Genetische und molekulare Definition der Komplementationsgruppe D bei MHC-Klasse-II-Mangel

Zusammenfassung

Vier Komplementationsgruppen, A, B, C und D, wurden unter Zelllinien beschrieben, die in der Koordinatenexpression von MHC-Klasse-II-Genen defekt sind. Dazu gehören Zelllinien, die von Patienten mit MHC-Klasse-II-Mangel etabliert wurden, und experimentell erzeugte mutierte Zelllinien. Gruppe D war im Gegensatz zu den anderen Gruppen lange Zeit nur durch die 6.1.6-mutierte Zelllinie vertreten. Das für den Defekt verantwortliche Gen in dieser Gruppe, RFXAP, wurde kürzlich kloniert und in der 6.1.6-Zelllinie und bei drei Patienten als mutiert befunden. Hier berichten wir über Fusionsexperimente bei mehreren neuen HLA-Klasse-II-defizienten Patienten, Abschluss der Klassifizierung der Mehrheit der bekannten Patienten in die vier Komplementationsgruppen. Patienten aus fünf nicht verwandten Familien wurden in die Komplementärgruppe D eingeteilt, während neun andere in die Komplementärgruppen A und B fallen. Keiner der Patienten definierte eine neue Komplementationsgruppe. Die vollständige Korrektur der MHC-Klasse-II-Expression wurde in Zellen von Patienten der Gruppe D durch Transfektion mit der RFXAP-cDNA erhalten. Die RFXAP-kodierende Region war bei allen Patienten mutiert. Es wurde festgestellt, dass Mutationen wiederkehrend sind, da in den bisher gemeldeten acht unabhängigen Familien nur drei verschiedene Mutationen gefunden wurden.

Einleitung

Die MHC-Klasse-II-Antigenexpression wird zellspezifisch streng kontrolliert (1) und ist essentiell für antigenspezifische Immunantworten (2). Mechanismen, die die Transkription von MHC-Klasse-II-Genen steuern, wurden ausführlich untersucht, insbesondere unter Verwendung von Zellen, die eine HLA-Klasse-II-Expression aufweisen. Diese Zellen sind entweder experimentell erzeugte Mutanten oder Zellen von Patienten mit MHC-Klasse-II-Mangel (3). Diese primäre Immunschwäche, die aus einer defekten Expression von HLA-Klasse-II-Antigenen resultiert, ist eine autosomal-rezessive Erkrankung, die durch eine extreme Anfälligkeit für Infektionen und ein Fehlen zellulärer und humoraler T-Zell-Reaktionen bei Antigenerkennung gekennzeichnet ist (4). Zellen der Patienten transkribieren keine α- und β-MHC-Klasse-II-Gene, die für die DR-, DQ- und DP-HLA-Isotypen kodieren (3,5). Die intrafamiliale Segregationsanalyse hat gezeigt, dass die genetische Anomalie außerhalb der MHC-Region lokalisiert ist und transwirksame regulatorische Faktoren beinhaltet (5). Sowohl Patientenzelllinien als auch experimentelle mutierte Zelllinien wurden in somatischen Fusionsexperimenten verwendet, um die Anzahl der Transkriptionsfaktoren zu bewerten, die unbedingt erforderlich waren, um eine normale MHC-Klasse-II-Expression sicherzustellen. Es wurden vier Komplementationsgruppen identifiziert, A, B, C und D (6,7).

Die für den Defekt verantwortlichen Gene in den Gruppen A und C wurden durch Komplementationsklonierung in die RJ 2.5.5-Zelllinie (Gruppe A) bzw. die SJO-Zelllinie (Gruppe C) kloniert. Das CIITA-Gen kodiert für ein nicht-DNA-bindendes Protein, das sowohl die konstitutive als auch die induzierbare HLA-Klasse-II-Expression steuert und bei Patienten der Gruppe A mutiert ist (8). Das RFX5-Gen kodiert für eine 75-kDa-Untereinheit des RFX-Komplexes und ist bei Patienten aus der Komplementationsgruppe C mutiert (9). Ein drittes Gen, RFXAP (für RFX-assoziiertes Protein), wurde kürzlich von Durand et al. (10). RFXAP kodiert für eine kleine 36-kDa-Untereinheit des RFX-Komplexes, und Mutationen des Gens sind für den Defekt in der Komplementationsgruppe D verantwortlich. Die Proteine RFX5 und RFXAP bilden zusammen mit einem dritten Protein von 41 kDa einen multimeren Komplex RFX, der an die X-Box-Region von MHC-Klasse-II-Promotoren bindet (11). Es ist möglich, dass ein Gen, das dieses dritte Protein kodiert, in der Komplementationsgruppe B mutiert ist, in der das betroffene Gen noch nicht identifiziert wurde. Die Bindung des RFX-Komplexes an DNA hängt von der kooperativen Bindung mit mindestens zwei pleiotropen Faktoren, NFY und X2BP (12-14), ab, ist jedoch für die Transkription der Klasse II nicht ausreichend. CIITA muss mit RFX und den anderen Transkriptionsfaktoren kombiniert werden, die an die X2- und Y-Boxen des Promotors binden, um die Transkription von MHC-Klasse-II-Genen zu ermöglichen.

Wir beschreiben hier die somatische Komplementationsanalyse von 13 neuen HLA-Klasse-II-Mangelpatienten und zwei zuvor gemeldeten Patienten SS (15) und ABI (16), die im Verdacht stehen, verschiedene Komplementationsgruppen zu repräsentieren. Einer der neuen Patienten gehörte zur Gruppe A und sieben weitere zur Gruppe B. Vier neue Patienten fielen jedoch in dieselbe Ergänzungsgruppe wie die Patienten SS und ABI. Die letztere Gruppe wurde durch Komplementationsanalyse, Transfektion mit der RFXAP-cDNA und Mutationsanalyse des RFXAP-Gens als Gruppe D gefunden.

Ergebnisse

Einteilung der Patienten in Komplementationsgruppen

Somatische Zellfusionsexperimente wurden entweder mit B-Zellen oder Fibroblasten durchgeführt, die die Komplementationsgruppen A, B, C und D repräsentierten. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für die HLA-Expression, die in Heterokaryonen von B-Zellen und Fibroblasten erhalten wurde. In Fibroblasten-Heterokaryonen wurden 48 h nach Interferon-γ (IFN-γ) -Behandlung 3-10% der HLA-Klasse II-positiven Zellen nachgewiesen. In B-Zell-Heterokaryonen konnten nicht mehr als 5% HLA-Klasse II-positive Zellen nachgewiesen werden. Abbildung 2 fasst die durch somatische Zellfusionen erhaltenen Daten zusammen, und Tabelle 2 gibt die Klassifizierung der neu untersuchten Patienten in Bezug auf zuvor veröffentlichte Daten an (6,7). Ein Patient pakistanischer Herkunft wurde in Gruppe A eingeteilt, sieben Patienten wurden in Gruppe B und fünf in Gruppe D eingeteilt.

Wie Tabelle 1 zeigt, komplementierten Fibroblasten von vier Patienten, ZM, AkO, ShA und ShG, Zellen, die die Komplementationsgruppen A und B repräsentierten, aber nicht die SS-Fibroblastenzelllinie, die nicht klassifiziert worden war (15). ZM-B-Zellen komplementierten B-Zellen aus den Gruppen A, B und C, komplementierten jedoch nicht die HLA-Klasse II-negative 6.1.6 B-Zelllinie, die Gruppe D definiert. Darüber hinaus ergänzte keine dieser Fibroblastenzelllinien, einschließlich ZM, die Zelllinie ABI (16). Somit gehören Zellen von Patienten SS, AkO, ShA, ShG ABI und ZM alle zur Komplementationsgruppe D.

Korrektur der HLA-Klasse-II-Expression durch Transfektion mit der RFXAP-cDNA

Wie bereits berichtet, wurde in transienten Transfektionsexperimenten mit der RFXAP-cDNA eine Korrektur der MHC-Klasse-II-Expression in ZM- und ABI-Fibroblasten erhalten (17). Abbildung 2 zeigt die vollständige Korrektur der konstitutiven HLA-Klasse-II-Genexpression in Zellen von Patient ZM, dem einzigen Patienten, für den eine B-Zelllinie verfügbar war, nach Transfektion mit der RFXAP-cDNA. Im Gegensatz dazu stellte die Transfektion mit CIITA- oder RFX5-cDNAs die HLA-Klasse-II-Expression nicht wieder her; ebenso wenig die Transfektion mit dem leeren Vektor. Ähnliche Ergebnisse wurden für die IFN-γ-induzierte MHC-Klasse-II-Expression in Fibroblasten von Patienten AkO, SS und ShA erhalten (Daten nicht gezeigt).

Mutationen des RFXAP Gens bei Patienten SS, AkO, ShA und ShG

Full-length RFXAP cDNAs wurden durch PCR von Patienten SS, AkO, ShA und ShG amplifiziert, wie beschrieben (10), in einen pGEM Vektor subkloniert und sequenziert. Bei allen vier Patienten wurden Mutationen in der RFXAP-cDNA identifiziert. Diese Mutationen wurden dann durch direkte Sequenzierung von genomischen PCR-Produkten der Patienten und ihrer Eltern bestätigt.

In der Familie SS mit zwei betroffenen Kindern wurde eine homozygote Deletion eines G am Nukleotid 484 gefunden (484delG) (Abb. 3). Die gleiche Mutation wurde in der Familie ZM nachgewiesen (17). Die resultierende Frameshift führt zu einem Out-of-Frame-Stop-Codon am Nukleotid 525. Die Eltern waren für diese Mutation heterozygot.

In der Familie AkO wurde eine Substitution eines Glutamin-Codons durch ein Stop-Codon (CAG→TAG) an Position 279 des RFXAP-Gens nachgewiesen (C279X) (Abb. 4). Es wird vorhergesagt, dass diese Mutation zu einem verkürzten Protein von 52 Aminosäuren führt. Die gleiche Mutation wurde zuvor bei Patient ABI nachgewiesen (17). Die Eltern von AkO sind heterozygot für diese Mutation.

In der Familie Sh mit zwei betroffenen Cousins ersten Grades ShA und ShG wurde eine Insertion von sieben Nukleotiden ‘GCGGGCG’ an Position 151 der RFXAP-cDNA gefunden. Diese Mutation wird als 151ins7 bezeichnet. Es stellt eine Duplikation der Wildtyp-Sequenz dar, die die Nukleotide 144-150 umfasst. Es führt zu einem Frameshift, der zu einem Stopcodon am Nukleotid 329 führt. Beide Patienten aus dieser Familie erbten diese homozygote Mutation (Abb. 5). Die Eltern beider Patienten waren heterozygot (Daten nicht gezeigt).

MHC-Klasse-II-, DMB- und Ii-Kettengenexpression in der Komplementationsgruppe D

Da die Restexpression von DRA- und DPB-Genen in Zellen von Patienten ABI (16) berichtet wurde, wurde die MHC-Klasse-II-Genexpression bei Patienten der Gruppe D durch RT-PCR untersucht. Ein variabler Transkriptionsgrad für DPA- und / oder DPB-Gene wurde bei vier der Patienten beobachtet, nicht jedoch bei einem Kontrollpatienten aus Gruppe A (Abb. 6). Selbst in Patienten-ShG-Zellen, in denen sowohl DPA- als auch DPB-Transkripte nachgewiesen wurden, gab es jedoch keine nachweisbare Membranexpression des DPaß-Komplexes (Abb. 7). In keiner der Patientenzelllinien wurden HLA DR, DQ, DMB oder Ii Kettengen-mRNA mittels RT-PCR nachgewiesen (Abb. 6).

Diskussion

Trotz der wachsenden Zahl der untersuchten Patienten und der nachweislich an der Kontrolle der MHC-Klasse-II-Expression beteiligten pleiotropen Faktoren bleibt die Anzahl der Komplementationsgruppen und damit der mutierten Faktoren bei MHC-Klasse-II-Immundefizienzpatienten bei vier (Tabelle 2). Mit den 13 neuen Patienten mit HLA-Klasse-II-Mangel, die in dieser Arbeit untersucht wurden, wurde die Mehrheit der gemeldeten Patienten nun in Komplementärgruppen eingeteilt und keine definiert eine fünfte Komplementärgruppe. Insgesamt befinden sich von den 39 Patienten aus 34 Familien 6 in der Komplementationsgruppe A, 22 in der Gruppe B, 3 in der Gruppe C und 8 in der Gruppe D. Zwei Brüder mit einem partiellen Defekt der MHC-Klasse-II-Expression und mit einer leichten Form der Immunschwäche wurden kürzlich in eine zusätzliche Komplementationsgruppe eingestuft (18). Diese atypischen Patienten stellen wahrscheinlich ein anderes Syndrom dar, da sie auf die Impfung ansprechen können (19).

Unter den in diesem Bericht klassifizierten immundefizienten Patienten gehört nur die Familie Kh mit zwei betroffenen Geschwistern zur Gruppe A. Während die zuvor beschriebenen Patienten der Gruppe A spanischer Abstammung waren (15), waren diese neuen Fälle pakistanischer Herkunft, was zeigt, dass CIITA-Mutationen nicht auf eine ethnische Herkunft beschränkt sind. Sieben der neuen Patienten fallen in die Gruppe B und sind nordafrikanischer, italienischer, türkischer und saudi-arabischer Abstammung. Insgesamt, einschließlich des BLS1-Gründerpatienten, gibt es 22 Familien in Gruppe B.

Vier neue Patienten in drei Familien fallen zusammen mit Patient SS (15) in Gruppe D. Sie sind nordafrikanischer, türkischer und drusischer Abstammung. Ihre klinischen und biologischen Merkmale unterschieden sich nicht von anderen HLA-defizienten Patienten. In allen außer einem konnte jedoch die Transkription von DPA- und / oder DPB-Genen nachgewiesen werden. Residuale DPA- und DPB-Transkription wurde auch bei Patienten ABI berichtet (16). Bei den in dieser Arbeit untersuchten Patienten wurden trotz des Vorhandenseins von DP-Transkripten reife DPa-β-Heterodimere an der Zelloberfläche nicht nachgewiesen, möglicherweise weil die Ii- und DM-Gene nicht exprimiert werden. Von dieser Undichtigkeit des Defekts sind also keine funktionellen Konsequenzen zu erwarten, wie sie in vivo beobachtet werden.

Drei verschiedene Evidenzlinien zeigen, dass diese Patienten zur Komplementationsgruppe D gehören, d. H. Analyse der somatischen Zellfusion, Transfektion der Zellen der Patienten mit der RFXAP-cDNA und Mutationsanalyse. Eindeutige Zellfusionsergebnisse wurden sowohl unter Verwendung von Fibroblasten als auch von B-Zelllinien erhalten, wie für Patient ZM gezeigt. Das Fehlen einer Komplementierung zwischen ZM-Zellen und der 6.1.6 B-Zelllinie einerseits und zwischen ZM- und SS-Fibroblasten andererseits validierte alle anderen Fusionsdaten, einschließlich derjenigen der ABI-Fibroblasten. Eine frühere Fehlklassifizierung dieses Patienten in die Gruppe ‘E’ (16) war wahrscheinlich auf die Undichtigkeit der verwendeten 6.1.6-Zelllinie und / oder auf Fusionsexperimente zurückzuführen, die über Zelllinien hinweg durchgeführt wurden (B-Fibroblasten-Zellfusionen). Eine vollständige Korrektur der HLA-Klasse-II-Expression in Zellen aus Gruppe D und nicht aus den anderen Gruppen durch Transfektion der RFXAP-cDNA bestätigte zuvor gemeldete Daten aus transienten Transfektionsexperimenten (10,17). Die RFXAP-cDNA war bei den Patienten SS, AKO, Sh und ShG mutiert, wie zuvor auch für ZM und ABI gezeigt (17).

Es wurden drei Arten von rezidivierenden Mutationen von RFXAP gefunden, d. H. Substitution, Deletion und Insertion (Abb. 8). Ein sehr hoher CG-Gehalt im RFXAP-Gen, der zu Polymerasefehlern führt, könnte die Entstehung dieser Mutationen erklären (20). Die bei Patient AKO nachgewiesene C279X-Mutation ist identisch mit der zuvor bei Patient ABI nachgewiesenen Mutation (17) und die 484delG-Mutation bei Patient SS ist identisch mit der bei Patienten DA und ZM nachgewiesenen Mutation (10,17). In beiden Fällen wird vorausgesagt, dass die Mutationen zu einem Frameshift und zur Synthese stark verkürzter Proteine von 52 bzw. 136 Aminosäuren führen. Eine bisher unentdeckte Mutation wurde im Shc gefunden, d.h. eine Insertion von duplizierten Nukleotiden 144-150: ‘GCGGGGC’. Diese Mutation führt auch zu einem Frameshift und einem abgeschnittenen Produkt. Alle Mutationen wurden innerhalb einer Region nachgewiesen, die die Nukleotide 116-540 der RFXAP-cDNA umfasst, die einem einzelnen Exon entsprechen.

Daher wurden bisher nur drei verschiedene Mutationen des RFXAP-Gens in sechs verschiedenen Familien beobachtet, einschließlich Patient DA (10). Die ethnische Herkunft der Familien könnte auf einen Ahnenursprung dieser Mutationen hinweisen, da die Patienten SS, RA und ZM nordafrikanischen Ursprungs sind, während die Patienten AKO und ABI türkischer Abstammung sind. Bemerkenswerterweise wurden jedoch bisher nur in Gruppe D des MHC-Klasse-II-Mangels solche wiederkehrenden Mutationen nachgewiesen. In Gruppe A wurde beispielsweise trotz einer hohen Prävalenz von Patienten spanischer Abstammung (15) kein rezidivierendes Allel bei den verschiedenen Patienten nachgewiesen (8 und B. Lisowska-Grospierre et al., unveröffentlicht). In allen Komplementationsgruppen kommen die meisten Patienten aus dem Mittelmeerraum, wo blutsverwandte Ehen häufig sind.

Warum RFXAP-Genmutationen, die wahrscheinlich zu nicht funktionellen Proteinen führen, mit der verbleibenden DPA / B-Gentranskription assoziiert sind, ist nicht verstanden. Diese Beobachtung liefert Hinweise auf eine begrenzte, aber signifikante dyskoordinierte Regulation der MHC-Klasse-II-Gentranskriptionsregulation. Diese Ergebnisse erfordern weitere Studien, um eine mutmaßliche spezifische Rolle von RFXAP bei der DRA / B-, DQA / B-versus DPA / B-Transkription zu bestimmen.

Materialien und Methoden

Patienten

Dreizehn bisher unbeschriebene Patienten aus elf unabhängigen Familien, die von MHC-Klasse-II-Immunschwäche betroffen waren, wurden untersucht. Elf Familien waren blutsverwandt. Sie waren nordafrikanischer (drei), italienischer (zwei), türkischer (drei), drusischer (zwei), pakistanischer (zwei) und saudi-arabischer (einer) Herkunft. Bei allen Patienten waren HLA-Klasse-II-Antigene auf der Zelloberfläche von B-Zellen, Monozyten und aktivierten T-Zellen nicht nachweisbar. Das klinische Erscheinungsbild war insgesamt durch wiederkehrende Infektionen, schweren Durchfall und Gedeihstörungen gekennzeichnet. Das Fehlen von antigenspezifischen humoralen und zellulären Reaktionen wurde bei allen und Hypogammaglobulin-Aämie bei mehreren Patienten beobachtet. In diesem Bericht werden detaillierte Studien zu den Zellen von Patienten, AkO, ShA, ShG, ZM, berichtet. Für ZM wurden zuvor Teilergebnisse vorgestellt (17). Patient SS wurde bereits beschrieben (15). Merkmale des Patienten ABI, die in somatischen Komplementationsexperimenten enthalten sind, wurden bereits berichtet (16).

Zellkultur

B-Zell-Linien wurden aus Patienten-B-Zellen durch Epstein-Barr-Virus (EBV)-Infektion etabliert. Die Hautfibroblasten der Patienten wurden durch Hautbiopsie gewonnen und wie zuvor beschrieben mit SV40 transformiert (15). Alle Zelllinien wurden bei 37°C in 5% CO2 in RPMI-1640 (Gibco BRL Lifesciences), ergänzt mit 20% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, gezüchtet. Fibroblasten oder ihre Heterokaryonen wurden vor der Analyse der MHC-Klasse-II-Expression 40 h lang mit IFN-γ (200 IE/ml) behandelt.

Immunfluoreszenz

Anti-HLA-DR Antikörper 20.6 (21), Anti-Klasse II Bu27 (The Binding Site, Birmingham, UK) und Anti-Klasse I Antikörper W6/32 (ServaLab) wurden verwendet. B-Zellen wurden in Suspension gefärbt, während Fibroblasten vor der Inkubation mit Antikörpern mit Ethanol fixiert wurden, wie beschrieben (15). Zellsuspensionen wurden mit einem Beckton Dickinson Cytofluorograph analysiert und Zellen mit einem Leitz Ortoplan Mikroskop fixiert.

Somatische Komplementationsanalyse

Fibroblasten- und B-Zelllinien der neu etablierten Patienten sowie experimentelle Zelllinien (HVJ, ABL, SJO und 6.1.6.) von Patienten, die zuvor in die Komplementationsgruppen A, B, C bzw. Die 6.1.6-Zelllinie war eine Geneticin-selektierte, vollständig negative MHC-Klasse-II-Variante, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von C. Alcaide (Institut Pasteur). Darüber hinaus umfassten Fusionsexperimente: die SS-Zelllinie des Patienten, die eine mutmaßliche Komplementationsgruppe X (15) darstellt, und die ABI-Zelllinie des Patienten, von der berichtet wird, dass sie die Gruppe E (16) darstellt, wurden freundlicherweise von P. van den Elsen zur Verfügung gestellt. Transiente Heterokaryonen beider Zelltypen, B-Zellen und Fibroblasten wurden durch die zuvor ausführlich beschriebene Elektrofusionsmethode erhalten (15). Phänotypische Reversion wurde durch Immunfluoreszenz oder durch Northern Blot 48-72 h nach Zellfusion getestet. Im Falle von Fibroblasten wurden die Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von 200 IE/ml rekombinantem IFN-γ (Genex) kultiviert.

Transfektionen

Die zur Transfektion verwendeten Plasmide waren pREP4 (Invitrogen), pREP4-RFXAP und EBO-Sfi (leerer Vektor) oder EBO-CIITA, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von V Steimle (8). Transfektionen von B-Zelllinien und Fibroblasten wurden wie beschrieben (22) mit jeweils 1-10 µg Plasmid unter Verwendung eines JOUAN GTH 128/A Elektropulsers wie beschrieben (15) durchgeführt. Stabile Transfektanten wurden durch Selektion mit Hygromycin B (250 µg/ml; Calbiochem) erzeugt. Transfizierte Fibroblasten wurden mit 200 IE / ml IFN-γ behandelt, bevor sie auf MHC-Klasse-II-Expression getestet wurden.

PCR-Amplifikation und Sequenzierung von RFXAP

RFXAP-cDNA-Klone in voller Länge von Patienten wurden mittels RT-PCR isoliert und nach Standardverfahren in den pGEM-T-Vektor (Promega) subkloniert und auf Mutationen analysiert. Mutationen wurden dann in der DNA von Patienten und ihren Eltern bestätigt, indem PCR-amplifizierte genomische DNA-Fragmente untersucht wurden, die die Nukleotide 116-540 umfassen, wie beschrieben (17). Die PCR wurde mit dem Expand High Fidelity PCR System (Boeh-ringer Mannheim), wie beschrieben (10), durchgeführt. Die Sequenzierung von rekombinanten Plasmiden wurde mit dem ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI) und einem Applied Biosystems DNA Sequencer durchgeführt. Genomische PCR-Produkte wurden anschließend direkt unter Verwendung radioaktiv markierter Sequenzierprimer und eines Thermo-Sequenase-Kits (Amersham) sequenziert und auf einem Sequenzierungsgel analysiert.

RT-PCR-Nachweis der HLA-Klasse II-, DMB-, Ii- und GADPH-Genexpression

Die gesamte cytoplasmatische RNA wurde aus IFN-γ-induzierten Fibroblasten nach der Guanidiumthiocyanat-Methode extrahiert (23). Die Erststrang-cDNA wurde mit Avian Myeloblastosis Virus (AMV) Reverse Transkriptase (Boehringer Manneheim, SA) unter Verwendung von 10 ng Oligo(dT) als Primer und 5 µg cytoplasmatischer RNA synthetisiert. Die PCR-Amplifikation wurde in einem Endvolumen von 50 µl unter Verwendung von 1/30 der cDNA, 1 µM jedes Primers, 200 µM jedes d-NTP, 1,25 IE AmpliTaq-Polymerase (Perkin-Elmer, Forster City, CA) und 0,1 µCi dCTP (Amersham) in jeder Probe durchgeführt. Die DNA wurde 1 min bei 94 ° C denaturiert, 1 min bei 55 ° C getempert, um alle Gene außer GADPH und aDR nachzuweisen, für die eine 58 ° C-Glühtemperatur verwendet wurde. Die Verlängerung bei 72°C betrug 1 min. Dieser Zyklus wurde 25 mal für GADPH und aDR und 27 Mal für die anderen Gene wiederholt, gefolgt von 10 min Elongation bei 72°C. Die Proben wurden auf 5% Acrylamidgelen bei 150 V für 2 h elektrophoresiert. Die Gele wurden fixiert und getrocknet, bevor sie in einer PhosphorImager-Box (Molecular Dynamics) oder auf X-Omat-Film (Kodak) belichtet wurden. Die bei der PCR-Amplifikation verwendeten Sequenzen von Oligonukleotidprimern waren: für HLA-aDQ, -ßDQ und DMB wie von Peijnenburg (16) beschrieben, für GADPH, -aDR und Ii-Kette wie von Vedrenne et al. (24) und für -ßDR, -aDP und -ßDP, wie von Hauber et al. (25).

Abkürzungen

Abkürzungen
• B-Zelle

  Linie B-lymphoblastoide Zelllinie

• IFN-γ

  Interferon γ

• MHC

  Haupthistokompatibilitätskomplex

• RT-PCR

  Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion.

Danksagung

Wir danken Dr. Peter van den Elsen ganz besonders für die Erlaubnis, die ABI-Zelllinie in Fusionsexperimente miteinbeziehen zu dürfen. Wir danken Dr. Andrew Cant und Mario Abinun für Blutproben und Hautbiopsien von Patienten, die in ihrer Einheit für BMT behandelt wurden, und Dr. Klaus Schwarz für die Zusendung der Blutproben von zwei Patienten. Wir danken auch Françoise Selz für ihre fachkundige Zusammenarbeit und E. Barras für die hervorragende technische Unterstützung.