definiția genetică și moleculară a grupului de completare D în deficiența MHC clasa II

rezumat

patru grupuri de completare, A, B, C și D, au fost descrise printre liniile celulare defecte în expresia coordonatelor genelor MHC clasa II. Acestea includ linii celulare stabilite de la pacienții afectați cu deficiență MHC clasa II și linii celulare mutante generate experimental. Grupul D, spre deosebire de celelalte grupuri, a fost mult timp reprezentat doar de linia celulară mutantă 6.1.6. Gena responsabilă de defectul din acest grup, RFXAP, a fost recent clonată și s-a constatat că a suferit mutații în linia celulară 6.1.6 și la trei pacienți. Aici raportăm experimente de fuziune la mai mulți pacienți noi cu deficit de HLA clasa II, completând clasificarea majorității pacienților cunoscuți în cele patru grupuri de completare. Pacienții din cinci familii fără legătură au fost clasificați în grupul de completare D, în timp ce alți nouă se încadrează în grupurile de completare A și B. Niciunul dintre pacienți nu a definit un nou grup de completare. Corectarea completă a expresiei MHC clasa II a fost obținută în celule de la pacienți aparținând grupului D prin transfecție cu ADNc RFXAP. S-a constatat că regiunea de codificare RFXAP a suferit mutații la toți pacienții. Mutațiile s-au dovedit a fi recurente, deoarece doar trei mutații diferite au fost găsite în cele opt familii fără legătură raportate până în prezent.

Introducere

expresia antigenului MHC clasa II este strict controlată într-o manieră specifică celulei (1) și este esențială pentru răspunsurile imune specifice antigenului (2). Mecanismele care controlează transcrierea genelor MHC clasa II au fost studiate extensiv, în special prin utilizarea celulelor deficitare în expresia HLA clasa II. Aceste celule sunt fie mutanți generați experimental, fie celule de la pacienți afectați cu deficiență MHC clasa II (3). Această imunodeficiență primară rezultată din exprimarea defectuoasă a antigenelor HLA clasa II este o tulburare autosomală recesivă caracterizată printr-o susceptibilitate extremă la infecții și o absență a răspunsurilor celulare și umorale ale celulelor T la recunoașterea antigenului (4). Celulele de la pacienți nu transcriu genele de clasa II MHC de la clasa II, care codifică izotipurile DR, DQ și DP HLA (3,5). Analiza segregării intrafamiliale a arătat că anomalia genetică este localizată în afara regiunii MHC și implică factorul(factorii) de reglementare cu acțiune trans (5). Atât liniile celulare ale pacientului, cât și liniile celulare mutante experimentale au fost utilizate, în experimentele de fuziune somatică, pentru a evalua numărul de factori de transcripție care au fost absolut necesari pentru a asigura expresia normală a MHC clasa II. Au fost identificate patru grupuri complementare, A, B, C și D (6,7).

genele responsabile de defectul din grupele A și C au fost clonate prin clonarea complementară în linia celulară RJ 2.5.5 (grupa A) și, respectiv, linia celulară SJO (grupa C). Gena CIITA codifică o proteină care nu leagă ADN-ul, care controlează atât expresia HLA clasa II constitutivă, cât și inductibilă și este mutantă la pacienții din grupa A (8). Gena RFX5 codifică o subunitate de 75 kDa a complexului RFX și este mutantă la pacienții din grupul de completare C (9). O a treia genă, rfxap (pentru proteina asociată RFX), a fost clonată recent de Durand și colab. (10). Rfxap codifică o mică subunitate de 36 kDa a complexului RFX, iar mutațiile genei sunt responsabile pentru defectul grupului de completare D. proteinele RFX5 și RFXAP formează, împreună cu o a treia proteină de 41 kDa, un complex multimeric RFX care se leagă de regiunea cutiei X a promotorilor MHC clasa II (11). Este posibil ca o genă care codifică această a treia proteină să fie mutată în grupul de completare B, în care gena afectată nu a fost încă identificată. Legarea complexului RFX la ADN depinde de legarea cooperativă cu cel puțin doi factori pleiotropici, NFY și X2BP (12-14), dar nu este suficientă pentru transcrierea clasei II. CIITA trebuie să se combine cu RFX și ceilalți factori de transcripție care se leagă de casetele X2 și Y ale promotorului pentru a permite transcrierea genelor MHC clasa II.

descriem aici analiza complementării somatice a 13 pacienți noi cu deficit de HLA clasa II și a doi pacienți raportați anterior SS (15) și ABI (16), suspectați că reprezintă diferite grupuri de complementaritate. S-a constatat că unul dintre noii pacienți aparține grupului a și alți șapte grupului B. Cu toate acestea, patru pacienți noi au căzut în același grup de completare ca pacienții SS și ABI. S-a constatat că ultimul grup reprezintă grupul D prin analiza complementării, transfecția cu ADNc RFXAP și analiza mutației genei RFXAP.

rezultate

Clasificarea pacienților în grupuri complementare

experimentele de fuziune celulară somatică au fost efectuate utilizând fie celule B, fie fibroblaste reprezentând grupuri complementare A, B, C și D. atât celulele B, cât și fibroblastele au fost disponibile numai pentru pacientul ZM. Figura 1 prezintă un exemplu de Expresie HLA obținută în heterokarioni atât ai celulelor B, cât și ai fibroblastelor. În heterokarionii fibroblasti, 3-10% din celulele HLA clasa II-pozitive au fost detectate la 48 de ore după tratamentul cu interferon-XV (IFN-XV). În heterokarionii cu celule B, nu au putut fi detectate mai mult de 5% celule HLA din clasa II-pozitivă. Figura 2 rezumă datele obținute prin fuziuni de celule somatice, iar tabelul 2 prezintă clasificarea pacienților nou studiați în raport cu datele publicate anterior (6,7). Un pacient de origine pakistaneză a fost clasificat în grupa A, șapte pacienți au fost plasați în grupa B și cinci au fost clasificați în grupa D. niciunul dintre pacienți nu aparținea grupului C.

după cum arată tabelul 1, fibroblastele de la patru pacienți, ZM, AkO, ShA și ShG, au completat celulele reprezentând grupurile de completare A și B, dar nu au completat linia celulară de fibroblaste SS, care nu fusese clasificată (15). Celulele ZM B au completat celulele B din grupele A, B și C, dar nu au completat clasa HLA II-negativ 6.1.6 linia celulară B care definește grupa D. Nu s-a obținut nicio completare după fuziunea dintre fibroblastele ZM, AkO, Sha și ShG. În plus, niciuna dintre aceste linii celulare fibroblaste, inclusiv ZM, nu a completat linia celulară ABI (16). Astfel, celulele de la pacienții SS, AkO, ShA, SHG ABI și ZM aparțin grupului de completare D.

corectarea expresiei HLA clasa II prin transfecție cu ADNc RFXAP

după cum s-a raportat anterior, în experimentele de transfecție tranzitorie cu ADNc RFXAP, s-a obținut o corecție a expresiei MHC clasa II în fibroblastele ZM și ABI (17). Figura 2 prezintă corecția completă a expresiei genei HLA clasa II constitutivă în celulele pacientului ZM, singurul pacient pentru care a fost disponibilă o linie de celule B, în urma transfecției cu ADNc RFXAP. În schimb, transfecția cu CDN-uri CIITA sau RFX5 nu a restabilit expresia HLA clasa II; nici transfecția cu vectorul gol. Rezultate similare au fost obținute pentru expresia MHC clasa II indusă de IFN-XV în fibroblaste de la pacienții AkO, SS și ShA (datele nu sunt prezentate).

mutațiile genei RFXAP la pacienții SS, AkO, ShA și ShG

CDN-urile Rfxap de lungime completă au fost amplificate prin PCR de la pacienții SS, AkO, ShA și ShG, așa cum este descris (10), subclonate într-un vector pGEM și secvențiate. La toți cei patru pacienți, au fost identificate mutații în ADNc RFXAP. Aceste mutații au fost apoi confirmate prin secvențierea directă a produselor PCR genomice de la pacienți și părinții lor.

în familia SS, cu doi copii afectați, a fost găsită o deleție homozigotă a unui g la nucleotida 484 (484delg) (Fig. 3). Aceeași mutație a fost detectată în familia ZM (17). Schimbarea cadrului rezultat duce la un codon de oprire în afara cadrului la nucleotida 525. Părinții s-au dovedit a fi heterozigoți pentru această mutație.

în familia AkO, a fost detectată o substituție a unui codon de glutamină cu un codon de oprire (eticheta CAG XV) la poziția 279 a genei RFXAP (C279X) (Fig. 4). Se estimează că această mutație va duce la o proteină trunchiată de 52 de aminoacizi. Aceeași mutație a fost detectată anterior la pacientul ABI (17). Părinții AkO sunt heterozigoți pentru această mutație.

în familia SH, cu doi veri de gradul I afectați ShA și ShG, a fost găsită o inserție de șapte nucleotide ‘GCGGGCG’ la poziția 151 a ADNc RFXAP. Această mutație este desemnată 151ins7. Reprezintă o duplicare a secvenței de tip sălbatic care acoperă nucleotidele 144-150. Aceasta duce la o schimbare a cadrului, rezultând un codon de oprire la nucleotida 329. Ambii pacienți din această familie au moștenit această mutație homozigotă (Fig. 5). Părinții ambilor pacienți au fost heterozigoți (datele nu au fost prezentate).

MHC clasa II, DMB și II expresia genelor în lanț în grupul complementar D

deoarece expresia reziduală a genelor DRA și DPB a fost raportată în celulele pacientului ABI (16), expresia genelor MHC clasa II a fost examinată la pacienții din grupul D prin RT-PCR. Un nivel variabil de transcripție a fost observat pentru genele DPA și/sau DPB la patru dintre pacienți, dar nu la un pacient de control din grupa A (Fig. 6). Cu toate acestea, chiar și în celulele ShG ale pacientului, în care au fost detectate atât transcrieri DPA, cât și DPB, nu a existat o expresie membranară detectabilă a complexului Dpa7 (Fig. 7). În niciuna dintre liniile celulare ale pacientului nu au fost detectate ARNm HLA DR, DQ, DMB sau gena lanțului Ii prin RT-PCR (Fig. 6).

discuție

în ciuda numărului tot mai mare de pacienți examinați și a factorilor pleiotropici care s-au dovedit a fi implicați în controlul expresiei MHC clasa II, numărul grupurilor de completare și, prin urmare, factorii mutați la pacienții cu imunodeficiență MHC clasa II rămâne la patru (Tabelul 2). Cu cei 13 pacienți noi cu deficit de HLA clasa II studiați în această lucrare, majoritatea pacienților raportați au fost clasificați acum în grupuri de completare și niciunul nu definește un al cincilea grup de completare. În total, din cei 39 de pacienți din 34 de familii, există 6 în grupul complementar A, 22 în grupul B, 3 în grupul C și 8 în grupul D. doi frați cu un defect parțial al expresiei MHC clasa II și cu o formă ușoară de imunodeficiență recent au fost clasificați într-un grup complementar suplimentar (18). Acești pacienți atipici reprezintă probabil un alt sindrom, deoarece sunt capabili să răspundă la vaccinare (19).

dintre pacienții imunodeficienți clasificați în acest raport, numai familia Kh, cu doi frați afectați, aparține grupului A. În timp ce pacienții din grupul a descriși anterior au fost de origine spaniolă (15), aceste noi cazuri au fost de origine pakistaneză, arătând că mutațiile CIITA nu sunt limitate la o singură origine etnică. Șapte dintre noii pacienți se încadrează în grupa B și sunt de origine nord-africană, italiană, turcă și Saudită. În total, inclusiv pacientul fondator BLS1, există 22 de familii în grupul B.

patru pacienți noi din trei familii, împreună cu pacientul SS (15), se încadrează în grupa D. sunt de origine nord-africană, turcă și druză. Caracteristicile lor clinice și biologice nu diferă de alți pacienți cu deficit de HLA. Cu toate acestea, în toate, cu excepția uneia, transcrierea genelor DPA și/sau DPB ar putea fi detectată. Transcrierea reziduală a DPA și DPB a fost, de asemenea, raportată la pacientul ABI (16). La pacienții studiați în această lucrare, în ciuda prezenței transcripțiilor DP, heterodimerii maturi DPA-XV nu au fost detectați la suprafața celulei, poate pentru că genele Ii și DM nu sunt exprimate. Astfel, nu se așteaptă consecințe funcționale din această scurgere a defectului, așa cum se observă într-adevăr in vivo.

trei linii diferite de dovezi demonstrează că acești pacienți aparțin grupului de completare D, adică analiza fuziunii celulare somatice, transfecția celulelor pacienților cu ADNc RFXAP și analiza mutațională. Rezultatele neechivoce ale fuziunii celulare au fost obținute prin utilizarea atât a fibroblastelor, cât și a liniilor de celule B, așa cum s-a demonstrat pentru pacientul ZM. Absența complementării între celulele ZM și linia celulară 6.1.6 B, pe de o parte, și între fibroblastele ZM și SS, pe de altă parte, a validat toate celelalte date de fuziune, inclusiv cele ale fibroblastelor ABI. Clasificarea greșită anterioară a acestui pacient în grupul E (16) s-a datorat probabil scurgerii liniei celulare 6.1.6 utilizate și/sau experimentelor de fuziune efectuate pe linii celulare (fuziuni de celule fibroblaste B). O corecție completă a expresiei HLA clasa II în celulele din grupa D, și nu din celelalte grupuri, prin transfecția ADNc rfxap a confirmat datele raportate anterior din experimentele de transfecție tranzitorie (10,17). ADNc RFXAP s-a dovedit a fi mutant la pacienții SS, AKO, Sh și ShG, așa cum s-a arătat anterior și pentru ZM și ABI (17).

au fost găsite trei tipuri de mutații recurente ale RFXAP, adică substituție, ștergere și inserare (Fig. 8). Un conținut foarte ridicat de CG în gena RFXAP care duce la erori de polimerază ar putea explica generarea acestor mutații (20). Tranziția C279X detectată la pacientul AKO este identică cu mutația detectată anterior la pacientul ABI (17), iar mutația 484delg la pacientul SS este identică cu cea detectată la pacienții DA și ZM (10,17). În ambele cazuri, se preconizează că mutațiile vor da naștere la o schimbare a cadrelor și la sinteza proteinelor sever trunchiate de 52 și, respectiv, 136 de aminoacizi. O mutație nedescoperită anterior a fost găsită la verii Sh, adică o inserție de nucleotide duplicate 144-150: ‘GCGGGGC’. Această mutație are ca rezultat, de asemenea, o schimbare a cadrului și un produs trunchiat. Toate mutațiile au fost detectate într-o regiune care acoperă nucleotidele 116-540 ale ADNc RFXAP, care corespund unui singur exon.

prin urmare, doar trei mutații diferite ale genei RFXAP au fost observate până în prezent în șase familii diferite, inclusiv pacientul DA (10). Originea etnică a familiilor ar putea indica o origine ancestrală a acestor mutații, deoarece pacienții SS, RA și ZM sunt de origine nord-africană, în timp ce pacienții AKO și ABI sunt de origine turcă. Cu toate acestea, remarcabil, numai în grupa D a deficitului MHC clasa II au fost detectate astfel de mutații recurente până în prezent. În grupul A, de exemplu, în ciuda unei prevalențe ridicate a pacienților de origine spaniolă (15), nu a fost detectată nicio alelă recurentă în rândul diferiților pacienți (8 și B. Lisowska-Grospierre și colab., Nepublicat). În toate grupurile de completare, majoritatea pacienților provin din zona mediteraneană, unde căsătoriile consanguine sunt frecvente.

de ce mutațiile genei RFXAP, probabil rezultând proteine nefuncționale, sunt asociate cu transcrierea genei reziduale DPA/B nu este înțeleasă. Această observație oferă dovezi pentru o reglementare discoordonată limitată, dar semnificativă, a reglării transcripției genei MHC clasa II. Aceste rezultate necesită studii suplimentare pentru a determina un rol specific presupus al RFXAP în DRA/B, DQA/B versus transcrierea DPA/B.

materiale și metode

pacienți

au fost studiați treisprezece pacienți nedescriși până acum din unsprezece familii fără legătură afectate cu imunodeficiență MHC clasa II. Unsprezece familii erau consanguine. Erau de origine nord-africană (trei), italiană (două), turcă (trei), Druze (două), pakistaneză (două) și Saudită (una). La toți pacienții, antigenele HLA clasa II au fost nedetectabile pe suprafața celulară a celulelor B, monocitelor și celulelor T activate. Prezentarea clinică la all a fost caracterizată prin infecții recurente, diaree severă și incapacitatea de a prospera. Absența răspunsurilor umorale și celulare specifice antigenului a fost observată la toți, iar hipogamaglobulina-aemia la mai mulți pacienți. În acest raport, sunt raportate studii detaliate privind celulele pacienților, AkO, ShA, ShG, ZM. Pentru ZM, rezultatele parțiale au fost prezentate anterior (17). Pacientul SS a fost deja descris (15). Caracteristicile ABI ale pacientului, incluse în experimentele de completare somatică, au fost deja raportate (16).

culturi celulare

liniile celulare B au fost stabilite din celulele B ale pacienților prin infecția cu virusul Epstein-Barr (EBV). Fibroblastele cutanate ale pacienților au fost obținute prin biopsie cutanată și transformate cu SV40, așa cum s-a descris anterior (15). Toate liniile celulare au fost crescute la 37 C în 5% CO2 în RPMI-1640 (Gibco BRL Lifesciences) suplimentat cu 20% ser de vițel fetal inactivat termic. Fibroblastele sau heterokarionii lor au fost tratați cu IFN-inkt (200 UI / ml) timp de 40 de ore înainte de analiza expresiei MHC clasa II.

imunofluorescență

anticorp Anti-HLA-DR 20,6 (21), Anti-Clasa II Bu27 (situsul de legare, Birmingham, UK) și anticorp anti-clasa I W6/32 (ServaLab) au fost utilizate. Celulele B au fost colorate în suspensie, în timp ce fibroblastele au fost fixate cu etanol înainte de incubare cu anticorpi, așa cum este descris (15). Suspensiile celulare au fost analizate cu un Citofluorograf Beckton Dickinson, iar celulele fixe cu un microscop Leitz Ortoplan.

analiza Complementării somatice

fibroblaste și linii celulare B de la pacienții nou stabiliți, precum și linii celulare experimentale (HVJ, ABL, SJO și 6.1.6.) de la pacienții clasificați anterior la grupurile de completare a, B, C și, respectiv, D, au fost utilizate în aceste experimente. Linia celulară 6.1.6 a fost o variantă MHC clasa II complet negativă selectată de geneticin, oferită cu amabilitate de C. Alcaide (Institut Pasteur). În plus, experimentele de fuziune au inclus: linia celulară SS a pacientului, reprezentând un grup de completare presupus X (15) și linia celulară ABI a pacientului, raportată a reprezenta grupul E (16), oferită cu amabilitate de P. van den Elsen. Heterokarionii tranzitori ai ambelor tipuri de celule, celule B și fibroblaste au fost obținuți prin metoda electrofuziei descrisă în detaliu anterior (15). Reversia fenotipică a fost testată prin imunofluorescență sau prin Northern blot 48-72 h după fuziunea celulară. În cazul fibroblastelor, celulele au fost cultivate în prezența sau absența a 200 UI/ml de IFN-XV recombinant (Genex).

Transfecții

plasmidele utilizate pentru transfecție au fost pREP4 (Invitrogen), pREP4-RFXAP și EBO-Sfi (vector gol) sau EBO-CIITA, furnizate cu amabilitate de V Steimle (8). Transfecțiile liniilor de celule B și ale fibroblastelor au fost efectuate conform descrierii (22) cu 1-10 hectogg din fiecare plasmidă, utilizând un electropulser JOUAN GTH 128/a, conform descrierii (15). Transfectanții stabili au fost generați prin selecție cu higromicină B (250 hectogg/ml; Calbiochem). Fibroblastele transfectate au fost tratate cu 200 UI/ml de IFN-uri înainte de testarea expresiei MHC clasa II.

amplificarea PCR și secvențierea rfxap

clonele ADNc rfxap de lungime completă de la pacienți au fost izolate prin RT-PCR și subclonate în vector Pgem-t (Promega), conform procedurilor standard, și analizate pentru mutații. Mutațiile au fost apoi confirmate în ADN-ul pacienților și al părinților lor prin studierea fragmentelor de ADN genomic amplificate prin PCR care acoperă nucleotidele 116-540, așa cum este descris (17). PCR a fost realizat cu sistemul Expand high Fidelity PCR (Boeh-ringer Mannheim), așa cum este descris (10). Secvențierea plasmidelor recombinante a fost efectuată utilizând kitul de secvențiere a ciclului Terminatorului de colorare a prismei ABI (ABI) și un secvențiator ADN Biosystems aplicat. Produsele PCR genomice au fost secvențiate în ciclu direct prin utilizarea primerilor de secvențiere radiomarcați și a unui kit de Termo-secvențiere (Amersham) și analizate pe un gel de secvențiere.

detectarea RT-PCR a expresiei genei HLA de clasa II, DMB, Ii și GADPH

ARN citoplasmatic Total a fost extras din fibroblastele induse de IFN-induse prin metoda tiocianatului de guanidiu (23). Prima catenă ADNc a fost sintetizată cu revers transcriptază a virusului mieloblastozei aviare (AMV) (Boehringer Manneheim, SA) utilizând 10 ng de oligo (dT) ca primer și 5 hectolitri de ARN citoplasmatic. Amplificarea PCR s-a efectuat într-un volum final de 50 ilft, utilizând 1/30 din ADNc, 1 ilft din fiecare primer, 200 ilft din fiecare D NTP, 1,25 IU de polimerază AmpliTaq (Perkin-Elmer, Forster City, CA) și 0,1 ilftcci dCTP (Amersham) în fiecare probă. ADN-ul a fost denaturat la 94 de Centimetre C timp de 1 min, recoaptă timp de 1 min la 55 Centimetre C pentru a detecta toate genele, cu excepția GADPH și aDR, pentru care s-a utilizat o temperatură de recoacere de 58 Centimetre C. Extinderea la 72 C a fost de 1 min. Acest ciclu a fost repetat de 25 de ori pentru GADPH și aDR și de 27 de ori pentru celelalte gene, urmat de o alungire de 10 min la 72 C. probele au fost electroforezate pe geluri de acrilamidă 5% la 150 V Timp de 2 ore. gelurile au fost fixate și uscate înainte de expunere într-o cutie Fosforimager (dinamică moleculară) sau la film X-Omat (Kodak). Secvențele de primeri oligonucleotidici utilizate în amplificarea PCR au fost: pentru HLA-aDQ,- xvdq și DMB așa cum este descris de Peijnenburg (16), pentru GADPH, – aDR și lanțul Ii așa cum este descris de Vedrenne și colab. (24), precum și pentru-sec,- ADP și-sec, conform descrierii Hauber și colab. (25).

abrevieri

abrevieri
• celula B

  linia B-linia celulară limfoblastoidă

• IFN-uri

  interferon

• MHC

  complex major de histocompatibilitate

• RT-PCR

  reacție în lanț a transcripției inverse-polimerazei.

mulțumiri

îi mulțumim în mod special doctorului Peter van den Elsen pentru că ne-a permis să includem linia celulară ABI în experimentele de fuziune. Le suntem recunoscători Drs Andrew Cant și Mario Abinun pentru probele de sânge și biopsii cutanate de la pacienții tratați în unitatea lor pentru BMT și Dr.Klaus Schwarz pentru trimiterea probelor de sânge de la doi pacienți. De asemenea, mulțumim Fran Oixcoise Selz pentru colaborarea sa expertă și E. Barras pentru asistență tehnică excelentă.