genetische en moleculaire definitie van Complementatiegroep D in MHC-klasse II-deficiëntie

Abstract

Vier complementatiegroepen, A, B, C en D, zijn beschreven onder cellijnen met gebreken in de coördinaatexpressie van MHC-klasse II-genen. Deze omvatten cellijnen vastgesteld van patiënten getroffen met MHC klasse II deficiëntie en experimenteel gegenereerde mutant cellijnen. Groep D, in tegenstelling tot de andere groepen, werd lange tijd alleen vertegenwoordigd door de 6.1.6 mutant cellijn. Het gen dat verantwoordelijk is voor het defect in deze groep, RFXAP, werd onlangs gekloond en bleek te zijn gemuteerd in de 6.1.6 cellijn en bij drie patiënten. Hier rapporteren we fusieexperimenten bij verschillende nieuwe HLA klasse II-deficiënte patiënten, waarmee de classificatie van de meerderheid van de bekende patiënten in de vier complementatiegroepen wordt voltooid. Patiënten uit vijf niet-verwante families werden ingedeeld in complementatiegroep D, terwijl negen anderen vallen in complementatiegroepen A en B. Geen van de patiënten definieerde een nieuwe complementatiegroep. Volledige correctie van MHC klasse II expressie werd verkregen in cellen van patiënten die behoren tot groep D door transfectie met de rfxap cDNA. Het rfxap-coderingsgebied bleek bij alle patiënten te zijn gemuteerd. Mutaties bleken terugkerend te zijn omdat er slechts drie verschillende mutaties zijn gevonden in de acht niet-gerelateerde families die tot op heden zijn gerapporteerd.

introductie

MHC klasse II antigeenexpressie wordt streng gecontroleerd op een celspecifieke manier (1) en is essentieel voor antigeenspecifieke immuunrespons (2). Mechanismen die de transcriptie van MHC klasse II genen controleren zijn uitgebreid bestudeerd, met name door cellen te gebruiken die deficiënt zijn in HLA klasse II expressie. Deze cellen zijn ofwel experimenteel gegenereerde mutanten, of cellen van patiënten getroffen met MHC klasse II deficiëntie (3). Deze primaire immunodeficiëntie als gevolg van een gebrekkige expressie van HLA klasse II-antigenen is een autosomaal recessieve aandoening die wordt gekarakteriseerd door een extreme gevoeligheid voor infecties en een afwezigheid van cellulaire en humorale t-celreacties op antigeenherkenning (4). Cellen van de patiënten transcriberen Geen α-En β MHC-klasse II-genen die coderen voor de Dr -, DQ-en DP-HLA-isotypen (3,5). Intrafamilial segregatie analyse heeft aangetoond dat de genetische afwijking is gelokaliseerd buiten het MHC gebied en omvat trans-acting regulatory factor(s) (5). Zowel patiëntencellijnen als experimentele mutantcellijnen werden gebruikt, in somatische fusieexperimenten, om het aantal transcriptiefactoren te evalueren die absoluut nodig waren om een normale MHC klasse II expressie te garanderen. Er werden vier complementatiegroepen geïdentificeerd, A, B, C en D (6,7).

de genen die verantwoordelijk zijn voor het defect in Groep A en C werden gekloond door complementatiekloning in respectievelijk de RJ 2.5.5-cellijn (Groep A) en de SJO-cellijn (Groep C). Het CIITA-gen codeert een niet-DNA-bindend eiwit dat zowel de constitutieve als induceerbare HLA-klasse II-expressie reguleert en gemuteerd is bij patiënten van groep A (8). Het rfx5-gen codeert een 75 kDa-subeenheid van het RFX-complex en wordt gemuteerd bij patiënten uit complementatiegroep C (9). Een derde gen, RFXAP (voor RFX-geassocieerd eiwit), werd onlangs gekloond door Durand et al. (10). RFXAP codeert een kleine 36 kDa subeenheid van het RFX complex, en mutaties van het gen zijn verantwoordelijk voor het defect in complementatiegroep D. De rfx5 en RFXAP eiwitten vormen, samen met een derde eiwit van 41 kDa, een multimerische complexe RFX die bindt aan de x box regio van MHC klasse II promotors (11). Het is mogelijk dat een gen dat dit derde eiwit codeert wordt gemuteerd in complementatiegroep B, waarin het aangetaste gen nog niet is geïdentificeerd. De binding van het RFX-complex aan DNA hangt af van de coöperatieve binding met ten minste twee pleiotrope factoren, NFY en X2BP (12-14), maar is niet voldoende voor klasse II-transcriptie. CIITA moet combineren met RFX en de andere transcriptiefactoren die binden aan de X2-en Y-dozen van de promotor om transcriptie van MHC-klasse II-genen mogelijk te maken.

we beschrijven hier de somatische complementatieanalyse van 13 nieuwe patiënten met HLA klasse II-deficiëntie en twee eerder gemelde patiënten SS (15) en ABI (16), waarvan wordt vermoed dat ze verschillende complementatiegroepen vertegenwoordigen. Eén van de nieuwe patiënten bleek tot groep A te behoren en zeven andere tot Groep B. vier nieuwe patiënten vielen echter in dezelfde complementatiegroep als patiënten SS en ABI. Deze laatste groep bleek Groep D te vertegenwoordigen door complementatieanalyse, transfectie met de rfxap cDNA en mutatieanalyse van het rfxap-gen.

resultaten

classificatie van patiënten in complementatiegroepen

somatische celfusie-experimenten werden uitgevoerd met B-cellen of fibroblasten die de complementatiegroepen A, B, C en D. beide B-cellen en fibroblasten waren alleen beschikbaar voor patiënt ZM. Figuur 1 toont een voorbeeld van HLA-expressie verkregen in heterokaryonen van zowel B-cellen als fibroblasten. Bij fibroblastheterokaryonen werd 48 uur na behandeling met interferon-γ (IFN-γ) 3-10% van de HLA-klasse II-positieve cellen gedetecteerd. In B-cel heterokaryons konden niet meer dan 5% HLA klasse II-positieve cellen worden gedetecteerd. Figuur 2 geeft een samenvatting van de gegevens verkregen door somatische celfusies, en Tabel 2 geeft de classificatie van de nieuw bestudeerde patiënten ten opzichte van eerder gepubliceerde gegevens (6,7). Een patiënt van Pakistaanse afkomst werd ingedeeld in Groep A, zeven patiënten werden geplaatst in groep B en vijf werden ingedeeld in Groep D. geen van de patiënten behoorde tot groep C.

Zoals Tabel 1 laat zien, fibroblasten van de vier patiënten, ZM, AkO, ShA en ShG, aangevuld cellen vertegenwoordigen complementeren de groepen A en B, maar niet een aanvulling op de SS fibroblast cellijn, die niet zijn geclassificeerd (15). ZM B-cellen vulden B-cellen aan uit de groepen A, B en C, maar vulden de HLA-klasse II-negatieve 6.1.6 B-cellijn die groep D definieert niet aan.Er werd geen aanvulling verkregen na fusie tussen ZM, AkO, Sha en ShG-fibroblasten. Bovendien vulde geen van deze fibroblastcellijnen, inclusief ZM, de cellijn ABI aan (16). Cellen van patiënten SS, AkO, ShA, ShG ABI en ZM behoren dus allemaal tot complementatiegroep D.

correctie van de expressie van HLA klasse II door transfectie met de rfxap cDNA

zoals eerder gemeld, werd bij transfectie-experimenten met de rfxap cDNA een correctie van de expressie van MHC klasse II verkregen bij ZM-en ABI-fibroblasten (17). Figuur 2 toont de volledige correctie van constitutieve HLA klasse II genexpressie in cellen van patiënt ZM, de enige patiënt voor wie een B-cellijn beschikbaar was, na transfectie met de rfxap cDNA. In tegenstelling, transfectie met CIITA of rfx5 cDNAs niet herstellen HLA klasse II expressie; transfectie met de lege vector ook niet. Vergelijkbare resultaten werden verkregen voor IFN-γ-geïnduceerde MHC klasse II expressie in fibroblasten van patiënten AkO, SS en ShA (gegevens niet getoond).

mutaties van het rfxap-gen bij patiënten SS, AkO, ShA en ShG

volledige rfxap-cDNAs werden versterkt door PCR van patiënten SS, AkO, ShA en ShG, zoals beschreven (10), gesubkloneerd in een pgem-vector en gesequenced. Bij alle vier de patiënten werden mutaties in de rfxap cDNA geïdentificeerd. Deze veranderingen werden toen bevestigd door het direct rangschikken van genomic PCR producten van de patiënten en hun ouders.

bij familie SS, met twee aangetaste kinderen, werd een homozygote deletie van een G bij nucleotide 484 gevonden (484delG) (Fig. 3). Dezelfde mutatie werd aangetroffen in familie ZM (17). De resulterende frameshift leidt tot een out-of-frame einde codon bij nucleotide 525. De ouders bleken heterozygoot te zijn voor deze mutatie.

in familie AkO, werd een substitutie van een glutamine codon door een stop codon (CAG→TAG) op positie 279 van het rfxap gen gedetecteerd (C279x) (Fig. 4). Deze mutatie zal naar verwachting leiden tot een afgekapt eiwit van 52 aminozuren. Dezelfde mutatie werd eerder vastgesteld bij patiënt ABI (17). De ouders van AkO zijn heterozygoot voor deze mutatie.

In familie Sh, met twee aangetaste eerstegraads neven ShA en ShG, werd een insertie van zeven nucleotiden ‘GCGGGCG’ gevonden op positie 151 van de rfxap cDNA. Deze mutatie wordt aangeduid als 151ins7. Het vertegenwoordigt een verdubbeling van de wild-typeopeenvolging die nucleotiden 144-150 overspannen. Het leidt tot een frameshift resulterend in een eindcodon bij nucleotide 329. Beide patiënten uit deze familie erven deze homozygote mutatie (Fig. 5). De ouders van beide patiënten waren heterozygoot (gegevens niet getoond).

MHC klasse II, DMB en Ii keten genexpressie in complementatiegroep d

aangezien residuele expressie van DRA-en DPB-genen was gemeld in cellen van patiënt ABI (16), werd MHC klasse II genexpressie onderzocht bij patiënten in Groep D met RT-PCR. Een variabel niveau van transcriptie werd waargenomen voor DPA-en/of DPB-genen bij vier van de patiënten, maar niet bij een controlepatiënt uit groep A (Fig. 6). Nochtans, zelfs in geduldige SHG cellen, waarin zowel DPA als DPB transcripten werden ontdekt, was er geen detecteerbare membraanuitdrukking van het complex dpaß (Fig. 7). In geen van de patiëntencellijnen werden HLA DR, DQ, DMB of Ii-keten gen mRNA gedetecteerd door RT-PCR (Fig. 6).

discussie

ondanks het groeiende aantal onderzochte patiënten en de pleiotrope factoren die betrokken bleken te zijn bij de controle van MHC klasse II expressie, blijft het aantal complementatiegroepen, en daarom muteerden factoren bij MHC klasse II immunodeficiëntie patiënten, op vier (Tabel 2). Met de 13 nieuwe patiënten met HLA-klasse II-deficiëntie die in dit onderzoek werden onderzocht, is de meerderheid van de gemelde patiënten nu geclassificeerd in complementatiegroepen en geen enkele definieert een vijfde complementatiegroep. In totaal, van de 39 patiënten uit 34 families, zijn er 6 in complementatiegroep a, 22 in groep B, 3 in Groep C en 8 in Groep D. twee broers met een gedeeltelijk defect van MHC klasse II expressie en met een milde vorm van immunodeficiëntie werden onlangs geclassificeerd in een aanvullende complementatiegroep (18). Deze atypische patiënten vertegenwoordigen waarschijnlijk een ander syndroom, omdat zij in staat zijn te reageren op vaccinatie (19).

van de immunodeficiënte patiënten die in dit rapport worden geclassificeerd, behoort alleen familie Kh, met twee getroffen broers en zussen, tot groep A. hoewel eerder beschreven patiënten in Groep A van Spaanse afkomst waren (15), waren deze nieuwe gevallen van Pakistaanse oorsprong, waaruit blijkt dat CIITA-mutaties niet beperkt zijn tot één etnische oorsprong. Zeven van de nieuwe patiënten vallen in groep B en zijn van Noord-Afrikaanse, Italiaanse, Turkse en Saudi-Arabische afkomst. In totaal zijn er 22 families in Groep B.

vier nieuwe patiënten in drie families, samen met patiënt SS (15), vallen in Groep D. Ze zijn van Noord-Afrikaanse, Turkse en Druzen afkomst. Hun klinische en biologische kenmerken verschilden niet van andere HLA-deficiënte patiënten. Nochtans, in alles behalve één, kon de transcriptie van DPA en / of DPB genen worden ontdekt. Residuele DPA-en DPB-transcriptie werd ook gemeld bij patiënt ABI (16). In de patiënten die in dit werk worden bestudeerd, ondanks de aanwezigheid van DP-afschriften, werden de rijpe heterodimers van DPa-β niet ontdekt bij de celoppervlakte, misschien omdat de genen Ii en DM niet worden uitgedrukt. Er zijn dus geen functionele gevolgen te verwachten van deze lekkage in het defect, zoals inderdaad in vivo is waargenomen.

drie verschillende aanwijzingen tonen aan dat deze patiënten tot complementatiegroep D behoren, namelijk somatische celfusieanalyse, transfectie van de cellen van de patiënten met de rfxap cDNA en mutatieanalyse. Ondubbelzinnige celfusieresultaten werden verkregen door gebruik te maken van zowel fibroblasten als B-cellijnen, zoals aangetoond voor patiënt ZM. De afwezigheid van complementatie tussen ZM-cellen en de 6.1.6 B-cellijn enerzijds, en tussen ZM-en SS-fibroblasten anderzijds, heeft alle andere fusiegegevens gevalideerd, met inbegrip van die van de ABI-fibroblasten. Eerdere verkeerde indeling van deze patiënt in Groep ” E ” (16) was waarschijnlijk te wijten aan de lekkage van de gebruikte 6.1.6-cellijn en/of aan fusieexperimenten die over cellijnen werden uitgevoerd (fusie van B-fibroblastcellen). Een volledige correctie van de HLA klasse II-expressie in cellen uit groep D, en niet uit de andere groepen, door transfectie van de rfxap cDNA bevestigde eerder gerapporteerde gegevens uit transfectie-experimenten (10,17). De rfxap cDNA bleek te zijn gemuteerd bij patiënten SS, AKO, Sh en ShG, zoals eerder aangetoond voor ZM en ABI (17).

drie typen terugkerende mutaties van RFXAP werden gevonden, namelijk substitutie, deletie en insertie (Fig. 8). Een zeer hoog CG-gehalte in het rfxap-gen, dat leidt tot polymerasefouten, kan verantwoordelijk zijn voor het ontstaan van deze mutaties (20). De c279x-transitie die bij patiënt AKO werd gedetecteerd, is identiek aan de mutatie die eerder werd gedetecteerd bij patiënt ABI (17) en de 484delG-mutatie bij patiënt SS is identiek aan de mutatie die werd gedetecteerd bij patiënten DA en ZM (10,17). In beide gevallen wordt voorspeld dat de mutaties leiden tot een frameshift en tot de synthese van ernstig afgeknotte eiwitten van respectievelijk 52 en 136 aminozuren. Een eerder onontdekte mutatie werd gevonden in de SH cousins, d.w.z. een insertie van gedupliceerde nucleotiden 144-150: ‘GCGGGGC’. Deze mutatie resulteert ook in een frameshift en een afgekapt product. Alle veranderingen werden ontdekt binnen een gebied dat nucleotiden 116-540 van de rfxap cDNA overspant, die aan één enkel exon corresponderen.

daarom zijn tot nu toe slechts drie verschillende mutaties van het rfxap-gen waargenomen in zes verschillende families, waaronder patiënt DA (10). De etnische oorsprong van de families kan wijzen op een voorouderlijke oorsprong van deze mutaties aangezien patiënten SS, RA en ZM van Noord-Afrikaanse oorsprong zijn, terwijl patiënten AKO en ABI van Turkse afkomst zijn. Echter, opmerkelijk genoeg, alleen in Groep D van de MHC klasse II deficiëntie zijn dergelijke terugkerende mutaties tot nu toe gedetecteerd. In Groep A, bijvoorbeeld, ondanks een hoge prevalentie van patiënten van Spaanse afkomst (15), is er geen recidiverend allel gevonden bij de verschillende patiënten (8, en B. Lisowska-Grospierre et al., onuitgegeven). In alle complementatiegroepen komen de meeste patiënten uit het Middellandse Zeegebied, waar bloedverwantschap vaak voorkomt.

waarom rfxap-genmutaties, waarschijnlijk resulterend in niet-functionele eiwitten, geassocieerd zijn met residuele DPA/B-gen transcriptie is niet begrepen. Deze observatie levert bewijs voor een beperkte maar significante dyscoordinate regulatie van MHC klasse II gen transcriptie Regulatie. Deze resultaten vereisen verder onderzoek om een vermeende specifieke rol van RFXAP in DRA/B, DQA/B versus DPA/B transcriptie te bepalen.

materialen en methoden

patiënten

dertien tot nu toe onbeschreven patiënten uit elf niet-verwante families met MHC klasse II immunodeficiëntie werden bestudeerd. Elf families waren bloedverwant. Ze waren van Noord-Afrikaanse (drie), Italiaanse (twee), Turkse (drie), Druzen (twee), Pakistaanse (twee) en Saudi-Arabische (een) oorsprong. Bij alle patiënten waren HLA klasse II-antigenen niet detecteerbaar op het celoppervlak van B-cellen, monocyten en geactiveerde T-cellen. De klinische presentatie werd in totaal gekenmerkt door recidiverende infecties, ernstige diarree en niet gedijen. De afwezigheid van antigeenspecifieke humorale en cellulaire responsen werd bij allen waargenomen, en hypogammaglobuline-anemie bij verscheidene patiënten. In dit rapport worden gedetailleerde studies gerapporteerd over de cellen van patiënten, AkO, ShA, ShG, ZM. Voor ZM werden eerder gedeeltelijke resultaten gepresenteerd (17). Patiënt SS is al beschreven (15). Kenmerken van patiënt ABI, opgenomen in somatische complementatie-experimenten, zijn reeds gemeld (16).

celkweek

B-cellijnen werden vastgesteld op basis van B-cellen van patiënten door middel van Epstein-Barr-virus (EBV) – infectie. De huidfibroblasten van patiënten werden verkregen door huidbiopsie en getransformeerd met SV40, zoals eerder beschreven (15). Alle cellijnen werden gekweekt bij 37°C in 5% CO2 in RPMI-1640 (Gibco BRL Lifesciences) aangevuld met 20% warmte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum. Fibroblasten of hun heterokaryons werden behandeld met IFN-γ(200 IE/ml) gedurende 40 uur vóór analyse van MHC klasse II expressie.

immunofluorescentie

Anti-HLA-DR antilichaam 20,6 (21), Anti-klasse II Bu27 (The Binding Site, Birmingham, UK) en anti-klasse I antilichaam W6/32 (ServaLab) werden gebruikt. B-cellen werden gekleurd in suspensie, terwijl fibroblasten werden gefixeerd met ethanol voorafgaand aan incubatie met antilichamen, zoals beschreven (15). Cel suspensies werden geanalyseerd met een Beckton Dickinson cytofluorograaf, en vaste cellen met een Leitz Ortoplan microscoop.

somatische complementatieanalyse

Fibroblast – en B-cellijnen van de nieuw ingestelde patiënten en experimentele cellijnen (HVJ, ABL, SJO en 6.1.6.) van patiënten die eerder waren ingedeeld in complementatiegroepen A, B, C en D, werden gebruikt in deze experimenten. De 6.1.6 cellijn was een geneticine-geselecteerde volledig negatieve MHC klasse II variant, vriendelijk geleverd door C. Alcaide (Institut Pasteur). Bovendien omvatten fusieexperimenten: patiënt SS-cellijn, die een vermeende complementatiegroep X (15) vertegenwoordigt, en patiënt ABI-cellijn, die groep E (16) vertegenwoordigt, vriendelijk verstrekt door P. Van den Elsen. Transiënte heterokaryonen van beide celtypen, B-cellen en fibroblasten werden verkregen met de elektrofusiemethode die eerder in detail is beschreven (15). Fenotypische reversie werd getest met immunofluorescentie of met northern blot 48-72 uur na celfusie. In het geval van fibroblasten werden de cellen gekweekt in aanwezigheid of afwezigheid van 200 IE/ml recombinant IFN-γ (Genex).

Transfecties

de plasmiden die voor transfectie werden gebruikt, waren pREP4 (Invitrogen), pREP4-RFXAP en EBO-Sfi (lege vector) of EBO-CIITA, verstrekt door V Steimle (8). Transfecties van B-cellijnen en fibroblasten werden uitgevoerd zoals beschreven (22) met 1-10 µg van elk plasmide, met behulp van een Jouan GTH 128/A elektropulser, zoals beschreven (15). Stabiele transfectanten werden gegenereerd door selectie met hygromycine B (250 µg/ml; Calbiochem). Transfected fibroblasten werden behandeld met 200 IU / ml IFN-γ alvorens te testen op MHC klasse II expressie.

PCR-versterking en sequencing van RFXAP

volledige rfxap cDNA-klonen van patiënten werden geïsoleerd door RT-PCR en gesubkloneerd tot Pgem-T-vector (Promega), volgens standaardprocedures, en geanalyseerd op mutaties. Mutaties werden vervolgens bevestigd in het DNA van patiënten en hun ouders door het bestuderen van PCR-amplified genomic DNA fragmenten verspreid nucleotiden 116-540, zoals beschreven (17). PCR werd uitgevoerd met het Expand High Fidelity PCR-systeem (Boeh-ringer Mannheim), zoals beschreven (10). Het rangschikken van recombinante plasmiden werd uitgevoerd gebruikend de ABI Prism dye terminator cycle sequencing kit (ABI) en een toegepaste Biosystems DNA sequencer. Genomische PCR-producten werden cyclus direct gesequenced door radiolabelled sequencing primers en een Thermo-Sequenase kit (Amersham) te gebruiken, en geanalyseerd op een sequencing gel.

RT-PCR detectie van HLA klasse II, DMB, Ii en GADPH genexpressie

totaal cytoplasmatisch RNA werd geëxtraheerd uit IFN-γ geïnduceerde fibroblasten met de guanidium thiocyanaatmethode (23). Eerste streng cDNA werd gesynthetiseerd met avian myeloblastosis virus (AMV) reverse transcriptase (Boehringer Manneheim, SA) met behulp van 10 ng oligo(dT) als primer en 5 µg cytoplasmatisch RNA. PCR-versterking werd uitgevoerd in een eindvolume van 50 µl met 1/30 van de cDNA, 1 µM van elke primer, 200 µM van elke D NTP, 1,25 IU AmpliTaq-polymerase (Perkin-Elmer, Forster City, CA) en 0,1 µCi dCTP (Amersham) in elk monster. Het DNA werd gedenatureerd bij 94 ° C gedurende 1 min, onthard gedurende 1 min bij 55°C om alle genen behalve GADPH en aDR te ontdekken, waarvoor een gloeitemperatuur van 58°C werd gebruikt. Verlenging bij 72°C gedurende 1 min. Deze cyclus werd 25 keer herhaald voor GADPH en aDR en 27 keer voor de andere genen, gevolgd door 10 minuten verlenging bij 72°C. monsters werden elektroforeseerd op 5% acrylamide gels bij 150 V gedurende 2 uur. Gels werden gefixeerd en gedroogd voordat blootstelling in een Fosforimager doos (moleculaire dynamica) of aan X-omat film (Kodak). De sequenties van oligonucleotide primers gebruikt in PCR amplificatie waren: voor HLA-aDQ, – ßDQ en DMB zoals beschreven door Peijnenburg (16), voor GADPH,- aDR en Ii keten zoals beschreven door Vedrenne et al. (24), en voor-ßDR,- aDP en-ßDP zoals beschreven door Hauber et al. (25).

Afkortingen

Afkortingen
• B-cell

  lijn B-lymfoblastoïde cel lijn

• IFN-γ

  interferon γ

• MHC

  major histocompatibility complex

• RT-PCR

  reverse transcriptie-polymerase ketting reactie.

Dankbetuigingen

wij danken Drs.Peter Van den Elsen in het bijzonder voor het feit dat Hij ons toestaat de ABI-cellijn in fusieexperimenten op te nemen. We zijn Drs Andrew Cant en Mario Abinun dankbaar voor bloedmonsters en huidbiopten van patiënten die in hun eenheid voor BMT werden behandeld, en Dr Klaus Schwarz voor het sturen van bloedmonsters van twee patiënten. We danken ook Françoise Selz voor haar deskundige samenwerking en E. Barras voor de uitstekende technische ondersteuning.