Genetic and Molecular Definition of Complementation Group D in MHC Class II Deficiency

Abstract

cztery grupy complementation, A, B, C i D, zostały opisane wśród linii komórkowych wadliwych w ekspresji współrzędnych genów MHC class II. Należą do nich linie komórkowe ustalone od pacjentów dotkniętych niedoborem MHC klasy II i eksperymentalnie wygenerowane zmutowane linie komórkowe. Grupa D, w przeciwieństwie do innych grup, była przez długi czas reprezentowana tylko przez zmutowaną linię komórkową 6.1.6. Gen odpowiedzialny za defekt w tej grupie, RFXAP, został niedawno sklonowany i okazał się zmutowany w linii komórkowej 6.1.6 oraz u trzech pacjentów. Tutaj przedstawiamy eksperymenty fuzyjne na kilku nowych pacjentach z niedoborem II klasy HLA, kończąc klasyfikację większości znanych pacjentów na cztery grupy uzupełniające. Pacjenci z pięciu niezwiązanych ze sobą rodzin zostali sklasyfikowani w grupie D, podczas gdy dziewięć pozostałych zalicza się do grup A I B. Żaden z pacjentów nie zdefiniował nowej grupy uzupełniającej. Pełną korektę ekspresji MHC klasy II uzyskano w komórkach pacjentów należących do grupy D poprzez transfekcję cDNA RFXAP. Stwierdzono, że region kodowania RFXAP jest zmutowany u wszystkich pacjentów. Mutacje okazały się nawracające, ponieważ tylko trzy różne mutacje zostały znalezione w ośmiu niepowiązanych rodzinach zgłoszonych do tej pory.

wprowadzenie

ekspresja antygenu MHC klasy II jest ściśle kontrolowana w sposób specyficzny dla komórki (1) i ma zasadnicze znaczenie dla specyficznych dla antygenu odpowiedzi immunologicznych (2). Mechanizmy kontrolujące transkrypcję genów MHC klasy II były szeroko badane, szczególnie przy użyciu komórek z niedoborem ekspresji HLA klasy II. Komórki te są albo doświadczalnie generowanymi mutantami, albo komórkami pacjentów dotkniętych niedoborem MHC klasy II (3). Ten pierwotny niedobór odporności wynikający z wadliwej ekspresji antygenów klasy II HLA jest zaburzeniem autosomalnym recesywnym charakteryzującym się ekstremalną podatnością na infekcje oraz brakiem odpowiedzi komórek i humoralnych komórek T po rozpoznaniu antygenu (4). Komórki pacjentów nie dokonują transkrypcji genów α i β MHC klasy II kodujących izotypy DR, DQ i DP HLA (3,5). Analiza segregacji wewnątrzrodzinnej wykazała, że anomalia genetyczna jest zlokalizowana poza regionem MHC i obejmuje trans-działające czynniki regulacyjne(5). Zarówno linie komórkowe pacjentów, jak i eksperymentalne linie komórkowe zmutowane zostały wykorzystane w eksperymentach fuzji somatycznej do oceny liczby czynników transkrypcyjnych, które były absolutnie niezbędne do zapewnienia prawidłowej ekspresji MHC klasy II. Zidentyfikowano cztery grupy uzupełniające: A, B, C I D (6,7).

geny odpowiedzialne za defekt w grupach A I C sklonowano przez klonowanie uzupełniające w linii komórkowej RJ 2.5.5 (Grupa A) i linii komórkowej SJO (Grupa C), odpowiednio. Gen CIITA koduje białko niezwiązane z DNA, które kontroluje zarówno konstytutywną, jak i induktywną ekspresję HLA klasy II i jest zmutowane u pacjentów z grupy a (8). Gen RFX5 koduje podjednostkę 75 kDa kompleksu RFX i jest mutowany u pacjentów z grupy C (9). Trzeci Gen, RFXAP (dla białka związanego z RFX), został niedawno sklonowany przez Duranda i wsp. (10). RFXAP koduje małą podjednostkę 36 kDa kompleksu RFX, a mutacje genu są odpowiedzialne za defekt w grupie dopełniającej D. białka RFX5 i RFXAP tworzą wraz z trzecim białkiem 41 kDa multimeryczny kompleks RFX, który wiąże się z regionem x box promotorów MHC klasy II (11). Możliwe jest, że gen kodujący to trzecie białko jest zmutowany w grupie B, w której gen ten nie został jeszcze zidentyfikowany. Wiązanie kompleksu RFX z DNA zależy od kooperatywnego wiązania z co najmniej dwoma czynnikami plejotropowymi, NFY i X2BP (12-14), ale nie jest wystarczające dla transkrypcji klasy II. CIITA musi łączyć się z RFX i innymi czynnikami transkrypcyjnymi, które wiążą się z x2 I y pola promotora, aby umożliwić transkrypcję genów MHC klasy II.

opisujemy tutaj analizę somatycznego uzupełniania 13 nowych pacjentów z niedoborem HLA klasy II oraz dwóch wcześniej zgłoszonych pacjentów SS (15) i ABI (16), podejrzewanych o reprezentowanie różnych grup uzupełniania. Jeden z nowych pacjentów należał do grupy A, A siedmiu innych do grupy B. Jednak czterech nowych pacjentów trafiło do tej samej grupy uzupełniającej, co pacjenci SS i ABI. Stwierdzono, że ta ostatnia grupa reprezentuje grupę D poprzez analizę uzupełniającą, transfekcję cDNA RFXAP i analizę mutacji genu RFXAP.

wyniki

Klasyfikacja pacjentów do grup dopełniających

eksperymenty z fuzją komórek somatycznych przeprowadzono z użyciem komórek B lub fibroblastów reprezentujących grupy dopełniające A, B, C i D. zarówno komórki B, jak i fibroblasty były dostępne tylko dla pacjenta ZM. Fig.1 przedstawia przykład ekspresji HLA uzyskanej w heterokarionach zarówno limfocytów B, jak i fibroblastów. W heterokarionach fibroblastów po 48 godzinach od leczenia interferonem γ (IFN-γ) wykryto 3-10% komórek II klasy HLA. W heterokarionach limfocytów B można było wykryć nie więcej niż 5% komórek HLA klasy II-dodatnich. Rycina 2 podsumowuje dane uzyskane za pomocą fuzji komórek somatycznych, a Tabela 2 przedstawia klasyfikację nowo badanych pacjentów w odniesieniu do wcześniej opublikowanych danych (6,7). Jeden pacjent pochodzenia pakistańskiego został zaklasyfikowany do grupy A, siedmiu do grupy B, A pięciu do grupy D. żaden z pacjentów nie należał do grupy C.

Jak pokazuje tabela 1, fibroblasty od czterech pacjentów, ZM, AkO, ShA i ShG, uzupełniały komórki reprezentujące grupy dopełniające a i B, ale nie uzupełniały linii komórkowej fibroblastów SS, która nie została sklasyfikowana (15). Komórki B zm uzupełniały komórki B z grup A, B I C, ale nie uzupełniały linii komórek B klasy II-ujemnej HLA 6.1.6 definiującej grupę D. nie uzyskano komplementacji po fuzji fibroblastów zm, AkO, Sha i ShG. Ponadto żadna z tych linii komórkowych fibroblastów, w tym ZM, nie uzupełniała linii komórkowej ABI (16). Zatem komórki pacjentów SS, AkO, ShA, SHG ABI i ZM należą do grupy uzupełniającej D.

korekta ekspresji HLA klasy II przez transfekcję za pomocą RFXAP cDNA

jak wcześniej informowano, w przejściowych doświadczeniach transfekcji za pomocą rfxap cDNA, uzyskano korektę ekspresji MHC klasy II w fibroblastach ZM i ABI (17). 2 przedstawia pełną korekcję konstytutywnej ekspresji genu II klasy HLA w komórkach od pacjenta zm, jedynego pacjenta, dla którego dostępna była linia limfocytów B, po transfekcji za pomocą RFXAP cDNA. Natomiast transfekcja cDNA CIITA lub RFX5 nie przywróciła ekspresji HLA klasy II; tak samo transfekcja z pustym wektorem. Podobne wyniki uzyskano dla indukowanej IFN-γ ekspresji MHC klasy II w fibroblastach u pacjentów AkO, SS i ShA (dane nie pokazano).

mutacje genu RFXAP u pacjentów SS, AkO, ShA i ShG

Pełnej długości cDNA RFXAP zostały amplifikowane przez PCR u pacjentów SS, AkO, ShA i ShG, jak opisano (10), sklonowane w wektorze pGEM i zsekwencjonowane. U wszystkich czterech pacjentów zidentyfikowano mutacje w cDNA RFXAP. Mutacje te zostały następnie potwierdzone przez bezpośrednie sekwencjonowanie genomowych produktów PCR od pacjentów i ich rodziców.

w rodzinnym SS, z dwojgiem dzieci dotkniętych chorobą, stwierdzono homozygotyczną delecję G przy nukleotydzie 484 (484delg) (Fig. 3). Tę samą mutację wykryto w rodzinie ZM (17). Wynikająca z tego Zmiana ramki prowadzi do kodonu zatrzymania poza ramką w nukleotydzie 525. Stwierdzono, że rodzice są heterozygotyczni dla tej mutacji.

w rodzinie AkO wykryto podstawienie kodonu glutaminy przez kodon stop (CAG→TAG) w pozycji 279 genu RFXAP (C279x) (Fig. 4). Przewiduje się, że mutacja ta doprowadzi do okrojonego białka zawierającego 52 aminokwasy. Tę samą mutację wykryto wcześniej u pacjenta ABI (17). Rodzice AkO są heterozygotyczni dla tej mutacji.

w rodzinie sh, z dwoma dotkniętymi kuzynami pierwszego stopnia ShA i ShG, stwierdzono wstawienie siedmiu nukleotydów “GCGGGCG” w pozycji 151 RFXAP cDNA. Mutacja ta jest oznaczona jako 151ins7. Reprezentuje powielenie sekwencji typu dzikiego obejmującej nukleotydy 144-150. Prowadzi to do przesunięcia ramki w wyniku czego kodon stopu w nukleotydzie 329. Obaj pacjenci z tej rodziny odziedziczyli tę homozygotyczną mutację (rys. 5). Rodzice obu pacjentów byli heterozygotyczni (brak danych).

ekspresja genów w łańcuchach MHC klasy II, DMB I II w grupie D

ponieważ w komórkach pacjenta ABI (16) zgłaszano ekspresję genów MHC klasy II w grupie D metodą RT-PCR, ekspresję genów MHC klasy II badano u pacjentów z grupy D. Zmienny poziom transkrypcji zaobserwowano dla genów DPA i (lub) DPB u czterech pacjentów, ale nie u kontrolnego pacjenta z grupy A (Fig. 6). Jednak nawet w komórkach pacjentów ShG, w których wykryto zarówno transkrypty DPA, jak i DPB, nie wykryto ekspresji błonowej kompleksu DPaß (Fig. 7). W żadnej z linii komórkowych pacjenta nie wykryto mRNA w łańcuchu HLA DR, DQ, DMB lub II metodą RT-PCR (Fig. 6).

dyskusja

pomimo rosnącej liczby badanych pacjentów i czynników plejotropowych wykazujących udział w kontroli ekspresji MHC klasy II, liczba grup dopełniających, a zatem czynników zmutowanych u pacjentów z niedoborem odporności MHC klasy II, pozostaje na poziomie czterech (Tabela 2). Z 13 nowymi pacjentami z niedoborem HLA klasy II badanymi w tej pracy, większość zgłaszanych pacjentów została sklasyfikowana na grupy uzupełniające, a żaden z nich nie definiuje piątej grupy uzupełniającej. W sumie, spośród 39 pacjentów z 34 rodzin, 6 w grupie uzupełniającej a, 22 w grupie B, 3 w grupie C i 8 w grupie D. dwóch braci z częściową wadą ekspresji MHC klasy II i łagodną postacią niedoboru odporności zostało ostatnio sklasyfikowanych w dodatkowej grupie uzupełniającej (18). Ci nietypowi pacjenci prawdopodobnie reprezentują inny zespół, ponieważ są w stanie odpowiedzieć na szczepienie (19).

wśród pacjentów z niedoborem odporności sklasyfikowanych w tym raporcie, tylko rodzina Kh, z dwojgiem dotkniętego rodzeństwa, należy do grupy A. Podczas gdy wcześniej opisani pacjenci z grupy A byli pochodzenia hiszpańskiego (15), te nowe przypadki były pochodzenia pakistańskiego, pokazując, że mutacje CIITA nie są ograniczone do jednego pochodzenia etnicznego. Siedmiu nowych pacjentów należy do grupy B i pochodzi z Afryki Północnej, Włoch, Turcji i Arabii Saudyjskiej. Łącznie, łącznie z pacjentem założycielskim BLS1, w grupie B znajdują się 22 rodziny.

czterech nowych pacjentów w trzech rodzinach, wraz z pacjentem SS (15), zalicza się do grupy D. są pochodzenia północnoafrykańskiego, tureckiego i druzyjskiego. Ich cechy kliniczne i biologiczne nie różniły się od innych pacjentów z niedoborem HLA. Jednak we wszystkich oprócz jednego można wykryć transkrypcję genów DPA i/lub DPB. U pacjentów z ABI (16) odnotowano również transkrypcję resztkową DPA i DPB. U pacjentów badanych w tej pracy, pomimo obecności transkryptów DP, dojrzałych heterodimerów dpa-β nie wykryto na powierzchni komórki, być może dlatego, że geny Ii I DM nie ulegają ekspresji. W związku z tym nie należy oczekiwać żadnych konsekwencji funkcjonalnych z tego wycieku w defekcie, co rzeczywiście obserwuje się In vivo.

trzy różne linie dowodów wskazują, że ci pacjenci należą do grupy D, tj. analiza fuzji komórek somatycznych, transfekcja komórek pacjentów za pomocą RFXAP cDNA i analiza mutacyjna. Jednoznaczne wyniki fuzji komórek uzyskano stosując zarówno fibroblasty, jak i linie limfocytów B, jak wykazano u pacjenta ZM. Brak uzupełnienia między komórkami ZM a linią komórkową 6.1.6 B, z jednej strony, oraz między fibroblastami zm I SS, z drugiej strony, potwierdził wszystkie inne dane dotyczące syntezy, w tym dane dotyczące fibroblastów ABI. Wcześniejsze błędne zaklasyfikowanie tego pacjenta do grupy ” E ” (16) było prawdopodobnie spowodowane nieszczelnością linii komórkowej 6.1.6 używanej i/lub eksperymentami fuzji przeprowadzanymi na liniach komórkowych (Fuzje komórek B-fibroblastów). Pełna korekta ekspresji HLA klasy II w komórkach z grupy D, a nie z innych grup, przez transfekcję cDNA RFXAP potwierdziła wcześniej zgłoszone dane z doświadczeń transfekcji przejściowej (10,17). Stwierdzono, że cDNA RFXAP ulegało mutacji u pacjentów z SS, AKO, SH i ShG, jak również wcześniej wykazano dla ZM i ABI (17).

stwierdzono trzy rodzaje powtarzających się mutacji RFXAP, tj. substytucję, delecję i insercję (Fig. 8). Bardzo wysoka zawartość CG w genie RFXAP prowadząca do błędów polimerazy może stanowić przyczynę powstawania tych mutacji (20). Przejście C279X wykryte u pacjenta AKO jest identyczne z mutacją wcześniej wykrytą u pacjenta ABI (17), a mutacja 484delg u pacjenta SS jest identyczna z mutacją wykrytą u pacjentów DA i ZM (10,17). W obu przypadkach przewiduje się, że mutacje spowodują przesunięcie ramki i syntezę poważnie obciętych białek odpowiednio 52 i 136 aminokwasów. W Sh znaleziono wcześniej nieodkrytą mutację, tj. insercję zduplikowanych nukleotydów 144-150: “GCGGGCC”. Mutacja ta powoduje również przesunięcie ramki i obcięty produkt. Wszystkie mutacje wykryto w obrębie regionu obejmującego nukleotydy 116-540 cDNA RFXAP, które odpowiadają pojedynczemu egzonowi.

w związku z tym do tej pory zaobserwowano tylko trzy różne mutacje genu RFXAP w sześciu różnych rodzinach, w tym pacjentów DA (10). Pochodzenie etniczne rodzin może wskazywać na pochodzenie przodków tych mutacji, ponieważ pacjenci SS, RA i ZM są pochodzenia północnoafrykańskiego, podczas gdy pacjenci AKO i ABI są pochodzenia tureckiego. Co ciekawe, tylko w grupie D niedoboru MHC klasy II wykryto do tej pory takie powtarzające się mutacje. Na przykład w grupie a, pomimo wysokiej częstości występowania u pacjentów pochodzenia hiszpańskiego (15), nie wykryto nawracających alleli u różnych pacjentów (8, oraz B. Lisowska-Grospierre i in., niepublikowane). We wszystkich grupach pacjentów większość pacjentów pochodzi z rejonu Morza Śródziemnego, gdzie często dochodzi do zawierania małżeństw małżeńskich.

dlaczego mutacje genu RFXAP, prawdopodobnie prowadzące do niefunkcjonalnych białek, są związane z resztkową transkrypcją genu DPA / B, nie jest zrozumiałe. Ta obserwacja dostarcza dowodów na ograniczoną, ale znaczącą dyskoordynację regulacji transkrypcji genów MHC klasy II. Wyniki te wymagają dalszych badań w celu określenia domniemanej specyficznej roli RFXAP w transkrypcji dra/B, DQA/B w porównaniu z transkrypcją DPA / B.

materiały i metody

pacjenci

badano trzynastu dotychczas nieopisanych pacjentów z jedenastu niepowiązanych rodzin dotkniętych niedoborem odporności MHC klasy II. 11 rodzin było spokrewnionych. Były pochodzenia północnoafrykańskiego (trzy), włoskiego (dwa), tureckiego (trzy), druzyjskiego (dwa), pakistańskiego (dwa) i saudyjskiego (jeden). U wszystkich pacjentów antygeny klasy II HLA były niewykrywalne na powierzchni komórek B, monocytów i aktywowanych komórek T. Stan kliniczny u wszystkich charakteryzował się nawracającymi infekcjami, ciężką biegunką i niepowodzeniem w rozwoju. Brak odpowiedzi humoralnej i komórkowej specyficznej dla antygenu obserwowano u wszystkich pacjentów, a hipogammaglobulina-u kilku pacjentów. W tym raporcie opisano szczegółowe badania na komórkach pacjentów, AkO, ShA, ShG, ZM. Dla ZM wyniki cząstkowe przedstawiono wcześniej (17). Pacjent SS został już opisany (15). Opisano już charakterystykę ABI pacjenta, włączoną do eksperymentów z uzupełnianiem somatycznym (16).

hodowla komórek

linie komórek B zostały ustalone z komórek B pacjentów przez zakażenie wirusem Epsteina-Barr (EBV). Fibroblasty skóry pacjentów otrzymywano w drodze biopsji skóry i przekształcano za pomocą SV40, jak opisano wcześniej (15). Wszystkie linie komórkowe hodowano w temperaturze 37°C w 5% CO2 w Rpmi-1640 (Gibco BRL Lifesciences) z dodatkiem 20% inaktywowanej Cieplnie surowicy płodu cielęcego. Fibroblasty lub ich heterokariony leczono IFN-γ (200 J. M. / ml) przez 40 godzin przed analizą ekspresji MHC klasy II.

Immunofluorescencja

przeciwciała anty-HLA-DR 20,6 (21), anty-Klasa II Bu27 (miejsce wiązania, Birmingham, Wielka Brytania) i anty-klasa i przeciwciała W6/32 (Serwalab). Komórki B barwiono w zawiesinie, podczas gdy fibroblasty utrwalano etanolem przed inkubacją z przeciwciałami, jak opisano (15). Zawiesiny komórkowe analizowano cytofluorometrem Becktona Dickinsona, a stałe komórki mikroskopem Leitza Ortoplana.

somatyczna analiza uzupełniania

fibroblastów i linii komórek B od nowo założonych pacjentów, a także eksperymentalnych linii komórkowych (HVJ, ABL, SJO i 6.1.6.) od pacjentów wcześniej zaklasyfikowanych do grup uzupełniających odpowiednio A, B, C i D stosowano w tych eksperymentach. Linia komórkowa 6.1.6 była w pełni negatywnym wariantem MHC klasy II, opracowanym przez C. Alcaide (Institut Pasteur). Ponadto eksperymenty termojądrowe obejmowały: linia komórek SS pacjenta, reprezentująca przypuszczalną grupę uzupełniającą X (15), oraz linia komórek ABI pacjenta, zgłoszona do reprezentowania grupy E (16), uprzejmie przedstawiona przez P. van den Elsena. Przemijające heterokariony obu typów komórek, limfocytów B i fibroblastów uzyskano metodą elektrofuzji opisaną szczegółowo wcześniej (15). Rewersja fenotypowa była testowana przez immunofluorescencję lub przez northern blot 48-72 h po fuzji komórek. W przypadku fibroblastów komórki hodowano w obecności lub bez 200 J.M./ml rekombinowanego IFN-γ (Genex).

Transfekcje

plazmidami stosowanymi do transfekcji były pREP4 (Invitrogen), pREP4-RFXAP i EBO-SFI (wektor pusty) lub EBO-CIITA, dostarczone przez V Steimle ‘ a (8). Transfekcję linii limfocytów B i fibroblastów przeprowadzono zgodnie z opisem (22) z 1-10 µg każdego plazmidu, stosując elektropulser JOUAN GTH 128/a, jak opisano (15). Stabilne transfektanty uzyskano przez selekcję z higromycyną B (250 µg/ml; Kalbiochem). Transfekowane fibroblasty leczono 200 J. M./ml IFN-γ przed badaniem ekspresji MHC klasy II.

amplifikacja PCR i sekwencjonowanie RFXAP

pełnowymiarowych klonów cDNA RFXAP od pacjentów wyizolowano metodą RT-PCR i sklonowano do wektora pGEM – T (Promega), zgodnie ze standardowymi procedurami, i poddano analizie pod kątem mutacji. Mutacje zostały następnie potwierdzone w DNA pacjentów i ich rodziców poprzez badanie fragmentów genomowego DNA amplifikowanego PCR obejmujących nukleotydy 116-540, jak opisano (17). PCR wykonano z systemem Expand High Fidelity PCR (Boeh-Ringer Mannheim), jak opisano (10). Sekwencjonowanie rekombinowanych plazmidów przeprowadzono przy użyciu zestawu ABI PRISM dye terminator cycle sequencing kit (ABI) i sekwencera DNA Applied Biosystems. Genomowe produkty PCR sekwencjonowano bezpośrednio cyklem przy użyciu znakowanych radioizotopem starterów sekwencjonujących i zestawu termo-Sequenazy (Amersham) i analizowano na żelu sekwencjonującym.

RT-PCR wykrywanie ekspresji genów HLA klasy II, DMB, II i GADPH

całkowite cytoplazmatyczne RNA ekstrahowano z fibroblastów indukowanych IFN-γ metodą tiocyjanianu guanidium (23). Pierwszą nić cDNA zsyntetyzowano z odwrotną transkryptazą wirusa mieloblastozy ptaków(AMV) (Boehringer Manneheim, SA) przy użyciu 10 ng oligo (dT) jako startera i 5 µg cytoplazmatycznego RNA. Amplifikację PCR przeprowadzono w końcowej objętości 50 µl przy użyciu 1/30 cDNA, 1 µM każdego startera, 200 µM każdego D NTP, 1,25 IU polimerazy AmpliTaq (Perkin-Elmer, Forster City, CA) i 0,1 µCi dCTP (Amersham) w każdej próbce. DNA denaturowano w temperaturze 94 ° C przez 1 min, wyżarzano przez 1 min w temperaturze 55°C w celu wykrycia wszystkich genów z wyjątkiem GADPH i aDR, dla których zastosowano temperaturę wyżarzania 58°C. Wydłużenie w temperaturze 72°C trwało 1 min. Cykl ten powtórzono 25 razy dla GADPH i aDR i 27 razy dla innych genów, po czym następowało wydłużenie 10 minut w temperaturze 72°C. próbki poddano elektroforezie na 5% żelach akryloamidowych przy napięciu 150 V przez 2 godziny. żele utrwalano i suszono przed ekspozycją w pudełku do PhosphorImager (dynamika molekularna) lub na folii X-Omat (Kodak). Sekwencje starterów oligonukleotydowych stosowanych w amplifikacji PCR były następujące: dla HLA-aDQ, – ßDQ i DMB opisane przez Peijnenburga (16), dla łańcucha GADPH,- aDR i Ii opisane przez Vedrenne i wsp. (24) oraz dla-ßDR,- aDP i-ßDP zgodnie z opisem Haubera i wsp. (25).

skróty

skróty
• B-cell

  linia B-lymphoblastoid cell line

• IFN-γ

  interferon γ

• MHC
• RT-PCR

  reakcja łańcuchowa odwrotnej transkryptazy-polimerazy.

podziękowania

szczególnie dziękujemy Dr Peterowi van den Elsenowi za umożliwienie nam włączenia linii komórkowej ABI do eksperymentów fuzji. Jesteśmy wdzięczni Dr Andrew Cant I Mario Abinun za próbki krwi i biopsje skóry od pacjentów leczonych w ich oddziale na BMT, A dr Klaus Schwarz za przesłanie nam próbek krwi od dwóch pacjentów. Dziękujemy również Françoise Selz za współpracę ekspercką i E. Barras za doskonałą pomoc techniczną.