MHCクラスII欠損における相補性グループDの遺伝的および分子的定義

Abstract

MhcクラスII遺伝子の座標発現に欠陥がある細胞株のうち、A、B、C、Dの四つの相補性グループが記載されている。 これらには、MHCクラスII欠乏症の影響を受けた患者から確立された細胞株および実験的に生成された変異細胞株が含まれる。 グループDは、他のグループとは対照的に、長い間、6.1.6変異細胞株によってのみ表されていた。 このグループの欠陥の原因となる遺伝子、RFXAPは、最近クローニングされ、6.1.6細胞株および三人の患者において変異することが判明した。 ここでは、いくつかの新しいHLAクラスII欠損患者における融合実験を報告し、既知の患者の大部分を四つの相補群に分類することを完了した。 無関係な家族の患者は相補群Dに分類され、他の患者は相補群AおよびBに分類された。 患者のいずれも新しい相補群を定義しなかった。 ＲＦＸＡＰ ｃＤＮＡによるトランスフェクションにより、グループＤに属する患者由来の細胞においてＭＨＣクラスＩ Ｉ発現の完全な補正を得た。 ＲＦＸＡＰコード領域は全ての患者で変異していることが分かった。 現在までに報告されている8つの無関係な家族では3つの異なる突然変異のみが発見されているため、突然変異は再発することが判明しました。

はじめに

MHCクラスII抗原の発現は、細胞特異的な方法で緊密に制御されており（1）、抗原特異的免疫応答（2）に不可欠です。 MHCクラスII遺伝子の転写を制御するメカニズムは、特にHLAクラスII発現を欠損した細胞を使用することによって、広く研究されている。 これらの細胞は、実験的に生成された変異体、またはMHCクラスII欠乏症に罹患した患者からの細胞のいずれかである（3）。 HLAクラスII抗原の発現不良に起因するこの一次免疫不全は、感染に対する極端な感受性、および抗原認識時の細胞性および体液性T細胞応答の欠如 患者由来の細胞は、ＤＲ、ＤＱおよびＤＰ ｈｌａアイソタイプをコードするαおよびβ ＭＨＣクラスＩ ｉ遺伝子を転写しない（３，５）。 家族内分離分析は、遺伝的異常がMHC領域の外側に局在し、トランス作用調節因子（複数可）を含むことを示している（5）。 正常なＭＨＣクラスＩ Ｉ発現を確実にするために絶対に必要とされる転写因子の数を評価するために、患者細胞株および実験的変異細胞株の両方を体細胞融合実験で使用した。 四つの相補性グループは、a、B、CおよびD（6,7）を同定した。

グループAおよびCの欠陥に関与する遺伝子は、それぞれRJ2.5.5細胞株（グループA）およびSJO細胞株（グループC）の相補クローニングによってクローニングされた。 CIITA遺伝子は、構成的および誘導性HLAクラスII発現の両方を制御し、グループA患者（8）で変異している非DNA結合タンパク質をコードしています。 RFX5遺伝子はRFX複合体の75kDaサブユニットをコードし、相補性グループC（9）からの患者で変異しています。 第三の遺伝子、RFXAP（RFX関連タンパク質のための）は、Durandらによって最近クローニングされました。 (10). RFXAPは、RFX複合体の小さな36kDaサブユニットをコードし、遺伝子の変異は、相補性グループDの欠陥の原因である。RFX5とRFXAPタンパク質は、一緒に41kDaの第三のタ この第三のタンパク質をコードする遺伝子は、影響を受けた遺伝子がまだ同定されていない相補性グループBで変異している可能性があります。 ＲＦＸ複合体のＤＮＡへの結合は、少なくとも２つの多面性因子、ＮＦＹおよびＸ２ＢＰ（１ ２−１ ４）との協調的結合に依存するが、クラスＩＩ転写には十分ではない。 CIITAは、RFXおよびプロモーターのX2およびYボックスに結合する他の転写因子と結合して、MHCクラスII遺伝子の転写を可能にしなければならない。

ここでは、13の新しいHLAクラスII欠損患者と二つの以前に報告された患者SS（15）とABI（16）の体細胞相補分析について説明し、異なる相補群を表すことが疑わ 新しい患者の一つはA群に属し、他の七つはB群に属することが判明したが、四つの新しい患者はSSおよびABI患者と同じ相補群に落ちた。 後者の群は，相補性解析，ＲＦＸＡＰ ｃｄｎａとのトランスフェクションおよびＲＦＸＡＰ遺伝子の変異解析によりｄ群を表すことが分かった。

結果

患者の相補群への分類

体細胞融合実験は、相補群A、B、CおよびDを表すB細胞または線維芽細胞のいずれかを用いて行われた。B細胞および線維芽細胞の両方は、患者ZMに対してのみ利用可能であった。 図1は、B細胞と線維芽細胞の両方の異核体で得られたHLA発現の例を示す。 線維芽細胞ヘテロカリオンでは、HLAクラスII陽性細胞の3-10％がインターフェロン-γ（IFN-γ）治療後48時間検出された。 B細胞異核体では、5％以下のHLAクラスII陽性細胞を検出することができなかった。 図2は、体細胞融合によって得られたデータを要約し、表2は、以前に公開されたデータ（6,7）に関して新たに研究された患者の分類を与える。 パキスタン系の患者はＡ群に分類され，ｂ群には七人，Ｄ群には五人が分類された。

表１が示すように、４人の患者からの線維芽細胞、ＺＭ、Ａｋｏ、Ｓｈ ａおよびＳｈｇは、補完群ＡおよびＢを表すが、分類されていないＳＳ線維芽細胞株を補完しなかった（１ ５）。 ZM B細胞は、グループA、BおよびCからB細胞を補完したが、グループDを定義するHLAクラスII陰性6.1.6B細胞株を補完しませんでした。zm、AkO、ShaおよびShG線維芽 さらに、これらの線維芽細胞株のいずれも、ZMを包含し、ABI細胞株を補完しなかった（16）。 したがって、患者ＳＳ、Ａｋｏ、Ｓｈａ、Ｓｈｇ ＡＢＩおよびＺＭ由来の細胞は、すべて相補性グループＤに属する。

RFXAP cDNAによるトランスフェクションによるHLAクラスII発現の補正

既報のように、rfxap cDNAによる一過性トランスフェクション実験では、ZMおよびABI線維芽細胞でMHCクラスII発現の補正が得られた(17)。 図２は、ＲＦＸＡＰ ｃＤＮＡによるトランスフェクション後に、Ｂ細胞株が利用可能であった唯一の患者である患者ＺＭ由来の細胞における構成的ＨＬＡクラスＩ Ｉ遺伝子発現の完全な補正を示す。 対照的に、CIITAまたはRFX5cdnaとのトランスフェクションは、HLAクラスII発現を復元しませんでした; どちらも空のベクトルとのトランスフェクションをしませんでした。 患者Ａｋｏ、ＳＳおよびＳｈａ由来の線維芽細胞におけるＩＦＮ−γ誘導性ＭＨＣクラスＩ Ｉ発現についても同様の結果が得られた（データは示されていない）。＜１ ０ ２ １＞＜４ ０ ０ ４＞患者ｓ ｓ、Ａｋｏ、ＳｈａおよびＳｈｇにおけるＲＦＸＡＰ遺伝子の変異＜４ ２ ４ ３＞＜４ ２ ９ ２＞完全長ＲＦＸＡＰ ｃ ＤＮＡを、記載の（１ ０）のように患者Ｓ ｓ、Ａｋｏ、ＳｈａおよびＳｈｇからＰＣＲによって増幅し、ｐＧＥＭベ ４人全ての患者において，ＲＦＸＡＰ ｃｄｎａの変異が同定された。 その後、これらの変異は、患者およびその親からのゲノムPCR産物の直接配列決定によって確認された。

家族SSでは、二つの影響を受けた子供と、ヌクレオチド484でGのホモ接合欠失が発見された（484delg）（図。 3). 同じ変異は、家族ZM（17）で検出されました。 得られたフレームシフトは、ヌクレオチド525でフレーム外停止コドンにつながる。 両親はこの突然変異のためにヘテロ接合であることが判明した。

Ａｋｏファミリーでは、ＲＦＸＡＰ遺伝子の位置２ ７ ９での停止コドン（ＣＡＧ→ＴＡＧ）によるグルタミンコドンの置換が検出された（Ｃ２ ７ ９Ｘ）（図２）。 4). この変異は、52アミノ酸の切断されたタンパク質につながると予測されている。 同じ変異が患者ＡＢＩにおいて以前に検出されている（１ ７）。 AkOの親はこの突然変異のためにヘテロ接合性である。

家族Shでは、二つの影響を受けた第一度のいとこShAとShGで、RFXAP cDNAの位置151に七つのヌクレオチド’GCGGGCG’の挿入が発見されました。 この変異は151ins7と命名されている。 これは、ヌクレオチド144-150にまたがる野生型配列の重複を表す。 それはヌクレオチド329で停止コドンに終ってフレームシフトに導きます。 この家族からの両方の患者は、このホモ接合変異を継承した（図。 5). 両患者の両親はヘテロ接合性であった（データは示されていない）。

補完群DにおけるMHCクラスII、DMBおよびIi鎖遺伝子発現

患者ABIの細胞でDRAおよびDPB遺伝子の残存発現が報告されていたため(16)、RT-PCRでD群患者のMHCクラスII遺伝子発現を調べた。 可変レベルの転写が、４人の患者においてＤＰＡおよび／またはＤＰＢ遺伝子について観察されたが、グループＡの対照患者では観察されなかった（図１ ０Ａ）。 6). しかしながら、ｄｐａ転写物およびＤＰＢ転写物の両方が検出された患者のＳｈｇ細胞においても、Ｄｐａ Β複合体の検出可能な膜発現は存在しなかった（図３）。 7). 患者細胞株のいずれにおいても、ＲＴ−ＰＣＲによって検出されたＨＬＡ ＤＲ、ＤＱ、ＤＭＢまたはＩｉ鎖遺伝子ｍ ＲＮＡではなかった（図１ ０Ａ）。 6).

考察

検査された患者の数が増え、mhcクラスII発現の制御に関与することが示された多面性因子にもかかわらず、mhcクラスII免疫不全患者で変異した補 この研究で研究された13の新しいHLAクラスII欠損患者では、報告された患者の大半は現在、相補群に分類されており、どれも第五の相補群を定義してい 全体として、39家族の34人の患者のうち、補完群Aに6人、B群に22人、C群に3人、D群に8人がいる。MHCクラスII発現の部分的な欠陥を有し、軽度の免疫不全を有する二人の兄弟は、最近、追加の相補群に分類された（18）。 彼らはワクチン接種（に応答することができるので、これらの非定型の患者は、おそらく、別の症候群を表している19）。

本報告で分類された免疫不全患者のうち、二つの影響を受けた兄弟を持つ家族KhのみがグループAに属しています。 新規患者のうち7人はグループBに分類され、北アフリカ、イタリア、トルコ、サウジアラビア系である。 全体として、BLS1創設者患者を含め、グループBには22の家族があります。

三つの家族の四つの新しい患者は、一緒に患者SS（15）と、グループDに分類されます。 それらの臨床的および生物学的特徴は、他のHLA欠損患者と異ならなかった。 しかし、１つを除く全てにおいて、ＤＰＡ遺伝子および／またはＤＰＢ遺伝子の転写が検出され得る。 残留DPAおよびDPB転写も患者ABIにおいて報告された（16）。 この研究で研究された患者では、DP転写産物の存在にもかかわらず、成熟したDPa-βヘテロ二量体は、おそらくIiおよびDM遺伝子が発現されないため、細胞表面 したがって、in vivoで実際に観察されるように、欠陥におけるこの漏れ性から機能的な結果は期待されない。

これらの患者が相補性グループD、すなわち体細胞融合分析、RFXAP cDNAと患者の細胞のトランスフェクションと変異分析に属していることを示す証拠の3つの異なる行。 患者のＺＭについて実証されたように、線維芽細胞およびＢ細胞株の両方を使用することによって、明確な細胞融合結果が得られた。 一方では、ZM細胞と6.1.6B細胞株との間、および他方では、ZMおよびSS線維芽細胞との間の相補性の欠如は、ABI線維芽細胞のものを含む他のすべての融合データを検証した。 グループ”E”（16）へのこの患者の以前の誤分類は、おそらく使用される6.1.6細胞株の漏れによるものであり、および/または細胞系統（B-線維芽細胞融合）を越えて行われる融合実験によるものであった。 RFXAP cDNAのトランスフェクションによるグループDからの細胞ではなく、他のグループからのHLAクラスII発現の完全な補正は、一時的なトランスフェクション実験 ＲＦＸＡＰ ｃＤＮＡは、ＺＭおよびＡＢＩについても以前に示されたように、ＳＳ、ＡＫＯ、ＳｈおよびＳｈｇ患者において変異することが見出された（１ ７）。

RFXAPの3つのタイプの再発変異、すなわち置換、欠失および挿入が見出された（図10）。 8). ポリメラーゼエラーにつながるRFXAP遺伝子の非常に高いCG含有量は、これらの変異（の生成を説明することができます20）。 患者ＡＫＯで検出されたＣ２ ７ ９Ｘ転移は、以前に患者ＡＢＩで検出された変異と同一であり（１ ７）、患者ＳＳでの４ ８ ４ｄｅｌｇ変異は、患者Ｄ ＡおよびＺＭで検出された変異と同一である（１ ０，１ ７）。 両方の場合において、変異は、それぞれ、フレームシフトと52と136アミノ酸の深刻な切り捨てられたタンパク質の合成を引き起こすと予測されています。 以前に発見されていなかった変異は、Shいとこ、すなわち重複ヌクレオチド144-150の挿入で発見された：’GCGGGC’。 この突然変異はまた、フレームシフトおよび切断された生成物をもたらす。 すべての突然変異は、単一のエクソンに対応するRFXAP cDNAのヌクレオチド116-540にまたがる領域内で検出された。

したがって、患者Ｄ Ａを含む６つの異なる家族において、ＲＦＸＡＰ遺伝子の３つの異なる変異のみがこれまでに観察されている（１ ０）。 患者Ｓ ｓ，Ｒ ａおよびＺＭは北アフリカ起源であり，患者ＡＫＯおよびＡＢＩはトルコ系であるため，家族の民族的起源はこれらの変異の先祖の起源を示す可能性がある。 しかしながら、注目すべきことに、ＭＨＣクラスＩＩ欠損症のＤ群においてのみ、このような再発変異がこれまでに検出されている。 グループAでは、例えば、スペイン系の患者の高い有病率にもかかわらず（15）、異なる患者の間で再発対立遺伝子は検出されていない（8、およびB.Lisowska-Grospierre et al.、未発表）。 すべての補完群において、患者のほとんどは同族結婚が頻繁であるMediterrenean地域から来ている。

RFXAP遺伝子変異が、おそらく機能しないタンパク質をもたらす理由は、残留DPA/B遺伝子転写と関連していることは理解されていません。 この観察は、MHCクラスII遺伝子転写調節の限られたが重要な調整異常の証拠を提供します。 これらの結果は、ＤＲＡ／Ｂ、ＤＱＡ／Ｂ対ＤＰＡ／Ｂ転写におけるＲＦＸＡＰの推定上の特異的役割を決定するためにさらなる研究を必要とする。

材料および方法

患者

MHCクラスII免疫不全に罹患した無関係な家族からのこれまでに記載されていない患者が研究された。 11人の家族が同族であった。 彼らは北アフリカ（3）、イタリア（2）、トルコ（3）、ドゥルーズ（2）、パキスタン（2）、サウジアラビア（1）の起源であった。 全ての患者において，ＨｌａクラスＩ Ｉ抗原はＢ細胞，単球および活性化Ｔ細胞の細胞表面に検出できなかった。 すべての臨床提示は、再発性感染症、重度の下痢および繁栄の失敗によって特徴付けられた。 抗原特異的な体液性および細胞性応答の欠如は、いくつかの患者において、すべておよび低ガンマグロブリン血症において観察された。 本報告では、患者、AkO、ShA、ShG、ZMの細胞に関する詳細な研究が報告されている。 ZMについては、部分的な結果が以前に提示された（17）。 患者ＳＳは既に記載されている（１ ５）。 体細胞相補性実験に含まれる患者ＡＢＩの特徴は、既に報告されている（１ ６）。

細胞培養

患者のB細胞からエプスタインバーウイルス（EBV）感染によりB細胞株を樹立した。 患者の皮膚線維芽細胞は、皮膚生検によって得られ、前述のようにＳＶ４ ０で形質転換された（１ ５）。 全ての細胞株を、２ ０％熱不活化ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ−１ ６ ４ ０（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の５％ＣＯ２中で３ ７℃で増殖させた。 線維芽細胞またはそれらの異核細胞を、ＭＨＣクラスＩ Ｉ発現の分析の前に、ＩＦＮ−γ（２ ０ ０ＩＵ／ｍｌ）によって４ ０時間処理した。

免疫蛍光

抗HLA-DR抗体20.6(21)、抗クラスII Bu27(Binding Site,Birmingham,UK)および抗クラスI抗体W6/32(ServaLab)を使用した。 Ｂ細胞を懸濁液中で染色し、一方、線維芽細胞を抗体とのインキュベーションの前にエタノールで固定した（１ ５）。 細胞懸濁液をＢｅｃｋｔｏｎｄｉｃｋｉｎｓｏｎサイトフルオログラフで分析し，Ｌｅｉｔｚtｏｐｌａｎ顕微鏡で固定細胞を分析した。

体細胞相補性分析

新しく設立された患者からの線維芽細胞およびB細胞株ならびに実験細胞株（HVJ、ABL、SJOおよび6.1.6。 これらの実験では、以前に相補群A、B、CおよびDにそれぞれ分類された患者から）を使用した。 ６細胞株は、ｃ．Ａｌｃａｉｄｅ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）により親切に提供された、ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ選択された完全陰性ＭＨＣクラスＩ Ｉ変異体であった。 さらに、核融合実験には以下が含まれています: 推定相補性グループＸを表す患者ＳＳ細胞株（１ ５）、およびグループＥを表す患者ＡＢＩ細胞株（１ ６）が、ｐ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｌｓｅｎにより親切に提供されることが報告されている。 両方の細胞型、B細胞および線維芽細胞の一時的なヘテロカリオンは、以前に詳細に記載された電気融合法によって得られた（15）。 表現型の復帰は、免疫蛍光または細胞融合後のノーザンブロット48-72hによって試験された。 線維芽細胞の場合、細胞を２ ０ ０ＩＵ／ｍｌの組換えＩＦＮ−γ（Ｇｅｎｅｘ）の存在下または非存在下で培養した。＜１ ０ ２ １＞＜４ ０ ０ ４＞トランスフェクション＜４ ２ ４ ３＞＜４ ２ ９ ２＞トランスフェクションに用いたプラスミドは、Ｐｒｅｐ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｒｅｐ４−ＲＦＸＡＰおよびＥＢＯ−Ｓｆｉ（空ベクター）またはＥｂｏ−ＣＩＩＴＡ（ｖ Ｓｔｅｉｍｌｅ（８）によ Ｂ細胞株および線維芽細胞のトランスフェクションは、記載の（２ ２）のように、各プラスミド１〜１ ０μ ｇを用いて、記載の（１ ５）のように、ＪＯＵＡＮ ＧＴＨ１ ２ ８／ａ電気パルスを用いて行 安定なトランスフェクタントは、ハイグロマイシンＢ（２ ５ ０μ ｇ／ｍｌ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）による選択によって作製した。 トランスフェクトされた線維芽細胞を、ＭＨＣクラスＩ Ｉ発現を試験する前に、２ ０ ０ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−γで処理した。＜１ ０ ２ １＞＜４ ０ ０ ４＞ＲＦＸＡＰのＰＣＲ増幅および配列決定＜４ ２ ４ ３＞＜４ ２ ９ ２＞患者からの全長ＲＦＸＡＰ ｃＤＮＡクローンを、ＲＴ−ＰＣＲにより単離し、標準手順に従ってｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングし、 次に、記載の（１ ７）のように、ヌクレオチド１ １ ６〜５ ４ ０に及ぶＰＣＲ増幅ゲノムＤＮＡ断片を研究することにより、患者およびその親のＤＮＡにおいて変異を確認した。 ＰＣＲは、（１ ０）記載のように、Ｅｘｐａｎｄ Ｈ Ｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈ−ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて実施した。 組換えプラスミドの配列決定は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（ＡＢＩ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて行った。 ゲノムPCR産物は、放射性標識シーケンシングプライマーとサーモ-シークエナーゼキット（Amersham）を使用して直接サイクル配列決定し、シーケンシングゲル上で分析した。

HLAクラスII、DMB、IiおよびGADPH遺伝子発現のRT-PCR検出

チオシアン酸グアニジウム法によりIFN-γ誘導線維芽細胞から全細胞質RNAを抽出した(23)。 第１鎖ｃＤＮＡを、１ ０ｎｇのオリゴ（ｄ ｔ）をプライマーとして使用し、５μ ｇの細胞質ＲＮＡを使用して、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｅｈｅｉｍ，Ｓ Ａ）を用いて合成した。 ＰＣＲ増幅は、１／３ ０のｃＤＮＡ、１μ Ｍの各プライマー、２ ０ ０μ Ｍの各Ｄ ＮＴＰ、１.２ ５ＩＵのＡｍｐｌｉｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃ Ａ）および０.１μ ＣｉのｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、最終体積５ ０μ Ｌで実施した。 DNAを94℃で1分間変性させ、1分間55℃でアニールしてGADPHおよびaDRを除くすべての遺伝子を検出し、58℃のアニーリング温度を使用した。 72℃での伸長は1分間であった。 このサイクルを、ＧＡＤＰＨおよびＡＤＲについて２ ５回、および他の遺伝子について２ ７回繰り返し、続いて、７ ２℃で１ ０分間伸長させ、試料を、５％アクリルアミドゲル上で、１ ５ ０Ｖで２時間電気泳動した。 ＰＣＲ増幅に使用したオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、Ｐｅｉｊｎｅｎｂｕｒｇ（１ ６）によって記載されたＨＬＡ−ＡＤＱ、−β ＤＱおよびＤＭＢについて、Ｖｅｄｒｅｎｎｅらによって記載されたＧＡＤＰＨ、−ＡＤＲおよびＩｉ鎖に Ｈａｕｂｅｒら（２ ４）によって記載された−β ＤＲ、−ＡＤＰおよび−β ＤＰについて記載されている。 (25).

略語

略語
• B細胞

  bリンパ芽球様細胞株

• IFN-γ

  インターフェロンγ

• MHC

  主要組織適合遺伝子複合体

• RT-PCR

  逆転写ポリメラーゼ連鎖反応。

謝辞

私たちは、融合実験にABI細胞株を含めることを可能にしてくれたDrs Peter van den Elsenに特に感謝します。 私たちは、BMTのために彼らのユニットで治療された患者からの血液サンプルと皮膚生検のためのDrs Andrew CantとMario Abinunに感謝しています。 私たちはまた、彼女の専門家の協力のためのFrançoise Selzと優れた技術支援のためのE.Barrasに感謝します。