a D Komplementációs csoport genetikai és molekuláris meghatározása MHC II. osztályú hiányban

absztrakt

négy komplementációs csoportot, A, B, C és D-t írtak le az MHC II.osztályú gének koordináta expressziójában hibás sejtvonalak között. Ezek közé tartoznak az MHC II. osztályú hiányban szenvedő betegekből létrehozott sejtvonalak és a kísérletileg létrehozott mutáns sejtvonalak. A D csoportot a többi csoporttal ellentétben sokáig csak a 6.1.6 mutáns sejtvonal képviselte. A gén felelős a hiba Ebben a csoportban, RFXAP, a közelmúltban klónozott, és kiderült, hogy mutálódott a 6.1.6 sejtvonal és három beteg. Itt több új HLA II. osztályú hiányos beteg fúziós kísérleteiről számolunk be, kiegészítve az ismert betegek többségének osztályozását a négy komplementációs csoportba. Öt nem rokon családból származó beteget a D komplementációs csoportba soroltak, míg kilenc másik az A és B komplementációs csoportba tartozik. A betegek egyike sem határozott meg új komplementációs csoportot. Osztályú expresszió teljes korrekcióját a D csoportba tartozó betegek sejtjeiben az RFXAP cDNS-sel történő transzfekcióval nyertük. Az RFXAP kódoló régiót minden betegnél mutáltnak találták. A mutációk ismétlődőnek bizonyultak, mivel az eddig jelentett nyolc független családban csak három különböző mutációt találtak.

Bevezetés

az MHC II.osztályú antigén expressziója sejtspecifikus módon szigorúan szabályozott (1), és elengedhetetlen az antigénspecifikus immunválaszokhoz (2). Osztályú gének transzkripcióját szabályozó mechanizmusokat alaposan tanulmányozták, különösen a HLA II.osztályú expresszióban hiányos sejtek felhasználásával. Ezek a sejtek vagy kísérletileg előállított mutánsok, vagy MHC II.osztályú hiányban szenvedő betegek sejtjei (3). A HLA II osztályú antigének hibás expressziójából eredő elsődleges immunhiány egy autoszomális recesszív rendellenesség, amelyet a fertőzésekre való rendkívüli érzékenység, valamint az antigén felismerésekor a sejtes és humorális T-sejt válaszok hiánya jellemez (4). A betegek sejtjei nem írják át a DR, DQ és DP HLA izotípusokat kódoló (3,5) MHC és MHC II osztályú géneket. Az intrafamilialis szegregációs elemzés kimutatta, hogy a genetikai rendellenesség az MHC régión kívül lokalizálódik, és transz-hatású szabályozó tényezőt(5) tartalmaz. A szomatikus fúziós kísérletekben mind a beteg sejtvonalakat, mind a kísérleti mutáns sejtvonalakat alkalmazták a transzkripciós faktorok számának értékelésére, amelyek feltétlenül szükségesek voltak a normál MHC II.osztályú expresszió biztosításához. Négy komplementációs csoportot azonosítottak: A, B, C és D (6,7).

az A és C csoport hibájáért felelős géneket komplementer klónozással klónozták az RJ 2.5.5 sejtvonalban (a csoport), illetve az SJO sejtvonalban (C csoport). A CIITA gén egy nem DNS-kötő fehérjét kódol, amely mind a konstitutív, mind az indukálható HLA II osztályú expressziót szabályozza, és mutálódik az A csoportba tartozó betegeknél (8). Az RFX5 gén az RFX komplex 75 kDa-s alegységét kódolja, és a C komplementációs csoportba tartozó betegeknél mutálódik (9). Egy harmadik gént, az RFXAP-ot (az RFX-hez kapcsolódó fehérjéhez) nemrégiben klónozták Durand et al. (10). Az RFXAP az RFX komplex egy kis, 36 kDa-s alegységét kódolja, és a gén mutációi felelősek a D komplementációs csoport hibájáért. az RFX5 és RFXAP fehérjék egy harmadik, 41 kDa-s fehérjével együtt egy multimer komplex RFX-t alkotnak, amely az MHC II.osztályú promoterek X box régiójához kötődik (11). Lehetséges, hogy a harmadik fehérjét kódoló gén mutálódik a B komplementációs csoportban, amelyben az érintett gént még nem azonosították. Az RFX komplex DNS-hez való kötődése legalább két pleiotropikus faktorral, az NFY-vel és az X2BP-vel (12-14) való kooperatív kötődéstől függ, de nem elegendő a II.osztályú transzkripcióhoz. A CIITA-nak kombinálnia kell az RFX-szel és a többi transzkripciós faktorral, amelyek a promoter X2 és Y dobozához kötődnek, hogy lehetővé tegyék az MHC II osztályú gének transzkripcióját.

itt ismertetjük 13 új HLA II.osztályú hiányos beteg és két korábban jelentett SS (15) és ABI (16) beteg szomatikus komplementációs elemzését, amelyek feltételezhetően különböző komplementációs csoportokat képviselnek. Az egyik új betegről kiderült, hogy az a csoportba tartozik, hét másik pedig a B csoportba.azonban, négy új beteg ugyanabba a komplementációs csoportba esett, mint az SS és az ABI betegek. Az utóbbi csoportot komplementációs analízissel, az RFXAP cDNS-sel történő transzfekcióval és az RFXAP gén mutációs analízisével reprezentálták.

eredmények

a betegek besorolása komplementációs csoportokba

szomatikus sejtfúziós kísérleteket végeztek B-sejtek vagy az A, B, C és D komplementációs csoportokat képviselő fibroblasztok alkalmazásával.mind a B-sejtek, mind a fibroblasztok csak a ZM beteg számára álltak rendelkezésre. Az 1. ábra példát mutat a HLA expresszióra, amelyet mind a B-sejtek, mind a fibroblasztok heterokarionjaiban nyertek. A fibroblaszt heterokarionokban a HLA II.osztályú pozitív sejtek 3-10%-át detektálták 48 órával az interferon-(IFN -) kezelés után. A B-sejtes heterokarionokban legfeljebb 5% HLA II. osztályú pozitív sejt volt kimutatható. A 2. ábra összefoglalja a szomatikus sejtfúziókkal nyert adatokat, a 2.táblázat pedig az újonnan vizsgált betegek osztályozását tartalmazza a korábban közzétett adatok alapján (6,7). Egy pakisztáni származású beteget az A csoportba soroltak, hét beteget a B csoportba, ötöt pedig a D csoportba soroltak.

amint azt az 1.táblázat mutatja, négy beteg, a ZM, az AkO, az ShA és az ShG fibroblasztjai kiegészítették az A és B komplementációs csoportot képviselő sejteket, de nem egészítették ki az SS fibroblaszt sejtvonalat, amelyet nem osztályoztak (15). A ZM B sejtek kiegészítették az A, B és C csoportból származó B sejteket, de nem egészítették ki a HLA II.osztály-negatív 6.1.6 B sejtvonalat, amely meghatározta a D csoportot. a ZM, AkO, Sha és ShG fibroblasztok fúziója után nem sikerült komplementációt elérni. Ezenkívül ezen fibroblaszt sejtvonalak egyike sem, beleértve a ZM-et is, kiegészítette az ABI sejtvonalat (16). Így az SS, AkO, ShA, ShG ABI és ZM betegek sejtjei mind a D komplementációs csoportba tartoznak.

a HLA II. osztályú expresszió korrekciója RFXAP cDNS-sel történő transzfekcióval

amint arról korábban beszámoltunk, az RFXAP cDNS-sel végzett tranziens transzfekciós kísérletekben az MHC II.osztályú expresszió korrekcióját ZM és ABI fibroblasztokban kaptuk (17). A 2. ábra a konstitutív HLA II. osztályú génexpresszió teljes korrekcióját ábrázolja a ZM beteg sejtjeiben, az egyetlen beteg, akinek B-sejtvonal állt rendelkezésre, az RFXAP cDNS-sel történő transzfekciót követően. Ezzel szemben a ciita vagy RFX5 cDNS-ekkel történő transzfekció nem állította vissza a HLA II. osztályú kifejezést; sem a transzfekció az üres vektorral. Hasonló eredményeket kaptak az AkO, az SS és az ShA betegek FIBROBLASZTJAIBAN az IFN-vállalkozók által indukált MHC II.osztály expressziójával kapcsolatban (az adatok nem jelennek meg).

az RFXAP gén mutációit SS, AkO, ShA és ShG betegeknél

a teljes hosszúságú RFXAP cDNS-eket SS, AkO, ShA és ShG betegekből származó PCR-rel amplifikálták a (10) leírás szerint, pgem vektorba szubklónozva és szekvenálva. Mind a négy betegnél az RFXAP cDNS mutációit azonosították. Ezeket a mutációkat a betegek és szüleik genomiális PCR termékeinek közvetlen szekvenálásával igazolták.

az SS családban, két érintett gyermekkel, a G 484 nukleotid homozigóta delécióját találták (484delg) (ábra. 3). Ugyanezt a mutációt mutatták ki a ZM családban (17). Az így kapott kereteltolódás az 525 nukleotidnál a kereten kívüli stop kodonhoz vezet. A szülők heterozigótának találták ezt a mutációt.

az AkO családban az rfxap gén 279. pozíciójában egy glutamin kodon helyettesítését egy stop kodonnal (CAG) detektáltuk (C279X) (ábra. 4). Ez a mutáció várhatóan 52 aminosavból álló csonka fehérjéhez vezet. Ugyanezt a mutációt korábban kimutatták az ABI betegben (17). Az AkO szülei heterozigóták erre a mutációra.

az SH családban, két érintett elsőfokú unokatestvérrel, ShA-val és ShG-vel, hét nukleotid ‘GCGGGCG’ beillesztését találták az RFXAP cDNS 151.pozíciójába. Ezt a mutációt 151ins7-nek nevezik. Ez a 144-150 nukleotidokat átfogó vad típusú szekvencia megkettőzését jelenti. Ez egy kereteltolódáshoz vezet, ami stop kodont eredményez a 329 nukleotidnál. A család mindkét betege örökölte ezt a homozigóta mutációt (ábra. 5). Mindkét beteg szülei heterozigóták voltak (az adatok nem jelennek meg).

MHC II., DMB és Ii. osztályú génexpresszió a D komplementációs csoportban

mivel a DRA és DPB gének reziduális expressziójáról számoltak be az ABI beteg sejtjeiben (16), az MHC II.osztályú génexpressziót RT-PCR-rel vizsgálták a D csoportba tartozó betegeknél. A DPA és/vagy DPB gének transzkripciójának változó szintjét figyelték meg négy betegnél, de az a csoportba tartozó kontroll betegeknél nem (ábra. 6). Azonban még a beteg ShG sejtjeiben is, amelyekben mind a DPA, mind a DPB transzkriptumokat detektálták, nem volt kimutatható membrán expressziója a DPA-nak (ábra). 7). Egyik beteg sejtvonalak voltak HLA DR, DQ, DMB vagy Ii lánc gén mRNS kimutatható RT-PCR (ábra. 6).

megbeszélés

a vizsgált betegek növekvő száma és a pleiotropikus tényezők ellenére kimutatták, hogy részt vesznek az MHC II.osztályú expresszió szabályozásában, a komplementációs csoportok száma, ezért az MHC II. osztályú immunhiányos betegeknél mutált tényezők továbbra is négyen maradnak (2. táblázat). Az ebben a munkában vizsgált 13 új, II. osztályú HLA-hiányos betegnél a jelentett betegek többségét komplementációs csoportokba sorolták, és egyik sem határoz meg ötödik komplementációs csoportot. Összesen, a 39 beteg 34 család, van 6 komplementációs csoport A, 22 A B csoportban, 3 A C csoportban és 8 A D csoportban két testvér részleges hibájával MHC II osztályú expresszió és enyhe formája immunhiány a közelmúltban egy további komplementációs csoportba sorolták (18). Ezek az atipikus betegek valószínűleg egy másik szindrómát képviselnek, mivel képesek reagálni az oltásra (19).

az ebben a jelentésben besorolt immunhiányos betegek közül csak a kh család tartozik két érintett testvérrel az a csoportba. míg a korábban leírt a csoportba tartozó betegek spanyol származásúak voltak (15), ezek az új esetek Pakisztáni eredetűek voltak, ami azt mutatja, hogy a CIITA mutációk nem korlátozódnak egyetlen etnikai származásra. Az új betegek közül hét A B csoportba tartozik, Észak-afrikai, olasz, török és Szaúd-Arábiai származásúak. Összesen, beleértve a BLS1 alapító beteget, 22 család van a B csoportban.

három család négy új betege, az SS-sel (15) együtt, a D csoportba tartozik, Észak-Afrikai, török és drúz származásúak. Klinikai és biológiai jellemzőik nem különböztek más HLA-hiányos betegektől. Egy kivételével azonban a DPA és/vagy DPB gének transzkripciója kimutatható volt. Reziduális DPA és DPB transzkripciót is jelentettek az ABI betegben (16). Az ebben a munkában vizsgált betegeknél a DP transzkriptumok jelenléte ellenére nem észleltek Érett dPa-adapterek heterodimereket a sejtfelszínen, talán azért, mert a Ii és a DM gének nem expresszálódnak. Így a hiba szivárgásából nem várható funkcionális következmény, amint az in vivo valóban megfigyelhető.

három különböző bizonyíték támasztja alá, hogy ezek a betegek a D komplementációs csoportba tartoznak, azaz szomatikus sejtfúziós analízis, a betegek sejtjeinek rfxap cDNS-sel történő transzfekciója és mutációs analízis. Egyértelmű sejtfúziós eredményeket kaptunk mind a fibroblasztok, mind a B-sejtvonalak alkalmazásával, amint azt a beteg ZM esetében kimutatták. Egyrészt a ZM sejtek és a 6.1.6 B sejtvonal, másrészt a ZM és az SS fibroblasztok közötti komplementáció hiánya validálta az összes többi fúziós adatot, beleértve az ABI fibroblasztok adatait is. A beteg korábbi téves besorolása az E csoportba (16) valószínűleg az alkalmazott 6.1.6 sejtvonal szivárgásának és/vagy a sejtvonalak közötti fúziós kísérleteknek (B-fibroblaszt sejtfúziók) volt köszönhető. A HLA II. osztályú expresszió teljes korrekciója a D csoportból származó sejtekben, nem pedig a többi csoportból, az RFXAP cDNS transzfekciójával megerősítette a tranziens transzfekciós kísérletek korábban jelentett adatait (10,17). Az RFXAP cDNS-t mutáltnak találták SS, AKO, Sh és ShG betegeknél, amint azt korábban a ZM és az ABI esetében is kimutatták (17).

az RFXAP három ismétlődő mutációját találták, azaz a szubsztitúciót, a deléciót és az inszerciót (ábra. 8). Az RFXAP gén nagyon magas CG-tartalma, amely polimeráz hibákhoz vezet, felelős lehet ezen mutációk kialakulásáért (20). Az AKO betegben kimutatott C279X átmenet megegyezik az ABI betegben korábban kimutatott mutációval (17), és az SS betegben kimutatott 484delg mutáció megegyezik a DA és ZM betegekben kimutatott mutációval (10,17). Mindkét esetben az előrejelzések szerint a mutációk kereteltolódást eredményeznek, illetve 52, illetve 136 aminosavból álló súlyosan csonka fehérjék szintézisét. Korábban fel nem fedezett mutációt találtak az SH unokatestvérekben, azaz duplikált nukleotidok beillesztését 144-150: ‘GCGGGGC’. Ez a mutáció egy kereteltolódást és egy csonka terméket is eredményez. Az összes mutációt az RFXAP cDNS 116-540 nukleotidjait átfogó régióban detektáltuk, amelyek egyetlen exonnak felelnek meg.

ezért az RFXAP génnek eddig csak három különböző mutációját figyelték meg hat különböző családban, beleértve a Da beteget is (10). A családok etnikai származása utalhat ezeknek a mutációknak az ősi eredetére, mivel az SS, RA és ZM betegek észak-afrikai eredetűek, míg az AKO és ABI betegek török származásúak. Figyelemre méltó azonban, hogy eddig csak az MHC II. osztályú hiány D csoportjában észleltek ilyen visszatérő mutációkat. Az A csoportban például a spanyol származású betegek magas prevalenciája ellenére (15) nem észleltek visszatérő allélt a különböző betegek között (8, valamint B. Lisowska-Grospierre et al., publikálatlan). Minden komplementációs csoportban, a betegek többsége a Földközi-tenger térségéből származik,ahol gyakori a rokonsági házasságok.

az RFXAP génmutációk, amelyek valószínűleg nem funkcionális fehérjéket eredményeznek, miért kapcsolódnak a maradék DPA / B gén transzkripcióhoz, nem ismert. Ez a megfigyelés bizonyítékot szolgáltat az MHC II.osztályú gén transzkripciós szabályozásának korlátozott, de jelentős diszkoordinált szabályozására. Ezek az eredmények további vizsgálatot igényelnek az RFXAP feltételezett specifikus szerepének meghatározásához a DRA/B, DQA/B versus DPA / B transzkripcióban.

anyagok és módszerek

betegek tizenegy, egymással nem rokon családból származó, MHC II.osztályú immunhiányos beteget vizsgáltak. Tizenegy család volt rokon. Észak-afrikai (három), olasz (kettő), török (három), drúz (kettő), Pakisztáni (kettő) és Szaúd-Arábiai (egy) származásúak voltak. A HLA II. osztályú antigének nem voltak kimutathatók a B-sejtek, a monociták és az aktivált T-sejtek sejtfelszínén. Az all klinikai megjelenését visszatérő fertőzések, súlyos hasmenés és a gyarapodás elmaradása jellemezte. Az antigén-specifikus humorális és celluláris válaszok hiányát az all-ben, valamint a hypogammaglobulin-aemia-t figyelték meg több betegnél. Ebben a jelentésben részletes vizsgálatokat jelentenek a betegek sejtjeiről, AkO, ShA, ShG, ZM. A ZM esetében korábban részleges eredményeket mutattak be (17). Az SS beteget már leírták (15). A szomatikus komplementációs kísérletekben szereplő beteg ABI jellemzőiről már beszámoltak (16).

sejttenyészet

B-sejtvonalakat hoztak létre a betegek B-sejtjeiből Epstein-Barr vírus (EBV) fertőzéssel. A betegek bőr fibroblasztjait bőrbiopsziával nyertük, és SV40-el transzformáltuk, amint azt korábban leírtuk (15). Az összes sejtvonalat 37-nél növesztettük C 5% CO2-ban az RPMI-1640-ben (Gibco BRL Lifesciences), kiegészítve 20% hő-inaktivált magzati borjú szérummal. A fibroblasztokat vagy azok heterokarionjait IFN-xhamsterrel(200 NE/ml) kezeltük 40 órán keresztül az MHC II.osztályú expresszió elemzése előtt.

immunfluoreszcencia

Anti-HLA-DR antitest 20,6 (21), anti-II.osztályú Bu27 (a kötőhelyen, Birmingham, Egyesült Királyság) és anti-I. osztályú W6/32 antitestet (ServaLab) alkalmaztak. A B-sejteket szuszpenzióban festettük, míg a fibroblasztokat etanollal rögzítettük az antitestekkel történő inkubálás előtt, a leírtak szerint (15). A sejtszuszpenziókat Beckton Dickinson citofluorográffal, a rögzített sejteket pedig Leitz Ortoplan mikroszkóppal elemeztük.

szomatikus komplementációs analízis

fibroblaszt-és B-sejtvonalak az újonnan megállapított betegektől, valamint kísérleti sejtvonalak (HVJ, ABL, SJO és 6.1.6.) a korábban az A, B, C, illetve D komplementációs csoportba sorolt betegektől használtuk ezeket a kísérleteket. A 6.1.6 sejtvonal egy geneticin által kiválasztott, teljesen negatív MHC II osztályú változat volt, amelyet kedvesen biztosított C. Alcaide (Institut Pasteur). Ezenkívül a fúziós kísérletek a következőket tartalmazták: a beteg SS sejtvonala, amely egy feltételezett x komplementációs csoportot képvisel (15), valamint a beteg ABI sejtvonala, a jelentések szerint az E csoportot képviseli (16), kedvesen szolgáltatta P. van Den Elsen. Mind a sejttípus, mind a B-sejtek, mind a fibroblasztok átmeneti heterokarionjait a korábban részletesen ismertetett elektrofúziós módszerrel nyertük (15). A fenotípusos reverziót immunfluoreszcenciával vagy northern blot-tal teszteltük 48-72 órával a sejtfúzió után. A fibroblasztok esetében a sejteket 200 NE/ml rekombináns IFN-KB (Genex) jelenlétében vagy hiányában tenyésztettük.

Transzfekciók

a transzfekcióhoz használt plazmidok pREP4 (Invitrogén), pREP4-RFXAP és EBO-Sfi (üres vektor) vagy EBO-CIITA voltak, amelyeket a v Steimle (8) biztosított. A B-sejtvonalak és a fibroblasztok transzfekcióját a leírtak szerint végeztük (22), 1-10 MHz plazmiddal, Jouan GTH 128/a elektropulzorral, a leírtak szerint (15). Stabil transzfektánsokat állítottunk elő a higromicin B-vel történő szelekcióval (250 ~ g/ml; Calbiochem). A transzfektált fibroblasztokat 200 NE/ml IFN-xhamsterrel kezeltük az MHC II.osztályú expresszió tesztelése előtt.

a betegekből származó RFXAP

teljes hosszúságú RFXAP cDNS-klónok PCR-amplifikációját és szekvenálását RT-PCR-rel izoláltuk és pgem-t vektorba (Promega) szubklónoztuk a standard eljárásoknak megfelelően, és elemeztük a mutációkat. A mutációkat ezután megerősítették a betegek és szüleik DNS-ében a 116-540 nukleotidokon átívelő PCR-amplifikált genomi DNS-fragmensek tanulmányozásával, a leírtak szerint (17). A PCR-t az Expand High Fidelity PCR rendszerrel (Boeh-Ringer Mannheim) végeztük, a leírtak szerint (10). A rekombináns plazmidok szekvenálását az ABI PRISM dye terminator cycle sequencing kit (ABI) és egy alkalmazott Biosystems DNS sequencer segítségével végeztük. A genomi PCR-termékeket radioaktívan jelölt szekvenáló primerek és Termoszekvenáz készlet (Amersham) alkalmazásával közvetlenül szekvenáltuk, majd szekvenáló gélen elemeztük.

a HLA II., DMB, Ii. és GADPH génexpresszió RT-PCR detektálását

teljes citoplazmatikus RNS-t IFN-indukált fibroblasztokból nyertük ki guanidium-tiocianát módszerrel (23). Az első szálú cDNS-t madár myeloblastosis vírus (AMV) reverz transzkriptázzal (Boehringer Manneheim, SA) szintetizáltuk, 10 ng oligo(dT) primerként és 5 6G citoplazmatikus RNS-t használva. PCR-amplifikációt végtérfogaton 50 db 6/30 cDNS-t, alapozónként 1 ml-t, d NTP-nként 200 ml-t, 1,25 ne amplitaq polimerázt (Perkin-Elmer, Forster City, CA) és 0,1 ne amplitaq polimerázt (Amersham) használva minden mintában. A DNS-t denaturáltuk 94 6CC-on 1 percig, majd 1 55 oc-on lágyítottuk, hogy minden gént detektáljunk, kivéve a GADPH-ot és az aDR-t, amelyeknél 58 oC-os hőkezelési hőmérsékletet alkalmaztunk. Kiterjesztés 72 C-nél 1 percig tartott. Ezt a ciklust 25-ször megismételtük a GADPH és az aDR esetében, és 27-szer a többi gén esetében, majd 10 perces megnyúlás következett 72 6CC-nél. a mintákat 5% – os akrilamid géleken elektroforézissel végeztük 150 V-on 2 órán át. a géleket rögzítettük és szárítottuk az expozíció előtt egy Foszforimager dobozban (molekuláris dinamika) vagy X-Omat filmre (Kodak). A PCR-amplifikáció során használt oligonukleotid primerek szekvenciái a következők voltak: a HLA-aDQ,- xhamdq és DMB esetében a Peijnenburg (16), a GADPH, – aDR és Ii lánc esetében a Vedrenne et al. (24), valamint a-Hauber et al.által leírt-addictiondr,- aDP és-addictiondp esetében. (25).

rövidítések

rövidítések
• B-sejt

  B-lymphoblastoid sejtvonal

• IFN-6

  interferon 6

• MHC

  fő hisztokompatibilitási komplex

• RT-PCR

  reverz transzkripciós-polimeráz láncreakció.

Köszönetnyilvánítás

külön köszönetet mondunk Drs Peter Van Den Elsennek, hogy lehetővé tette számunkra, hogy az ABI sejtvonalat bevonjuk a fúziós kísérletekbe. Hálásak vagyunk Drs Andrew Cant-nek és Mario Abinun-nak a BMT-vel kezelt betegek vérmintáiért és bőrbiopsziáiért, és Dr. Klaus Schwarz-nak, hogy elküldte nekünk a két beteg vérmintáit. Köszönettel tartozunk továbbá Fran Enterprises Selz-nek a szakértői együttműködésért és E. Barras-nak a kiváló technikai segítségért.