Definición Genética y Molecular del Grupo de Complementación D en Deficiencia de MHC Clase II

Resumen

Se han descrito cuatro grupos de complementación, A, B, C y D, entre líneas celulares defectuosas en la expresión de coordenadas de genes MHC clase II. Estos incluyen líneas celulares establecidas a partir de pacientes afectados con deficiencia de MHC clase II y líneas celulares mutantes generadas experimentalmente. El grupo D, en contraste con los otros grupos, estuvo representado durante mucho tiempo solo por la línea celular mutante 6.1.6. El gen responsable del defecto en este grupo, RFXAP, fue clonado recientemente y se encontró que estaba mutado en la línea celular 6.1.6 y en tres pacientes. Aquí presentamos experimentos de fusión en varios nuevos pacientes con deficiencia de HLA de clase II, completando la clasificación de la mayoría de los pacientes conocidos en los cuatro grupos de complementación. Los pacientes de cinco familias no emparentadas se clasificaron en el grupo de complementación D, mientras que otros nueve se clasifican en los grupos de complementación A y B. Ninguno de los pacientes definió un nuevo grupo de complementación. Se obtuvo una corrección completa de la expresión de CMH clase II en células de pacientes pertenecientes al grupo D mediante transfección con el ADNc de RFXAP. Se encontró que la región codificante de RFXAP estaba mutada en todos los pacientes. Se encontró que las mutaciones eran recurrentes ya que solo se han encontrado tres mutaciones diferentes en las ocho familias no relacionadas notificadas hasta la fecha.

Introducción

La expresión de antígenos MHC de clase II está estrechamente controlada de forma específica para las células (1) y es esencial para las respuestas inmunitarias específicas para antígenos (2). Los mecanismos que controlan la transcripción de genes MHC clase II se han estudiado ampliamente, particularmente mediante el uso de células deficientes en expresión de HLA clase II. Estas células son mutantes generados experimentalmente o células de pacientes afectados con deficiencia de MHC clase II (3). Esta inmunodeficiencia primaria resultante de la expresión defectuosa de antígenos HLA clase II es un trastorno autosómico recesivo caracterizado por una susceptibilidad extrema a infecciones y una ausencia de respuestas de células T celulares y humorales al reconocer antígenos (4). Las células de los pacientes no transcriben los genes α y β MHC clase II que codifican los isotipos DR, DQ y DP HLA (3,5). El análisis de segregación intrafamiliar ha demostrado que la anomalía genética está localizada fuera de la región MHC e involucra factores reguladores de acción trans(5). Tanto las líneas celulares de pacientes como las líneas celulares mutantes experimentales se utilizaron, en experimentos de fusión somática, para evaluar el número de factores de transcripción que eran absolutamente necesarios para garantizar una expresión normal de CMH clase II. Se identificaron cuatro grupos de complementación, A, B, C y D (6,7).

Los genes responsables del defecto en los grupos A y C fueron clonados por clonación de complementación en la línea celular RJ 2.5.5 (grupo A) y la línea celular SJO (grupo C), respectivamente. El gen CIITA codifica una proteína sin unión al ADN que controla la expresión de clase II de HLA constitutiva e inducible y está mutada en pacientes del grupo A (8). El gen RFX5 codifica una subunidad de 75 kDa del complejo RFX y está mutado en pacientes del grupo de complementación C (9). Un tercer gen, RFXAP (para proteína asociada a RFX), fue clonado recientemente por Durand et al. (10). RFXAP codifica una pequeña subunidad de 36 kDa del complejo RFX, y las mutaciones del gen son responsables del defecto en el grupo de complementación D. Las proteínas RFX5 y RFXAP forman, junto con una tercera proteína de 41 kDa, un complejo multimérico RFX que se une a la región de caja X de promotores de clase II de MHC (11). Es posible que un gen que codifica esta tercera proteína esté mutado en el grupo de complementación B, en el que el gen afectado aún no haya sido identificado. La unión del complejo RFX al ADN depende de la unión cooperativa con al menos dos factores pleiotrópicos, NFY y X2BP (12-14), pero no es suficiente para la transcripción de clase II. CIITA debe combinarse con RFX y otros factores de transcripción que se unen a las cajas X2 e Y del promotor para permitir la transcripción de genes MHC de clase II.

Describimos aquí el análisis de complementación somática de 13 nuevos pacientes con deficiencia de HLA clase II y dos pacientes previamente notificados SS (15) y ABI (16), sospechosos de representar diferentes grupos de complementación. Se encontró que uno de los nuevos pacientes pertenecía al grupo A y otros siete al grupo B. Sin embargo, cuatro nuevos pacientes cayeron en el mismo grupo de complementación que los pacientes SS y ABI. Se encontró que este último grupo representaba al grupo D por análisis de complementación, transfección con el ADNc RFXAP y análisis de mutaciones del gen RFXAP.Figura

Resultados

Clasificación de los pacientes en grupos de complementación

Se realizaron experimentos de fusión de células somáticas utilizando células B o fibroblastos que representaban los grupos de complementación A, B, C y D. Tanto las células B como los fibroblastos estaban disponibles solo para el paciente ZM. La Figura 1 muestra un ejemplo de expresión de HLA obtenida en heterocariones de células B y fibroblastos. En heterocariones de fibroblastos, se detectaron 3-10% de células HLA positivas de clase II 48 h después del tratamiento con interferón-γ (IFN-γ). En heterocariones de células B, no se pudo detectar más del 5% de células HLA positivas de clase II. La Figura 2 resume los datos obtenidos por fusión de células somáticas y la Tabla 2 muestra la clasificación de los pacientes recién estudiados con respecto a los datos publicados previamente (6,7). Un paciente de origen pakistaní fue clasificado en el grupo A, siete pacientes fueron colocados en el grupo B y cinco en el grupo D. Ninguno de los pacientes pertenecía al grupo C.

Como muestra la Tabla 1, los fibroblastos de cuatro pacientes, ZM, AkO, ShA y ShG, complementaron células que representaban los grupos de complementación A y B, pero no complementaron la línea celular de fibroblastos SS, que no había sido clasificada (15). Las células ZM B complementaron a las células B de los grupos A, B y C, pero no complementaron la línea celular HLA clase II negativa 6.1.6 B que define el grupo D. No se obtuvo complementación después de la fusión entre fibroblastos ZM, AkO, Sha y ShG. Además, ninguna de estas líneas celulares de fibroblastos, incluyendo ZM, complementó la línea celular ABI (16). Por lo tanto, las células de los pacientes SS, AkO, ShA, ShG ABI y ZM pertenecen al grupo de complementación D.

Corrección de la expresión de HLA clase II por transfección con el ADNc RFXAP

Como se informó anteriormente, en experimentos de transfección transitoria con el ADNc RFXAP, se obtuvo una corrección de la expresión de MHC clase II en fibroblastos ZM y ABI (17). La Figura 2 muestra la corrección completa de la expresión génica de clase II de HLA constitutiva en células del paciente ZM, el único paciente para el que estaba disponible una línea de células B, después de la transfección con el ADNc de RFXAP. Por el contrario, la transfección con cDNAs CIITA o RFX5 no restauró la expresión de clase II de HLA; tampoco la transfección con el vector vacío. Se obtuvieron resultados similares para la expresión MHC clase II inducida por IFN-γ en fibroblastos de pacientes AkO, SS y ShA (datos no mostrados).

Las mutaciones del gen RFXAP en pacientes SS, AkO, ShA y ShG

Se amplificaron mediante PCR a partir de pacientes SS, AkO, ShA y ShG, como se describe (10), se subclonaron en un vector pGEM y se secuenciaron. En los cuatro pacientes, se identificaron mutaciones en el ADNc de RFXAP. Estas mutaciones se confirmaron mediante secuenciación directa de productos de PCR genómica de los pacientes y sus padres.

En la familia SS, con dos niños afectados, se encontró una deleción homocigótica de un G en el nucleótido 484 (484delG) (Fig. 3). La misma mutación se detectó en la familia ZM (17). El cambio de marco resultante conduce a un codón de parada fuera de marco en el nucleótido 525. Se encontró que los padres eran heterocigotos para esta mutación.Figura

En la familia AkO, se detectó una sustitución de un codón de glutamina por un codón stop (CAG→TAG) en la posición 279 del gen RFXAP (C279X) (Fig. 4). Se prevé que esta mutación conduzca a una proteína truncada de 52 aminoácidos. La misma mutación se ha detectado previamente en el paciente ABI (17). Los padres de AkO son heterocigotos para esta mutación.

En la familia Sh, con dos primos de primer grado afectados ShA y ShG, se encontró una inserción de siete nucleótidos ‘GCGGGCG’ en la posición 151 del ADNc RFXAP. Esta mutación se denomina 151ins7. Representa una duplicación de la secuencia de tipo salvaje que abarca los nucleótidos 144-150. Conduce a un cambio de marco que resulta en un codón de parada en el nucleótido 329. Ambos pacientes de esta familia heredaron esta mutación homocigótica (Fig. 5). Los padres de ambos pacientes eran heterocigotos (datos no mostrados).Figura

Expresión génica de cadena MHC clase II, DMB y Ii en el grupo de complementación D

Dado que se había notificado la expresión residual de los genes DRA y DPB en células del paciente ABI (16), se examinó la expresión génica MHC clase II en pacientes del grupo D mediante RT-PCR. Se observó un nivel variable de transcripción para los genes DPA y/o DPB en cuatro de los pacientes, pero no en un paciente control del grupo A (Fig. 6). Sin embargo, incluso en las células ShG de los pacientes, en las que se detectaron transcripciones de DPA y DPB, no hubo expresión de membrana detectable del complejo DPaß (Fig. 7). En ninguna de las líneas celulares de los pacientes se detectó ARNm de genes de cadena HLA DR, DQ, DMB o Ii mediante RT-PCR (Fig. 6).Figura

Discusión

A pesar del creciente número de pacientes examinados y de los factores pleiotrópicos que han demostrado estar involucrados en el control de la expresión de CMH clase II, el número de grupos de complementación y, por lo tanto, de factores mutados en pacientes con inmunodeficiencia CMH clase II, se mantiene en cuatro (Tabla 2). Con los 13 nuevos pacientes con deficiencia de HLA clase II estudiados en este trabajo, la mayoría de los pacientes notificados han sido clasificados en grupos de complementación y ninguno define un quinto grupo de complementación. En total, de los 39 pacientes de 34 familias, hay 6 en el grupo de complementación A, 22 en el grupo B, 3 en el grupo C y 8 en el grupo D. Dos hermanos con un defecto parcial de expresión de CMH clase II y con una forma leve de inmunodeficiencia fueron clasificados recientemente en un grupo de complementación adicional (18). Estos pacientes atípicos probablemente representan otro síndrome, ya que son capaces de responder a la vacunación (19).

Entre los pacientes inmunodeficientes clasificados en este informe, solo la familia Kh, con dos hermanos afectados, pertenece al grupo A. Mientras que los pacientes del grupo A descritos anteriormente eran de ascendencia española (15), estos nuevos casos eran de origen pakistaní, lo que demuestra que las mutaciones CIITA no se limitan a un origen étnico. Siete de los nuevos pacientes pertenecen al grupo B y son de ascendencia norafricana, italiana, turca y saudí. En total, incluido el paciente fundador de BLS1, hay 22 familias en el grupo B.

Cuatro nuevos pacientes de tres familias, junto con el paciente SS (15), pertenecen al grupo D. Son descendientes de africanos del Norte, turcos y drusos. Sus características clínicas y biológicas no diferían de las de otros pacientes con deficiencia de HLA. Sin embargo, en todos menos uno, se pudo detectar la transcripción de genes DPA y/o DPB. También se notificaron transcripciones residuales de DPA y DPB en el paciente ABI (16). En los pacientes estudiados en este trabajo, a pesar de la presencia de transcripciones de DP, no se detectaron heterodímeros maduros de DPa-β en la superficie celular, tal vez porque los genes Ii y DM no están expresados. Por lo tanto, no se esperan consecuencias funcionales de esta filtración en el defecto, como de hecho se observa in vivo.

Tres líneas de evidencia diferentes demuestran que estos pacientes pertenecen al grupo de complementación D, es decir, análisis de fusión de células somáticas, transfección de las células de los pacientes con el ADNc RFXAP y análisis mutacional. Se obtuvieron resultados inequívocos de fusión celular utilizando tanto fibroblastos como líneas de células B, como se demostró para el paciente ZM. La ausencia de complementación entre las células ZM y la línea celular 6.1.6 B, por un lado, y entre los fibroblastos ZM y SS, por otro, validó todos los demás datos de fusión, incluidos los de los fibroblastos ABI. La clasificación errónea previa de este paciente en el grupo ” E ” (16) se debió probablemente a la permeabilidad de la línea celular 6.1.6 utilizada y/o a experimentos de fusión realizados a través de linajes celulares (fusiones de células de fibroblastos B). Una corrección completa de la expresión de HLA clase II en células del grupo D, y no de los otros grupos, por transfección del ADNc de RFXAP confirmó datos reportados previamente de experimentos de transfección transitoria (10,17). Se encontró que el ADNc de RFXAP estaba mutado en pacientes SS, AKO, Sh y ShG, como también se demostró previamente para ZM y ABI (17).

Se encontraron tres tipos de mutaciones recurrentes de RFXAP, es decir, sustitución, deleción e inserción (Fig. 8). Un contenido de GC muy alto en el gen RFXAP que conduce a errores de polimerasa podría explicar la generación de estas mutaciones (20). La transición C279X detectada en el paciente AKO es idéntica a la mutación detectada previamente en el paciente ABI (17) y la mutación 484delG en el paciente SS es idéntica a la detectada en los pacientes DA y ZM (10,17). En ambos casos, se predice que las mutaciones darán lugar a un cambio de marco y a la síntesis de proteínas severamente truncadas de 52 y 136 aminoácidos, respectivamente. Se encontró una mutación no descubierta en los primos de la Sh, es decir, una inserción de nucleótidos duplicados 144-150: ‘GCGGGC’. Esta mutación también resulta en un cambio de marco y un producto truncado. Todas las mutaciones se detectaron dentro de una región que abarca los nucleótidos 116-540 del ADNc de RFXAP, que corresponden a un solo exón.Figura

Por lo tanto, hasta ahora solo se han observado tres mutaciones diferentes del gen RFXAP en seis familias diferentes, incluido el paciente DA (10). El origen étnico de las familias podría indicar un origen ancestral de estas mutaciones, ya que los pacientes SS, RA y ZM son de origen norteafricano, mientras que los pacientes AKO y ABI son de ascendencia turca. Sin embargo, sorprendentemente, solo en el grupo D de la deficiencia de MHC clase II se han detectado tales mutaciones recurrentes hasta el momento. En el grupo A, por ejemplo, a pesar de una alta prevalencia de pacientes de ascendencia española (15), no se ha detectado alelo recurrente entre los diferentes pacientes (8, y B. Lisowska-Grospierre et al., sin publicar). En todos los grupos de complementación, la mayoría de los pacientes provienen del área mediterránea, donde los matrimonios consanguíneos son frecuentes.

No se entiende por qué las mutaciones del gen RFXAP, que probablemente resultan en proteínas no funcionales, están asociadas con la transcripción residual del gen DPA/B. Esta observación proporciona evidencia de una regulación discoordinada limitada pero significativa de la regulación de la transcripción génica de clase II del CMH. Estos resultados requieren un estudio adicional para determinar un posible papel específico de RFXAP en la transcripción DRA/B, DQA/B versus DPA/B.

Materiales y métodos

Pacientes

Se estudiaron trece pacientes no descritos hasta ahora de once familias no emparentadas afectadas por inmunodeficiencia MHC clase II. Once familias eran consanguíneas. Eran de origen norteafricano (tres), italiano (dos), turco (tres), druso (dos), pakistaní (dos) y saudí (uno). En todos los pacientes, los antígenos de HLA clase II fueron indetectables en la superficie celular de las células B, los monocitos y las células T activadas. La presentación clínica en la lla se caracterizó por infecciones recurrentes, diarrea grave y retraso del crecimiento. La ausencia de antígeno-específica humoral y celular de las respuestas se observó en todos, y hipogammaglobulinemia en varios de los pacientes. En este informe, se reportan estudios detallados sobre las células de los pacientes, AkO, ShA, ShG, ZM. Para ZM, se presentaron previamente resultados parciales (17). El paciente SS ya ha sido descrito (15). Ya se han descrito las características del ICB de los pacientes, incluidas en experimentos de complementación somática (16).

Cultivo celular

Se establecieron líneas de células B a partir de células B de los pacientes por infección por el virus de Epstein-Barr (VEB). Los fibroblastos cutáneos de los pacientes se obtuvieron mediante biopsia de piel y se transformaron con SV40, como se describió anteriormente (15). Todas las líneas celulares se cultivaron a 37 ° C con un 5% de CO2 en RPMI-1640 (Gibco BRL Lifesciences) suplementado con un 20% de suero de ternera fetal inactivado por calor. Los fibroblastos o sus heterocariones fueron tratados con IFN-γ (200 UI / ml) durante 40 h antes del análisis de la expresión de CMH clase II.

Inmunofluorescencia

Se utilizó el anticuerpo anti-HLA-DR 20,6 (21), el anticuerpo anti-clase II Bu27 (El lugar de unión, Birmingham, Reino Unido) y el anticuerpo anti-clase I W6/32 (ServaLab). Las células B se tiñeron en suspensión, mientras que los fibroblastos se fijaron con etanol antes de la incubación con anticuerpos, como se describió (15). Las suspensiones celulares se analizaron con un citofluorógrafo de Beckton Dickinson y las células fijas con un microscopio Ortoplan de Leitz.

Análisis de complementación somática

Líneas de fibroblastos y células B de los pacientes recién establecidos, así como líneas celulares experimentales (HVJ, ABL, SJO y 6.1.6.) de pacientes previamente clasificados a los grupos de complementación A, B, C y D, respectivamente, fueron utilizados en estos experimentos. La línea celular 6.1.6 fue una variante MHC clase II completamente negativa seleccionada por geneticina, amablemente proporcionada por C. Alcaide (Institut Pasteur). Además, los experimentos de fusión incluyeron:: la línea celular SS del paciente, que representa un grupo de complementación putativa X (15), y la línea celular ABI del paciente, reportada para representar al grupo E (16), amablemente proporcionada por P. van den Elsen. Se obtuvieron heterocariones transitorios de ambos tipos de células, células B y fibroblastos mediante el método de electrofusión descrito en detalle anteriormente (15). La reversión fenotípica se probó por inmunofluorescencia o por blot norte 48-72 h después de la fusión celular. En el caso de los fibroblastos, las células se cultivaron en presencia o ausencia de 200 UI/ml de IFN-γ recombinante (Genex).

Transfecciones

Los plásmidos utilizados para la transfección fueron pREP4 (Invitrogen), pREP4-RFXAP y EBO-Sfi (vector vacío) o EBO-CIITA, proporcionados amablemente por V Steimle (8). Las transfecciones de líneas de células B y fibroblastos se llevaron a cabo como se describe (22) con 1-10 µg de cada plásmido, utilizando un electropulsador JOUAN GTH 128/A, como se describe (15). Se generaron transfectantes estables mediante selección con higromicina B (250 µg/ml; Calbioquem). Los fibroblastos transfectados se trataron con 200 UI/ml de IFN-γ antes de la prueba de expresión de CMH clase II.

La amplificación y secuenciación de RCP de RFXAP

Clones de ADNc de RFXAP de longitud completa de pacientes se aislaron mediante RCP-RT y se subclonaron en vector pGEM-T (Promega), de acuerdo con procedimientos estándar, y se analizaron para detectar mutaciones. Las mutaciones se confirmaron en el ADN de los pacientes y sus padres mediante el estudio de fragmentos de ADN genómicos amplificados por PCR que abarcan nucleótidos 116-540, como se describió (17). La PCR se realizó con el Sistema de PCR de Alta Fidelidad Expand (Boeh-ringer Mannheim), como se describe (10). La secuenciación de plásmidos recombinantes se realizó utilizando el kit de secuenciación del ciclo del terminador de tinte de prisma ABI (ABI) y un secuenciador de ADN de Biosystems Aplicado. Los productos de PCR genómica se secuenciaron en ciclos directamente mediante el uso de cebadores de secuenciación radiomarcados y un kit de Termo-secuenasa (Amersham), y se analizaron en un gel de secuenciación.

Detección por RT-PCR de expresión génica de HLA clase II, DMB, Ii y GADPH

Se extrajo ARN citoplasmático total de fibroblastos inducidos por IFN-γ por el método de tiocianato de guanidio (23). La primera cadena de ADNc se sintetizó con la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (VMA) (Boehringer Manneheim, SA) utilizando 10 ng de oligoelemento(dT) como imprimación y 5 µg de ARN citoplasmático. La amplificación de PCR se realizó en un volumen final de 50 µl utilizando 1/30 del ADNc, 1 µM de cada imprimación, 200 µM de cada d NTP, 1,25 UI de polimerasa AmpliTaq (Perkin-Elmer, Forster City, CA) y 0,1 µCi dCTP (Amersham) en cada muestra. El ADN se desnaturalizó a 94 ° C durante 1 minuto, recocido durante 1 minuto a 55°C para detectar todos los genes excepto GADPH y aDR, para los que se utilizó una temperatura de recocido de 58°C. La extensión a 72 ° C fue de 1 min. Este ciclo se repitió 25 veces para GADPH y aDR y 27 veces para los otros genes, seguido de un alargamiento de 10 minutos a 72°C. Las muestras se electroforesaron en geles de acrilamida al 5% a 150 V durante 2 h. Los geles se fijaron y secaron antes de la exposición en una caja de Fosforimager (Dinámica Molecular) o en una película X-Omat (Kodak). Las secuencias de cebadores de oligonucleótidos utilizados en la amplificación de PCR fueron: para HLA-aDQ, – ßDQ y DMB según lo descrito por Peijnenburg (16), para GADPH, -aDR y cadena Ii según lo descrito por Vedrenne et al. (24), y para-ßDR, – aDP y-ßDP según lo descrito por Hauber et al. (25).

Abreviaturas

Abreviaturas
• B-cell

  línea B línea celular linfoblastoide

• el IFN-γ

  interferón gamma

• MHC

  complejo mayor de histocompatibilidad

• RT-PCR

  transcripción inversa-reacción en cadena de polimerasa.

Agradecimientos

Agradecemos especialmente al Dr. Peter van den Elsen por permitirnos incluir la línea celular ABI en experimentos de fusión. Agradecemos a los doctores Andrew Cant y Mario Abinun por las muestras de sangre y biopsias de piel de pacientes tratados en su Unidad para BMT, y al Dr. Klaus Schwarz por enviarnos las muestras de sangre de dos pacientes. También agradecemos a Françoise Selz por su colaboración experta y a E. Barras por su excelente asistencia técnica.