Definizione genetica e molecolare del Gruppo di complementazione D in carenza di MHC di classe II

Abstract

Quattro gruppi di complementazione, A, B, C e D, sono stati descritti tra linee cellulari difettose nell’espressione coordinata dei geni MHC di classe II. Questi includono linee cellulari stabilite da pazienti affetti da deficit di MHC di classe II e linee cellulari mutanti generate sperimentalmente. Il gruppo D, a differenza degli altri gruppi, è stato a lungo rappresentato solo dalla linea cellulare mutante 6.1.6. Il gene responsabile del difetto in questo gruppo, RFXAP, è stato recentemente clonato e trovato mutato nella linea cellulare 6.1.6 e in tre pazienti. Qui riportiamo esperimenti di fusione in diversi nuovi pazienti con carenza di HLA di classe II, completando la classificazione della maggior parte dei pazienti noti nei quattro gruppi di complementazione. I pazienti di cinque famiglie non correlate sono stati classificati nel gruppo di complementazione D, mentre altri nove rientrano nei gruppi di complementazione A e B. Nessuno dei pazienti ha definito un nuovo gruppo di integrazione. La correzione completa dell’espressione MHC di classe II è stata ottenuta in cellule di pazienti appartenenti al gruppo D mediante trasfezione con il cDNA RFXAP. La regione codificante RFXAP è risultata mutata in tutti i pazienti. Le mutazioni sono state trovate per essere ricorrenti poiché soltanto tre mutazioni differenti sono state trovate nelle otto famiglie non correlate riferite finora.

Introduzione

L’espressione dell’antigene MHC di classe II è strettamente controllata in modo cellulare specifico (1) ed è essenziale per le risposte immunitarie antigene-specifiche (2). I meccanismi che controllano la trascrizione dei geni MHC di classe II sono stati studiati ampiamente, in particolare utilizzando cellule carenti nell’espressione di classe II HLA. Queste cellule sono mutanti generati sperimentalmente o cellule di pazienti affetti da deficit di MHC di classe II (3). Questa immunodeficienza primaria derivante dall’espressione difettosa di antigeni di classe II HLA è una malattia autosomica recessiva caratterizzata da un’estrema suscettibilità alle infezioni e da un’assenza di risposte cellulari e umorali delle cellule T al riconoscimento dell’antigene (4). Le cellule dei pazienti non trascrivono i geni α e β MHC di classe II che codificano gli isotipi DR, DQ e DP HLA (3,5). L’analisi della segregazione intrafamiliare ha dimostrato che l’anomalia genetica è localizzata al di fuori della regione MHC e comporta fattori regolatori trans-agenti(5). Sia le linee cellulari dei pazienti che le linee cellulari mutanti sperimentali sono state utilizzate, in esperimenti di fusione somatica, per valutare il numero di fattori di trascrizione che erano assolutamente necessari per garantire la normale espressione MHC di classe II. Sono stati identificati quattro gruppi di complementazione, A, B, C e D (6,7).

I geni responsabili del difetto nei gruppi A e C sono stati clonati mediante clonazione di complementazione nella linea cellulare RJ 2.5.5 (gruppo A) e nella linea cellulare SJO (gruppo C), rispettivamente. Il gene CIITA codifica una proteina non legante il DNA che controlla l’espressione di classe II HLA costitutiva e inducibile ed è mutata nei pazienti del gruppo A (8). Il gene RFX5 codifica una subunità di 75 kDa del complesso RFX ed è mutato nei pazienti del gruppo di complementazione C (9). Un terzo gene, RFXAP (per la proteina associata a RFX), è stato clonato recentemente da Durand et al. (10). RFXAP codifica una piccola subunità di 36 kDa del complesso RFX e le mutazioni del gene sono responsabili del difetto nel gruppo di complementazione D. Le proteine RFX5 e RFXAP formano, insieme a una terza proteina di 41 kDa, un complesso multimerico RFX che si lega alla regione X box dei promotori MHC di classe II (11). È possibile che un gene che codifica questa terza proteina sia mutato nel gruppo di complementazione B, in cui il gene interessato non è stato ancora identificato. Il legame del complesso RFX al DNA dipende dal legame cooperativo con almeno due fattori pleiotropici, NFY e X2BP (12-14), ma non è sufficiente per la trascrizione di classe II. CIITA deve combinare con RFX e gli altri fattori di trascrizione che si legano alle scatole X2 e Y del promotore per consentire la trascrizione dei geni MHC di classe II.

Descriviamo qui l’analisi di complementazione somatica di 13 nuovi pazienti con deficit di HLA di classe II e due pazienti precedentemente segnalati SS (15) e ABI (16), sospettati di rappresentare diversi gruppi di complementazione. Uno dei nuovi pazienti è risultato appartenere al gruppo A e altri sette al gruppo B. Tuttavia, quattro nuovi pazienti sono caduti nello stesso gruppo di complementazione dei pazienti SS e ABI. Quest’ultimo gruppo è stato trovato per rappresentare il gruppo D mediante analisi di complementazione, trasfezione con il cDNA RFXAP e analisi di mutazione del gene RFXAP.

Risultati

Classificazione dei pazienti in gruppi di complementazione

Gli esperimenti di fusione cellulare somatica sono stati eseguiti utilizzando cellule B o fibroblasti che rappresentano gruppi di complementazione A, B, C e D. Sia le cellule B che i fibroblasti erano disponibili solo per il paziente ZM. La figura 1 mostra un esempio di espressione HLA ottenuta in eterocarioni di entrambe le cellule B e fibroblasti. Negli eterocarioni dei fibroblasti, il 3-10% delle cellule HLA di classe II-positiva è stato rilevato 48 h dopo il trattamento con interferone-γ (IFN-γ). Negli eterocarioni delle cellule B, non è stato rilevato più del 5% di cellule HLA positive di classe II. La figura 2 riassume i dati ottenuti dalle fusioni di cellule somatiche e la Tabella 2 fornisce la classificazione dei pazienti appena studiati rispetto ai dati precedentemente pubblicati (6,7). Un paziente di origine pakistana è stato classificato nel gruppo A, sette pazienti sono stati inseriti nel gruppo B e cinque sono stati classificati nel gruppo D. Nessuno dei pazienti apparteneva al gruppo C.

Come la Tabella 1 mostra, i fibroblasti di quattro pazienti, ZM, AkO, ShA e ShG, completato cellule che rappresentano complementazione gruppi A e B, ma non completano la SS linea cellulare di fibroblasti, che non era stato classificato (15). Le cellule ZM B integravano le cellule B dei gruppi A, B e C ma non completavano la linea cellulare HLA II-negativa 6.1.6 B che definiva il gruppo D. Non è stata ottenuta alcuna complementazione dopo la fusione tra fibroblasti ZM, AkO, Sha e ShG. Inoltre, nessuna di queste linee cellulari dei fibroblasti, incuding ZM, ha completato la linea cellulare ABI (16). Pertanto, le cellule dei pazienti SS, AkO, ShA, ShG ABI e ZM appartengono tutte al gruppo di complementazione D.

Correzione dell’espressione di classe II HLA mediante trasfezione con il cDNA RFXAP

Come riportato in precedenza, in esperimenti di trasfezione transitoria con il cDNA RFXAP, è stata ottenuta una correzione dell’espressione di classe II MHC nei fibroblasti ZM e ABI (17). La figura 2 illustra la correzione completa dell’espressione genica di classe II HLA costitutiva nelle cellule del paziente ZM, l’unico paziente per il quale era disponibile una linea di cellule B, dopo la trasfezione con il cDNA RFXAP. Al contrario, la trasfezione con CDNA CIITA o RFX5 non ha ripristinato l’espressione di classe II HLA; nemmeno la trasfezione con il vettore vuoto. Risultati simili sono stati ottenuti per l’espressione di classe II MHC indotta da IFN-γ nei fibroblasti di pazienti AkO, SS e ShA (dati non mostrati).

Mutazioni del gene RFXAP in pazienti SS, AkO, ShA e ShG

I CDNA RFXAP a lunghezza intera sono stati amplificati mediante PCR da pazienti SS, AkO, ShA e ShG, come descritto (10), succlonati in un vettore pGEM e sequenziati. In tutti e quattro i pazienti sono state identificate mutazioni nel cDNA RFXAP. Queste mutazioni sono state poi confermate dal sequenziamento diretto dei prodotti genomici PCR dai pazienti e dai loro genitori.

Nella famiglia SS, con due bambini affetti, è stata trovata una delezione omozigote di un G al nucleotide 484 (484delG) (Fig. 3). La stessa mutazione è stata rilevata nella famiglia ZM (17). Il frameshift risultante porta ad un codone di arresto fuori fotogramma al nucleotide 525. I genitori sono stati trovati per essere eterozigoti per questa mutazione.

Nella famiglia AkO, è stata rilevata una sostituzione di un codone di glutammina con un codone di arresto (CAG→TAG) nella posizione 279 del gene RFXAP (C279X) (Fig. 4). Si prevede che questa mutazione porti a una proteina troncata di 52 aminoacidi. La stessa mutazione è stata rilevata in precedenza nel paziente ABI (17). I genitori di AkO sono eterozigoti per questa mutazione.

Nella famiglia Sh, con due cugini di primo grado colpiti ShA e ShG, è stato trovato un inserimento di sette nucleotidi ‘GCGGGCG’ alla posizione 151 del cDNA RFXAP. Questa mutazione è designata 151ins7. Rappresenta una duplicazione della sequenza wild-type che copre i nucleotidi 144-150. Conduce ad un frameshift con conseguente codone di arresto al nucleotide 329. Entrambi i pazienti di questa famiglia hanno ereditato questa mutazione omozigote (Fig. 5). I genitori di entrambi i pazienti erano eterozigoti (dati non mostrati).

MHC di classe II, DMB e Ii espressione genica a catena nel gruppo di complementazione D

Poiché l’espressione residua dei geni DRA e DPB era stata riportata nelle cellule del paziente ABI (16), l’espressione genica MHC di classe II è stata esaminata nei pazienti del gruppo D mediante RT-PCR. Un livello variabile di trascrizione è stato osservato per i geni DPA e/o DPB in quattro dei pazienti, ma non in un paziente di controllo del gruppo A (Fig. 6). Tuttavia, anche nelle cellule ShG dei pazienti, in cui sono stati rilevati sia i trascritti DPA che DPB, non è stata rilevata alcuna espressione di membrana rilevabile del complesso DPaß (Fig. 7). In nessuna delle linee cellulari del paziente erano HLA DR, DQ, DMB o mRNA gene catena Ii rilevato da RT-PCR (Fig. 6).

Discussione

Nonostante il crescente numero di pazienti esaminati e pleiotropico fattori dimostrato di essere coinvolti nel controllo dell’espressione di MHC di classe II, il numero di gruppi di complementazione, e, pertanto, fattori mutati in MHC di classe II pazienti con immunodeficienza, rimane a quattro (Tabella 2). Con i 13 nuovi pazienti HLA carenti di classe II studiati in questo lavoro, la maggior parte dei pazienti segnalati è stata ora classificata in gruppi di complementazione e nessuno definisce un quinto gruppo di complementazione. Complessivamente, dei 39 pazienti di 34 famiglie, ci sono 6 nel gruppo di complementazione A, 22 nel gruppo B, 3 nel gruppo C e 8 nel gruppo D. Due fratelli con un difetto parziale dell’espressione MHC di classe II e con una forma lieve di immunodeficienza recentemente sono stati classificati in un ulteriore gruppo di complementazione (18). Questi pazienti atipici rappresentano probabilmente un’altra sindrome, poiché sono in grado di rispondere alla vaccinazione (19).

Tra i pazienti immunodeficienti classificati in questo rapporto, solo la famiglia Kh, con due fratelli affetti, appartiene al gruppo A. Mentre i pazienti del gruppo A precedentemente descritti sono stati di origine spagnola (15), questi nuovi casi erano di origine pakistana, dimostrando che le mutazioni di CIITA non sono limitate a un’origine etnica. Sette dei nuovi pazienti rientrano nel gruppo B e sono di origine nordafricana, italiana, turca e saudita. Complessivamente, incluso il paziente fondatore di BLS1, ci sono 22 famiglie nel gruppo B.

Quattro nuovi pazienti in tre famiglie, insieme al paziente SS (15), rientrano nel gruppo D. Sono di origine nordafricana, turca e drusa. Le loro caratteristiche cliniche e biologiche non differivano da altri pazienti con deficit di HLA. Tuttavia, in tutti tranne uno, la trascrizione dei geni DPA e/o DPB potrebbe essere rilevata. La trascrizione residua di DPA e DPB è stata riportata anche nel paziente ABI (16). Nei pazienti studiati in questo lavoro, nonostante la presenza di trascritti DP, gli eterodimeri DPa-β maturi non sono stati rilevati sulla superficie cellulare, forse perché i geni Ii e DM non sono espressi. Pertanto, non ci si può aspettare conseguenze funzionali da questa perdita nel difetto, come effettivamente osservato in vivo.

Tre diverse linee di evidenza dimostrano che questi pazienti appartengono al gruppo di complementazione D, cioè analisi di fusione cellulare somatica, trasfezione delle cellule dei pazienti con il cDNA RFXAP e analisi mutazionale. Risultati univoci di fusione cellulare sono stati ottenuti utilizzando sia fibroblasti e linee di cellule B, come dimostrato per il paziente ZM. L’assenza di complementazione tra le cellule ZM e la linea cellulare 6.1.6 B, da un lato, e tra i fibroblasti ZM e SS, dall’altro, ha convalidato tutti gli altri dati di fusione, compresi quelli dei fibroblasti ABI. La precedente errata classificazione di questo paziente nel gruppo ” E ” (16) era probabilmente dovuta alla perdita della linea cellulare 6.1.6 utilizzata e/o a esperimenti di fusione eseguiti tra linee cellulari (fusioni di cellule B-fibroblasti). Una correzione completa dell’espressione di classe II HLA nelle cellule del gruppo D, e non degli altri gruppi, mediante trasfezione del cDNA RFXAP ha confermato i dati precedentemente riportati da esperimenti di trasfezione transitoria (10,17). Il cDNA di RFXAP è stato trovato per essere mutato in pazienti SS, AKO, Sh e ShG, come anche precedentemente mostrato per ZM e ABI (17).

Sono stati trovati tre tipi di mutazioni ricorrenti di RFXAP, cioè sostituzione, delezione e inserimento (Fig. 8). Un contenuto molto elevato di CG nel gene RFXAP che porta a errori di polimerasi potrebbe spiegare la generazione di queste mutazioni (20). La transizione C279X rilevata nel paziente AKO è identica alla mutazione precedentemente rilevata nel paziente ABI (17) e la mutazione 484delG nel paziente SS è identica a quella rilevata nei pazienti DA e ZM (10,17). In entrambi i casi, si prevede che le mutazioni diano origine a un frameshift e alla sintesi di proteine gravemente troncate di 52 e 136 aminoacidi, rispettivamente. Una mutazione precedentemente non scoperta è stata trovata nei cugini Sh, cioè un inserimento di nucleotidi duplicati 144-150: ‘GCGGGC’. Questa mutazione si traduce anche in un frameshift e un prodotto troncato. Tutte le mutazioni sono state rilevate all’interno di una regione che copre i nucleotidi 116-540 del cDNA RFXAP, che corrispondono a un singolo esone.

Pertanto, solo tre diverse mutazioni del gene RFXAP sono state osservate finora in sei diverse famiglie, incluso il paziente DA (10). L’origine etnica delle famiglie potrebbe indicare un’origine ancestrale di queste mutazioni poiché i pazienti SS, RA e ZM sono di origine nordafricana, mentre i pazienti AKO e ABI sono di origine turca. Tuttavia, sorprendentemente, solo nel gruppo D della carenza di MHC di classe II sono state finora rilevate tali mutazioni ricorrenti. Nel gruppo A, ad esempio, nonostante un’alta prevalenza di pazienti di origine spagnola (15), non è stato rilevato alcun allele ricorrente tra i diversi pazienti (8, e B. Lisowska-Grospierre et al., inedito). In tutti i gruppi di complementazione, la maggior parte dei pazienti proviene dall’area mediterranea, dove i matrimoni consanguinei sono frequenti.

Perché le mutazioni del gene RFXAP, probabilmente con conseguente proteine non funzionali, sono associate alla trascrizione residua del gene DPA / B non è chiaro. Questa osservazione fornisce la prova per una regolazione discoordinate limitata ma significativa della regolazione della trascrizione del gene di classe II di MHC. Questi risultati richiedono ulteriori studi per determinare un presunto ruolo specifico di RFXAP nella trascrizione DRA/B, DQA / B rispetto a DPA / B.

Materiali e metodi

Pazienti

Sono stati studiati tredici pazienti finora non descritti provenienti da undici famiglie non correlate affette da immunodeficienza MHC di classe II. Undici famiglie erano consanguinee. Erano di origine nordafricana (tre), italiana (due), turca (tre), drusa (due), pakistana (due) e saudita (uno). In tutti i pazienti, gli antigeni di classe II HLA non erano rilevabili sulla superficie cellulare delle cellule B, dei monociti e delle cellule T attivate. La presentazione clinica in all è stata caratterizzata da infezioni ricorrenti, diarrea grave e mancata crescita. L’assenza di risposte umorali e cellulari antigene-specifiche è stata osservata in tutti e ipogammaglobulina-aemia in molti dei pazienti. In questo rapporto, sono riportati studi dettagliati sulle cellule dei pazienti, AkO, ShA, ShG, ZM. Per ZM, i risultati parziali sono stati presentati in precedenza (17). Il paziente SS è già stato descritto (15). Le caratteristiche dell’ABI del paziente, incluse negli esperimenti di complementazione somatica, sono già state riportate (16).

Colture cellulari

Linee cellulari B sono state stabilite dalle cellule B dei pazienti per infezione da virus Epstein-Barr (EBV). I fibroblasti cutanei dei pazienti sono stati ottenuti mediante biopsia cutanea e trasformati con SV40, come descritto in precedenza (15). Tutte le linee cellulari sono state coltivate a 37°C nel 5% di CO2 in RPMI-1640 (Gibco BRL Lifesciences) integrato con il 20% di siero di vitello fetale inattivato dal calore. I fibroblasti o i loro eterocarioni sono stati trattati da IFN-γ (200 UI/ml) per 40 h prima dell’analisi dell’espressione MHC di classe II.

Immunofluorescenza

Sono stati utilizzati anticorpi anti-HLA-DR 20,6 (21), anti-classe II Bu27 (Il sito di legame, Birmingham, Regno Unito) e anti-classe I anticorpo W6/32 (ServaLab). Le cellule B sono state colorate in sospensione, mentre i fibroblasti sono stati fissati con etanolo prima dell’incubazione con anticorpi, come descritto (15). Le sospensioni cellulari sono state analizzate con un citofluorografo Beckton Dickinson e le cellule fisse con un microscopio Leitz Ortoplan.

Analisi di complementazione somatica

Linee di fibroblasti e cellule B dei pazienti di nuova costituzione, nonché linee cellulari sperimentali (HVJ, ABL, SJO e 6.1.6.) da pazienti precedentemente classificati in gruppi di complementazione A, B, C e D, rispettivamente, sono stati utilizzati in questi esperimenti. La linea cellulare 6.1.6 era una variante MHC classe II completamente negativa selezionata dalla genetica, gentilmente fornita da C. Alcaide (Institut Pasteur). Inoltre, gli esperimenti di fusione includevano: la linea cellulare SS del paziente, che rappresenta un presunto gruppo di complementazione X (15), e la linea cellulare ABI del paziente, segnalata per rappresentare il gruppo E (16), gentilmente fornita da P. van den Elsen. Eterocarioni transitori di entrambi i tipi di cellule, cellule B e fibroblasti sono stati ottenuti con il metodo di elettrofusione descritto in dettaglio in precedenza (15). La reversione fenotipica è stata testata mediante immunofluorescenza o con northern blot 48-72 h dopo la fusione cellulare. Nel caso dei fibroblasti, le cellule sono state coltivate in presenza o assenza di 200 UI/ml di IFN-γ ricombinante (Genex).

Trasfezioni

I plasmidi utilizzati per la trasfezione erano pREP4 (Invitrogen), pREP4-RFXAP e EBO-Sfi (vettore vuoto) o EBO-CIITA, gentilmente forniti da V Steimle (8). Trasfezioni di linee cellulari B e fibroblasti sono state effettuate come descritto (22) con 1-10 µg di ciascun plasmide, utilizzando un elettropulsore JOUAN GTH 128/A, come descritto (15). I transfettanti stabili sono stati generati dalla selezione con igromicina B (250 µg/ml; Calbiochem). I fibroblasti trasfettati sono stati trattati con 200 UI/ml di IFN-γ prima del test per l’espressione MHC di classe II.

PCR amplificazione e sequenziamento di RFXAP

Cloni di cDNA RFXAP a lunghezza intera di pazienti sono stati isolati mediante RT-PCR e subclonati nel vettore PGEM-T (Promega), secondo procedure standard, e analizzati per le mutazioni. Le mutazioni sono state poi confermate nel DNA dei pazienti e dei loro genitori studiando frammenti di DNA genomico amplificati da PCR che abbracciano i nucleotidi 116-540, come descritto (17). La PCR è stata eseguita con il sistema Expand High Fidelity PCR (Boeh-ringer Mannheim), come descritto (10). Il sequenziamento dei plasmidi ricombinanti è stato eseguito utilizzando ABI PRISM dye terminator cycle sequencing kit (ABI) e un Applied Biosystems DNA sequencer. I prodotti di PCR genomica sono stati sequenziati in ciclo direttamente utilizzando primer di sequenziamento radiomarcati e un kit di termo-sequenasi (Amersham) e analizzati su un gel di sequenziamento.

Il rilevamento RT-PCR dell’espressione genica HLA di classe II, DMB, Ii e GADPH

L’RNA citoplasmatico totale è stato estratto dai fibroblasti indotti da IFN-γ con il metodo del tiocianato di guanidio (23). Il primo filamento cDNA è stato sintetizzato con la trascrittasi inversa del virus della mieloblastosi aviaria (AMV) (Boehringer Manneheim, SA) utilizzando 10 ng di oligo (dT) come primer e 5 µg di RNA citoplasmatico. L’amplificazione PCR è stata eseguita in un volume finale di 50 µl utilizzando 1/30 del cDNA, 1 µM di ciascun primer, 200 µM di ciascun d NTP, 1,25 UI di AmpliTaq polimerasi (Perkin-Elmer, Forster City, CA) e 0,1 µCi dCTP (Amersham) in ciascun campione. Il DNA è stato denaturato a 94 ° C per 1 min, ricotto per 1 min a 55 ° C per rilevare tutti i geni tranne GADPH e aDR, per i quali è stata utilizzata una temperatura di ricottura di 58°C. L’estensione a 72°C è stata per 1 min. Questo ciclo è stato ripetuto 25 volte per GADPH e aDR e 27 volte per gli altri geni, seguito da un allungamento di 10 minuti a 72°C. I campioni sono stati elettroforesi su gel di acrilammide al 5% a 150 V per 2 ore. I gel sono stati fissati ed essiccati prima dell’esposizione in una scatola di fosforimager (Dinamica molecolare) o Le sequenze di primer oligonucleotidici utilizzate nell’amplificazione della PCR erano: per HLA-aDQ, -ßDQ e DMB come descritto da Peijnenburg (16), per GADPH, -ADR e Ii chain come descritto da Vedrenne et al. (24), e per-ßDR,- aDP e-ßDP come descritto da Hauber et al. (25).

Abbreviazioni

Abbreviazioni
• B-cell

  linea B-linea di cellule linfoblastoidi

• IFN-γ

  interferone γ

• MHC

  complesso maggiore di istocompatibilità

• RT-PCR

  reverse transcription-polymerase chain reaction.

Ringraziamenti

Ringraziamo in particolare il Drs Peter van den Elsen per averci permesso di includere la linea cellulare ABI negli esperimenti di fusione. Siamo grati ai Dr Andrew Cant e Mario Abinun per i campioni di sangue e le biopsie cutanee di pazienti trattati nella loro Unità per la BMT, e al Dr Klaus Schwarz per averci inviato i campioni di sangue di due pazienti. Ringraziamo anche Françoise Selz per la sua esperta collaborazione e E. Barras per l’eccellente assistenza tecnica.