm, AkO, Sha og ShG fibroblaster. I tillegg kompletterte ingen av disse fibroblastcellelinjene, inkludert ZM, cellelinje ABI (16). Dermed tilhører celler FRA PASIENTER SS, AkO, ShA, ShG ABI OG ZM alle komplementeringsgruppe D.

Korreksjon AV hla klasse II uttrykk ved transfeksjon MED RFXAP cDNA

som tidligere rapportert, i transient transfeksjon eksperimenter MED RFXAP cDNA, en korreksjon AV MHC klasse II uttrykk ble oppnådd I zm og ABI fibroblaster (17). Figur 2 viser full korreksjon AV konstitutiv hla klasse II genuttrykk i celler fra pasient ZM, den eneste pasienten For Hvem En b-cellelinje var tilgjengelig, etter transfeksjon MED RFXAP cDNA. I motsetning, transfeksjon MED CIITA ELLER RFX5 cDNAs ikke gjenopprette hla klasse II uttrykk; heller ikke transfeksjon med den tomme vektoren. Tilsvarende resultater ble oppnådd FOR IFN-γ-indusert MHC klasse II uttrykk i fibroblaster fra pasienter AkO, SS og ShA (data ikke vist).

Mutasjoner AV RFXAP-genet hos PASIENTER SS, AkO, ShA Og ShG

FULL lengde RFXAP cdnaer ble forsterket MED PCR fra pasienter SS, AkO, ShA og ShG, som beskrevet (10), subklonert i en pgem-vektor og sekvensert. Hos alle fire pasientene ble mutasjoner i RFXAP cDNA identifisert. Disse mutasjonene ble deretter bekreftet ved direkte sekvensering av genomiske PCR-produkter fra pasientene og deres foreldre.

i familien SS, med to berørte barn, ble det funnet en homozygot sletting Av En G ved nukleotid 484 (484delG) (Fig . 3). Den samme mutasjonen ble påvist i familien ZM (17). Den resulterende frameshift fører til en out-of-frame stopp kodon på nukleotid 525. Foreldrene ble funnet å være heterozygote for denne mutasjonen.

i familien AkO ble det påvist en substitusjon av et glutaminkodon med et stoppkodon (CAG→TAG) i posisjon 279 AV RFXAP-genet (C279X) (Fig. 4). Denne mutasjonen forventes å føre til et avkortet protein av 52 aminosyrer. Den samme mutasjonen er tidligere påvist hos PASIENT ABI (17). Foreldrene Til AkO er heterozygote for denne mutasjonen.

i familie Sh, med to berørte første grad fettere ShA Og ShG, ble det funnet en innsetting av syv nukleotider ‘GCGGGCG’ i posisjon 151 AV RFXAP cDNA. Denne mutasjonen er betegnet 151ins7. Det representerer en duplisering av wild – type-sekvensen som spenner over nukleotider 144-150. Det fører til en frameshift som resulterer i et stoppkodon ved nukleotid 329. Begge pasientene fra denne familien arvet denne homozygote mutasjonen (Fig. 5). Foreldrene til begge pasientene var heterozygote (data ikke vist).

MHC klasse II, DMB Og Ii kjede genuttrykk i komplementasjonsgruppe D

siden restuttrykk AV DRA og dpb gener hadde blitt rapportert i celler FRA PASIENT ABI (16), BLE MHC klasse II genuttrykk undersøkt HOS GRUPPE d pasienter VED RT-PCR. Et variabelt transkripsjonsnivå ble observert FOR dpa-og / eller dpb-gener hos fire av pasientene, men ikke hos en kontrollpasient fra gruppe A (Fig. 6). Selv i pasient shg-celler, hvor BÅDE DPA – og DPB-transkripsjoner ble detektert, var det imidlertid ikke detekterbart membranuttrykk Av dpaß-komplekset (Fig. 7). I ingen av pasientcellelinjene ble HLA DR, DQ, DMB eller Ii kjede genet mRNA detektert AV RT-PCR (Fig . 6).

Diskusjon

Til tross for det økende antall undersøkte pasienter og de pleiotrope faktorene som er vist å være involvert i KONTROLLEN AV MHC klasse II-uttrykk, forblir antall komplementasjonsgrupper, og derfor faktorer mutert hos MHC KLASSE II immunsviktpasienter, på fire (Tabell 2). Med de 13 nye HLA klasse II-mangelfulle pasientene som ble studert i dette arbeidet, har flertallet av rapporterte pasienter nå blitt klassifisert i komplementasjonsgrupper, og ingen definerer en femte komplementasjonsgruppe. Til sammen av de 39 pasientene fra 34 familier er det 6 i komplementgruppe A, 22 i gruppe B, 3 i Gruppe C og 8 i gruppe D. To brødre med delvis DEFEKT AV MHC klasse II-uttrykk og med mild form for immundefekt ble nylig klassifisert i en ekstra komplementasjonsgruppe (18). Disse atypiske pasientene representerer sannsynligvis et annet syndrom, siden de er i stand til å respondere på vaksinasjon (19).

blant de immundefekte pasientene som er klassifisert i denne rapporten, tilhører bare familie Kh, med to berørte søsken, gruppe a. mens tidligere beskrevne gruppe a-pasienter har vært av spansk avstamning (15), var disse nye tilfellene Av Pakistansk opprinnelse, og viste at CIITA-mutasjoner ikke er begrenset til en etnisk opprinnelse. Syv av de nye pasientene faller Inn i gruppe B og er Av Nordafrikansk, italiensk, tyrkisk og Saudiarabisk avstamning. Til sammen, inkludert BLS1 founder-pasienten, er det 22 familier i gruppe B.

Fire nye pasienter i tre familier, sammen med PASIENT SS (15), faller Inn i gruppe D. de er Av Nordafrikansk, tyrkisk og Drusisk avstamning. Deres kliniske og biologiske egenskaper var ikke forskjellige fra andre hla-mangelfulle pasienter. Men i alt annet enn en, kan transkripsjon AV dpa-og/eller DPB-gener detekteres. Residual dpa og dpb transkripsjon ble også rapportert i PASIENT ABI (16). Hos pasientene som ble studert i dette arbeidet, til tross for TILSTEDEVÆRELSEN AV DP-transkripsjoner, ble ikke modne dpa-β heterodimerer påvist på celleoverflaten, kanskje fordi Ii-og DM-gener ikke er uttrykt. Dermed kan ingen funksjonelle konsekvenser forventes fra denne lekkasjen i defekten, som det faktisk observeres in vivo.

Tre ulike bevislinjer viser At disse pasientene tilhører komplementasjonsgruppe D, dvs. somatisk cellefusjonsanalyse, transfeksjon av pasientcellene MED RFXAP cDNA og mutasjonsanalyse. Entydige cellefusjonsresultater ble oppnådd ved bruk av både fibroblaster og b-cellelinjer, som vist for PASIENT ZM. Fraværet av komplementering MELLOM ZM-celler og 6.1.6 b-cellelinjen, på den ene siden, og MELLOM zm og SS-fibroblaster, på den annen side, validerte alle andre fusjonsdata, inkludert DE AV ABI-fibroblastene. Tidligere feilklassifisering av denne pasienten i Gruppe E (16) skyldtes sannsynligvis lekkasjen av 6.1.6-cellelinjen som ble brukt og/eller til fusjonsforsøk utført over cellelinjer (b-fibroblastcellefusjoner). En full korreksjon AV hla klasse II uttrykk i celler fra gruppe D, og ikke fra de andre gruppene, ved transfeksjon AV RFXAP cDNA bekreftet tidligere rapporterte data fra transient transfeksjon eksperimenter (10,17). RFXAP cDNA ble funnet å være mutert hos PASIENTER SS, AKO, Sh og ShG, som også tidligere vist FOR ZM OG ABI (17).

Tre typer tilbakevendende mutasjoner AV RFXAP ble funnet, dvs. substitusjon, sletting og innsetting (Fig. 8). Et meget høyt CG-innhold i RFXAP-genet som fører til polymerasefeil kan utgjøre genereringen av disse mutasjonene (20). C279X-overgangen påvist hos PASIENT AKO er identisk med mutasjonen som tidligere ble påvist HOS PASIENT ABI (17), og 484delg-mutasjonen i PASIENT SS er identisk med den som ble påvist HOS PASIENTER DA OG ZM (10,17). I begge tilfeller forventes mutasjonene å gi opphav til en frameshift og til syntesen av alvorlig avkortede proteiner av henholdsvis 52 og 136 aminosyrer. En tidligere uoppdaget mutasjon ble funnet i Sh-fetterne, dvs. en innsetting av dupliserte nukleotider 144-150: ‘GCGGGC’. Denne mutasjonen resulterer også i en rammeskift og et avkortet produkt. Alle mutasjoner ble påvist i et område som spenner over nukleotider 116-540 AV RFXAP cDNA, som tilsvarer en enkelt ekson.

derfor er det hittil bare observert tre forskjellige mutasjoner AV RFXAP-genet i seks forskjellige familier, inkludert PASIENT DA (10). Den etniske opprinnelsen til familiene kan indikere en forfedre opprinnelse av disse mutasjonene siden pasientene SS, RA og ZM er Av Nordafrikansk opprinnelse, mens pasientene AKO og ABI er av tyrkisk avstamning. Men bemerkelsesverdig, bare i GRUPPE D AV MHC KLASSE II mangel har slike tilbakevendende mutasjoner blitt påvist så langt. I gruppe A, for eksempel, til tross for en høy forekomst av pasienter med spansk avstamning (15), er det ikke påvist residiverende allel blant de forskjellige pasientene (8, Og B. Lisowska-Grospierre et al., upublisert). I alle komplementasjonsgrupper kommer de fleste pasientene fra Middelhavet, hvor consanguineous ekteskap er hyppige.

HVORFOR RFXAP-genmutasjoner, som sannsynligvis resulterer i ikke-funksjonelle proteiner, er assosiert med gjenværende dpa/B-gentranskripsjon, er ikke forstått. Denne observasjonen gir bevis for en begrenset, men signifikant dyskoordinat regulering AV MHC klasse II gentranskripsjon regulering. Disse resultatene krever videre studier for å bestemme EN antatt spesifikk rolle RFXAP i DRA/ B, DQA/B versus dpa / B transkripsjon.

Materialer Og Metoder

Pasienter

Tretten hittil ubeskrevne pasienter fra elleve ubeslektede familier med MHC klasse II immunsvikt ble studert. Elleve familier var consanguineous. De var Av Nordafrikansk (tre), italiensk (to), tyrkisk (tre), Drusere (to), Pakistansk (to) og Saudiarabisk (En) opprinnelse. Hos alle pasienter var hla klasse II antigener ikke detekterbare på celleoverflaten Av B-celler, monocytter og aktiverte T-celler. Klinisk presentasjon i all var preget av tilbakevendende infeksjoner, alvorlig diare og manglende evne til å trives. Fravær av antigen – spesifikk humoral og cellulær respons ble observert hos alle, og hypogammaglobulin-aemi hos flere av pasientene. I denne rapporten rapporteres detaljerte studier på cellene til pasienter, AkO, ShA, ShG, ZM. For ZM ble delvise resultater presentert tidligere (17). PASIENT SS er allerede beskrevet (15). Karakteristika for PASIENT ABI, inkludert i somatiske komplementeringsforsøk, er allerede rapportert (16).

Cellekultur

b-cellelinjer ble etablert fra Pasientenes b-celler ved epstein-Barr virus (EBV) infeksjon. Pasientenes hudfibroblaster ble oppnådd ved hudbiopsi, og transformert MED SV40, som tidligere beskrevet (15). Alle cellelinjer ble dyrket ved 37°C i 5% CO2 I RPMI-1640 (Gibco BRL Lifesciences) supplert med 20% varmeinaktivert føtalt kalveserum. Fibroblaster eller deres heterokaryoner ble behandlet MED IFN-γ (200 IE / ml)i 40 timer før ANALYSE AV MHC klasse II uttrykk.

Immunfluorescens

Anti-HLA-DR antistoff 20,6 (21), anti-Klasse II Bu27 (Bindingsstedet, Birmingham, STORBRITANNIA) Og Anti-klasse i antistoff W6/32 (ServaLab) ble brukt. B-celler ble farget i suspensjon, mens fibroblaster ble festet med etanol før inkubasjon med antistoffer, som beskrevet (15). Cellesuspensjoner ble analysert med En Beckton Dickinson cytofluorograph, og faste celler Med En Leitz Ortoplan mikroskop.

Somatisk komplementeringsanalyse

Fibroblast-og b-cellelinjer fra nyetablerte pasienter samt eksperimentelle cellelinjer (HVJ, ABL, SJO og 6.1.6.) fra pasienter som tidligere var klassifisert til komplementasjonsgrupper a, b, C og d, ble brukt i disse forsøkene. 6.1.6-cellelinjen var en geneticinvalgt fullt negativ MHC klasse II-variant, vennlig levert Av C. Alcaide (Institut Pasteur). I tillegg inkluderte fusjonsforsøk: pasient SS cellelinje, som representerer en antatt komplementeringsgruppe X (15), og PASIENT ABI cellelinje, rapportert å representere gruppe E (16), vennlig levert Av P. van den Elden. Transient heterokaryoner av begge celletyper, B-celler Og fibroblaster ble oppnådd ved elektrofusjonsmetoden beskrevet i detalj tidligere (15). Fenotypisk reversering ble testet ved immunfluorescens eller ved northern blot 48-72 h etter cellefusjon. Ved fibroblaster ble cellene dyrket i nærvær eller fravær av 200 IE / ml rekombinant IFN-γ (Genex).

Transfeksjoner

plasmidene som ble brukt til transfeksjon var pREP4 (Invitrogen), pREP4-RFXAP og EBO-Sfi (tom vektor) eller EBO-CIITA, vennlig gitt Av V Steimle (8). Transfeksjoner Av b-cellelinjer og fibroblaster ble utført som beskrevet (22) med 1-10 µ av hvert plasmid, ved bruk AV EN jouan GTH 128/a elektropulser, som beskrevet (15). Stabile transfektanter ble generert ved seleksjon med hygromycin B (250 µ/ ml; Calbiochem). Transfiserte fibroblaster ble behandlet MED 200 IE/ml IFN-γ før TESTING FOR MHC klasse II-uttrykk.

PCR-forsterkning og sekvensering AV RFXAP

RFXAP cDNA-kloner i full lengde fra pasienter ble isolert VED RT-PCR og subklonert til pgem-T-vektor (Promega), i henhold til standardprosedyrer, og analysert for mutasjoner. Mutasjoner ble deretter bekreftet I DNA hos pasienter og deres foreldre ved å studere PCR-forsterkede genomiske DNA-fragmenter som spenner over nukleotider 116-540, som beskrevet (17). PCR ble utført med Expand High Fidelity PCR-Systemet (Boeh-ringer Mannheim), som beskrevet (10). Sekvensering av rekombinante plasmider ble utført ved BRUK AV ABI PRISM dye terminator cycle sequencing kit (ABI) og En Anvendt Biosystems DNA-sequencer. Genomiske PCR-produkter ble syklussekvensert direkte ved hjelp av radiomerkede sekvenseringsprimere og Et Termo-Sequenasesett (Amersham), og analysert på en sekvenseringsgel.

RT-PCR-deteksjon av HLA-klasse II, DMB, Ii og GADPH-genuttrykk

Totalt cytoplasmisk RNA ble ekstrahert FRA IFN-γ induserte fibroblaster ved hjelp av guanidiumtiocyanatmetoden (23). Første tråd cDNA ble syntetisert med avian myeloblastose virus (AMV) revers transkriptase (Boehringer Manneheim, SA) ved hjelp av 10 ng oligo (dT) som en primer og 5 µ av cytoplasmisk RNA. PCR-forsterkning ble utført i et sluttvolum på 50 µl ved bruk av 1/30 av cDNA, 1 µ av hver primer, 200 µ av hver D NTP, 1,25 IE AmpliTaq-polymerase (Perkin-Elmer, Forster City, CA) og 0,1 µ dctp (Amersham) i hver prøve. DNA-ET ble denaturert til 94°C i 1 min, glødet i 1 min til 55°C for å påvise alle gener unntatt GADPH og aDR, som det ble brukt en 58°C glødetemperatur for. Forlengelse ved 72°C var i 1 min. Denne syklusen ble gjentatt 25 ganger for GADPH og aDR og 27 ganger for de andre genene, etterfulgt av 10 min forlengelse ved 72°C. Prøver ble elektroforesert på 5% akrylamidgeler ved 150 V i 2 timer. Geler ble løst og tørket før eksponering i En Fosforimager boks (Molekylær Dynamikk) eller Til X-Omat film (Kodak). Sekvensene av oligonukleotidprimere brukt I PCR-forsterkning var: FOR HLA-aDQ, – ß og DMB som beskrevet Av Peijnenburg (16), FOR GADPH,- aDR Og Ii-kjede som beskrevet av Vedrenne et al. (24), og for-ß,- aDP og-ß som beskrevet av Hauber et al. (25).

Forkortelser

Forkortelser
• B-celle

  linje b-lymfoblastoid cellelinje

• IFN-γ

  interferon γ

• MHC

  stort histokompatibilitetskompleks

• RT-PCR

  omvendt transcrip-sjon-polymerasekjedereaksjon.

Takk

vi takker Spesielt Drs Peter van Den Elden for å tillate OSS å inkludere ABI-cellelinjen i fusjonseksperimenter. Vi er takknemlige Til Dr. Andrew Cant og Mario Abinun for blodprøver og hudbiopsier fra pasienter behandlet i DERES ENHET FOR BMT, og Til Dr. Klaus Schwarz for å sende oss blodprøver fra to pasienter. Vi takker Også Franç Selz for hennes ekspertsamarbeid og E. Barras for utmerket teknisk assistanse.